Name: Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a generar organoides mamarios de mosaico mediante tripsinización diferencial para estudiar células mioepiteliales y luminales. Este método preserva la integridad celular y permite investigar la biología de la glándula mamaria en cultivo 3D.

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Agradecemos a Ben Abrams por la asistencia técnica y el apoyo básico del Instituto de La Universidad de California, Santa Cruz (UCSC) para la Biología de las Células Madre (IBSC). Agradecemos a Susan Strome y Bill Saxton por el uso de su solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones a la UCSC del Instituto Médico Howard Hughes a través del programa James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study (S.R.), del NIH (NIH GM058903) para la iniciativa de maximizar el desarrollo estudiantil (H.M.) y de la NIH (NIH GM058903) para la iniciativa de maximizar el desarrollo estudiantil (H.M.) y de la NIH (NIH GM058903) para la iniciativa de maximizar el desarrollo estudiantil (H.M.) y desde la Fundación Nacional de Ciencias para una beca de investigación de posgrado (O.C. DGE 1339067) y por una beca (A18-0370) del Comité coordinador de investigación del cáncer de UC (LH).

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, Santa Cruz.
1. Día 1: Digestión de la glándula mamaria
<ol><li>Prepárese para cosechar los GM de ratones hembra maduras de 10-14 semanas de edad.<ol>
<li>Realizar la cosecha en un banco abierto en condiciones asépticas.</li>
		<li>Esterilice todos los suministros quirúrgicos, tablas de corcho y alfileres autoclavendo y empapándose en 70% de alcohol durante 20 minutos antes de la cirugía.</li>
		<li>Anestetizar animales con pentobarbital sódico (2X dosis anestésica de 0,06 mg/g de peso corporal) administrada mediante inyección intraperitoneal con una jeringa de insulina de 0,5 ml.</li>
		<li>Controle el nivel de anestesia pellizcando los dedos de los dedos de los dedos del animal para comprobar si hay una respuesta reflejo y comenzar el protocolo sólo después de que el animal esté completamente anestesiado.</li>
		<li>Coloque al animal en su espalda, pin sus apéndices en el corcho, y limpie su abdomen y pecho con etanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cosechar los #2, 3, 4 y 5 MM de un ratón (es decir, 8 MGs, Figura 1A),identificar la línea media entre las dos patas traseras y hacer una pequeña incisión (1 cm) en la piel abdominal con tijeras afiladas, luego extender el corte hasta el cuello18.</li>
	<li>Siga haciendo pequeños cortes lateralmente hacia las piernas y los brazos para permitir la liberación de la piel usando un hisopo de algodón. Tire de la piel y estírela firmemente antes de fijarla hacia abajo en un lado(Figura 1B, paso 1)18. Retire los GM cortando debajo de ellos, y retire los ganglios linfáticos de las glándulas #4(Figura 1B, pasos 2, 3)18. Repita el procedimiento en el otro lado del cuerpo.</li>
	<li>Recoger el tejido MG en 50 mL de 4 oC Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)/Nutrient Mixture F12 (F12) complementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) y 1X antibiótico-antimicótico (anti-anti)18.</li>
	<li>Picar las glándulas en un plato de 35 mm o en una placa de cerámica usando una cuchilla de afeitar o un helicóptero de tejido. Gire la placa cada cinco chuletas manuales o cada ronda en el helicóptero de tejido hasta que las piezas de tejido puedan caber a través de una punta de micropipeta de 1 ml con facilidad (0,1 mm/fragmento, Figura 1C).</li>
	<li>Digerir los GM en medio de digestión (ver Tabla 1) durante 14 h en un plato de 6 pozos de baja adherencia a 37oC, 5% CO2.</li>
</ol>2. Día 2: Aislamiento de fragmentos de tejido epitelial mamario
<ol><li>Después de 14 h de digestión, mezcle suavemente pipeteando el tejido digerido 10X usando una micropipeta de 1 ml para descomponer cualquier estroma restante o tejido adiposo, asegurando que no se generen burbujas ni exceso de fuerza mecánica. NOTA: Si hay digestión incompleta después de 14 h, esto podría deberse a la acumulación de ADN cizallado. En este caso, añadir 1 l de 1 mg/ml de desoxirribonucleasa I (DNase I) por 2 ml de medio de digestión. Incubar otros 30 min a 37oC, 5%CO2.</li>
	<li>Recoger tejido en un tubo de 15 ml y enjuagar el pozo utilizado para la digestión con 2-3 mL de cultivo tisular grado 1X dulbecco fosfato tamposo salino (DPBS) libre de Ca2+ y Mg2+. Centrífuga a 600 x g durante 10 min.</li>
	<li>Evacuar el sobrenadante que contiene la capa de lípidos y el medio, y luego resuspender el pellet en 5 ml de DPBS y cambiar a un nuevo tubo de 15 ml. Centrífuga a 600 x g durante 10 min.</li>
	<li>Durante la centrifugación coloque un colador de células de nylon de 70 m en un tubo de 50 ml y humedezca previamente el colador con 10 ml de 37 oC DMEM/F12.</li>
	<li>Resuspender fragmentos de tejido del paso de protocolo 2.4 utilizando 5 ml de DPBS y pasar la suspensión a través de un colador de células de nylon prehúmedo de 70 m para eliminar las células estromales y células individuales(Figura 1D).</li>
	<li>Recoger los fragmentos de tejido en el colador celular. Enjuagar 4X con 10 mL de 37oC DMEM/F12(Figura 1D). ADVERTENCIA: El enrredado incompleto dará lugar a cultivos contaminados con células no epiteliales.</li>
	<li>Suelte los fragmentos de tejido sosteniendo la pestaña del colador con los dedos enguantados, invirtiendo el colador sobre un plato de cultivo de tejido de 60 mm y pasando 1 ml de alícuotas del medio de mantenimiento (ver Tabla 1) a través de la parte inferior del colador 4X (Figura 1E).</li>
	<li>Compruebe el colador en busca de restos de fragmentos de tejido, que serán visibles a simple vista, y enjuague el colador 1X más con 1 ml de medio de mantenimiento si algún fragmento todavía se adhiere al colador. Los fragmentos de tejido enjuagado ahora deben estar libres de células estromales.</li>
	<li>Examine rápidamente la placa de 60 mm que contiene los fragmentos MG del paso de protocolo 2.9 bajo un microscopio invertido (objetivo 4X o 10X, Figura 1F). Una preparación típica de ocho GM produce 500 fragmentos de euros. Busque células individuales o gotas de grasa y si hay células contaminantes. NOTA: Si hay células contaminantes, repita el paso de filtración recogiendo el medio y los fragmentos de la placa de 60 mm utilizando una pipeta de 5 ml y filtrando el fragmento de nuevo a través de un nuevo colador de 70 m, repitiendo los pasos del protocolo 2.6, 2.8-2.10.</li>
	<li>Incubar 24 h a 37oC, 5%CO2,permitiendo que el fragmento de tejido se adhiera y genere fragmentos bicapados(Figura 2A). NOTA:Si los fragmentos no se han liquidado antes de 24 h, continúe incubando hasta que se adhieran. Si los fragmentos no se adhieren bien, la separación de los compartimentos de la celda no funcionará. Si los investigadores están preocupados por la adhesión, las placas de cultivo de tejido se pueden tratar para promover la unión de fragmentos (por ejemplo, poli-L-lisina).</li>
</ol>3. Día 3: Trippsinización diferencial de células mioepiteliales y epiteliales luministras
<ol><li>Para separar los MyoEC de los LECs, vacíe el medio del plato, enjuague 1x con 1 ml de DPBS y agregue 1 ml de trippsina fresca-EDTA (0,05%), y monitoree cuidadosamente la digestión bajo un microscopio invertido (objetivo 10X o 20X, Figura 2B,C,F). El desprendimiento de la capa externa de MyoEC requerirá 3-6 min, dependiendo de la trippsina-EDTA (0,05%) Fuerza. NOTA: Consulte la Figura 2 para ver las imágenes representativas que muestran este proceso. Bajo iluminación de campo brillante, los MyoECs aparecen redondeados y tienen un aspecto más brillante en comparación con los LEC, que permanecen adheridos en el centro y aparecen más oscuros.</li>
	<li>Recoger la fracción MyoEC en un tubo de 15 ml que contenga 2 ml 10% FBS/DPBS. Sin molestar a los LEC, enjuague suavemente el plato de 60 mm con 2 ml de DPBS y luego deseche el DPBS(Figura 2H-I). NOTA: La recuperación habitual para los MyoECs está dentro de un rango de (3,5 x 106-1,5 x 106) dependiendo del tamaño de los GM.</li>
	<li>Para eliminar la fracción LEC, agregue 1 ml de trippsina-EDTA (0,05%) al plato de nuevo e incubar 7-15 min, monitoreando cuidadosamente para prevenir la sobredigestión. Aquench la trippsina-EDTA (0,05%) en el plato con 2 mL de 10% FBS/DPBS. Recoja la fracción LEC en un nuevo tubo de 15 ml. NOTA: La recuperación habitual de los LEC está dentro de un rango (2 x 106-4.2 x 106) dependiendo del tamaño de los GM. Rutinariamente, la pureza de ambas fracciones como se ensaya por la inmunohistoquímica es de 90%19 (Figura 2E).</li>
	<li>Centrifugar cada fracción durante 5 min a 300 x g para eliminar la trippsina-EDTA (0,05%). Resuspenda el pellet en 250 ml de medio de mantenimiento y cuente cada población celular usando un hemocitómetro o contador de células automatizado. Coloque las células en hielo mientras cuenta. NOTA: Si se desea la manipulación genética de las fracciones celulares, las células primarias pueden cultivarse en platos de baja adhesión e infectarse con lentivirus20.</li>
</ol>4. Día 3: Combinación e incrustación de fracciones celulares en una matriz extracelular
NOTA: Una vez que las fracciones MyoEC y LEC se han recopilado y contado, se pueden combinar. La relación típica de MyoEC/LEC es 1:3(Figura 3A)19. Se pueden realizar diferentes estudios. Por ejemplo, para realizar estudios de mosaico, se pueden generar fracciones a partir de ratones de tipo salvaje (WT) y mutantes (Mut) y combinarse (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, o fracciones se pueden combinar utilizando diferentes proporciones de MyoECs/LECs19.
<ol><li>En función del recuento de celdas, calcule el número de pozos (8 cámaras de pozos, véase Tabla de materiales)que deben prepararse para 12.000 celdas/pozos (por ejemplo, 3.000 MIC:9.000 LEC).</li>
	<li>Establezca la capa base para el cultivo 3D añadiendo 90 ml de 50% de ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, sin rojo fenol - ver la Tabla de Materiales)a cada poca. Asegúrese de que no haya burbujas y que los pozos estén recubiertos uniformemente. Para solidificar la capa base, incubar las diapositivas a 37oC, 5%CO2 durante 30 min. NOTA: El ECM debe mantenerse helado hasta este paso, de lo contrario se polimerizará prematuramente y conducirá a un recubrimiento base y polimerización desiguales. El uso de un ECM base mejora el crecimiento organoide en un solo plano, lo que ayuda a la captura de imágenes. Esto también obtiene un crecimiento organoide más rápido y utiliza menos ECM22.</li>
	<li>Durante la polimerización, prepare las mezclas celulares. Pellet las fracciones MyoEC y LEC a 300 x g durante 5 min y resuspende cada fracción de célula en 10% ECM/90% Medio de Crecimiento para que cada pozo tenga 100 l (ver Tabla 1 para saber cómo hacer Medio de Crecimiento). NOTA: Para facilitar la preparación, replique los pozos utilizando las mismas mezclas celulares. Estos se pueden combinar y preparar en un tubo (por ejemplo, cuatro pozos de la misma mezcla celular se pueden preparar en 400 l de 10% ECM/90% medio de crecimiento).</li>
	<li>Añadir 100 l de cada mezcla celular en 10% ECM/90% Medio de crecimiento a cada poca y permitir que los organoides se asienten durante 20 min a 37 oC, 5% CO2.</li>
	<li>Una vez que las células se hayan asentado, agregue suavemente 100 s de medio de crecimiento pipeteando suavemente la pared de la cámara de cada poca. Incubar las diapositivas a 37oC, 5% CO2 (ver Figura 3A para la composición total de cada pociembre). NOTA: El inhibidor de Rho Kinase, R-spondin y Nrg1 son factores que han sido identificados como importantes para el cultivo a largo plazo de organoides cultivados a partir de células mamarias murinas primarias y células de cáncer de mama humano13,14. Además, los factores de células madre B27 y N2 extienden el tiempo que se pueden cultivar organoides.</li>
	<li>Las celdas de la imagen cada 24 h para realizar un seguimiento de su crecimiento y renovar suavemente el Medio de Crecimiento cada 2-3 días usando 100 l/bien(Figura 3B-E). NOTA: Tenga mucho cuidado al renovar el medio. Incline las diapositivas de la cámara para recoger el medio en una esquina de los pozos. Retire los 100 s del medio y reponga con cuidado para dejar la capa de ECM intacta.</li>
	<li>Si los investigadores están interesados en investigar la lactancia/alveologénesis, cambie al medio de alveologénesis (véase el cuadro 1) el día 5 y continúe renovando el medio cada 2-3 días hasta el día 10(Figura 3F)o más allá mediante el paso mediante la solución de recuperación (véase la Tabla de Materiales)13. NOTA: En este punto, los organoides se pueden aislar del ECM incubando a 4 oC en 400 oC de solución de recuperación de 4 oC (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el protocolo y el reactivo).</li>
</ol>5. Día 5 o 10: Fijación e inmunostainción de organoides
<ol><li>Retire el medio cuidadosamente pipeteando suavemente el medio (una pipeta de bombilla funciona mejor). Enjuague cada pocal con 200 ml de 1 salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS, ver recetas).</li>
	<li>Fijar los organoides usando frío (4 oC) 4% (p/v) paraformaldehído (PFA, ver recetas) durante 10 min a temperatura ambiente. ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa. Use equipo de protección personal (abrigo de laboratorio, guantes y gafas de seguridad). Este paso debe realizarse dentro de una campana de humos. NOTA: El ECM se disuelve mediante el tratamiento con PFA. La eliminación incompleta de ECM puede conducir a la tinción de fondo cuando los organoides son analizados por inmunofluorescencia.</li>
	<li>Retire el 4% de PFA y añada 200 ml de glicina/DPBS al 4% (véase la Tabla 1)a cada pocal. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos o 4 oC durante la noche en una superficie de balanceo en un ajuste lento. NOTA: Los organoides se pueden almacenar durante 1-3 días en DPBS a 4 oC antes del siguiente paso.</li>
	<li>Permeabilizar los organoides utilizando DPBS + 0.25% Triton X-100 (PBST, ver Tabla 1) durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Bloquear los organoides usando un 5% de suero de burro (DS) (u otro suero que coincida con las especies del anticuerpo secundario) en DPBS durante 1 h en una superficie de balanceo. NOTA: Este paso se puede realizar durante la noche a 4 oC sobre una superficie de balanceo.</li>
	<li>Preparar anticuerpos primarios en 1% DS/DPBS. Utilice 125-200 l para cada pocto. Realizar inmunomanchas incubando los organoides en anticuerpos primarios durante la noche a 4oC sobre una superficie mecedora.</li>
</ol>6. Día 11: Inmunofluorescencia completa
<ol><li>Lavar cada poca tope 2 veces con 200 s de PBST durante 5 min. Añadir anticuerpo secundario en 1% DS/DPBS usando 125-200 l para cada poc. Incubar a temperatura ambiente sobre una superficie de balanceo durante 45 min.</li>
	<li>Lave cada poca 2 veces con 200 PBST por poca.</li>
	<li>Mancha los núcleos utilizando el tinte de ADN Hoechst en DPBS (1:2,000 en DPBS) durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire todo el líquido que queda en el pozo succionar suavemente con un vacío.</li>
	<li>Retire cuidadosamente las cámaras y la junta, coloque una gota (30 l) de los medios de montaje (ver Tabla de materiales)en cada pocal y cubra, teniendo cuidado de eliminar las burbujas. Deje que la diapositiva se seque en un espacio oscuro durante 1-2 días. Selle con esmalte de uñas transparente. Imagen de los organoides en un microscopio confocal(Figura 3E-F).</li>
</ol>

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<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6 (9), e25661(2011).</li>
<li>Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e50011(2013).</li>
<li>Marlow, R., Dontu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+breast+cancer+bone+metastatic+niche+in+complex+three-dimensional+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).</li>
<li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se presenta un método que detalla cómo los investigadores pueden generar cultivos organoides 3D utilizando células MG primarias. La diferencia entre este y otros protocolos es que detallamos un método para separar los dos compartimentos celulares MG distintos: los Miciscos basales externos y los LEC internos. Nuestro método emplea una trippsina-EDTA de dos pasos (0,05%) tratamiento que llamamos trippsinización diferencial19. Este procedimiento permite a los investigadores aislar MyoEC y LECs...

La glándula mamaria (MG) es una estructura epitelial tubular similar a un árbol incrustada dentro de un estroma rico en adipocitos. El epitelio ductal bicapado comprende una capa externa basal de células contráctil, mioepiteliales (MyoEC) y una capa interna de células epiteliales luminarias y secretoras (LEC), que rodea un lumen central1. Durante la lactancia cuando los MyoECexternos externos se contraen para exprimir la leche de los LEC alveolares internos, la MG sufre numerosos cambios que están bajo el control de factores de crecimiento (por ejemplo, EGF y FGF) y hormonas (por ejemplo, progesterona, insulina y prolactina). Estos cambios causan la diferenciación de las estructuras especializadas, alvéolos, que sintetizan y secretan la leche durante la lactancia1. La epitelía mamaria puede ser manipulada experimentalmente utilizando técnicas en las que los fragmentos de tejido epitelial, las células o incluso una sola célula basal se trasplantan en almohadillas de grasa mamaria del huésped, precleares del parénquima mamario endógeno, y se les permite crecer para reconstituir un árbol epitelial completo y funcional2,,3,4,5. El trasplante es una técnica poderosa, pero es lenta e imposible si una mutación resulta en una letalidad embrionaria temprana (antes de E14) que evita el rescate del anlage mamario trasplanible. Además, los investigadores con frecuencia desean investigar las funciones de los dos compartimentos diferentes, que se derivan de células progenitoras restringidas al linaje. Si bien la tecnología Cre-lox permite la manipulación genética diferencial de myoECs y LECs, también es una tarea costosa y que consume mucho tiempo. Así, desde la década de 1950, los investigadores han utilizado organoides mamarios in vitro como una manera relativamente fácil y eficiente de abordar cuestiones relativas a la estructura y función del tejido mamario6,7.
En los primeros protocolos que describen el aislamiento y el cultivo de células epiteliales mamarias primarias, los investigadores encontraron que se requería una matriz de membrana de sótano (BME), compuesta por un coágulo plasmático y extracto de embrión de pollo, para los fragmentos de MG cultivados en un plato6. En las décadas siguientes, se desarrollaron matrices extracelulares (ECM, colágeno y matriz proteica gelatinosa secretada por células de sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm) para facilitar el cultivo 3D e imitar mejor el entorno in vivo7,,8,9,10. Células de cultivo en matrices 3D reveladas por múltiples criterios (morfología, expresión génica y capacidad de respuesta hormonal) que tal microambiente modela mejor los procesos fisiológicos vivos9,10,11,12. La investigación utilizando células murinas primarias identificó factores clave de crecimiento y morógenos necesarios para el mantenimiento extendido y la diferenciación de organoides13. Estos estudios han establecido el escenario para el protocolo presentado aquí, y para el cultivo de células mamarias humanas como organoides 3D, que ahora es una herramienta clínica moderna, lo que permite el descubrimiento de fármacos y pruebas de drogas en muestras de pacientes14. En general, el cultivo organoide retocomodo pone de relieve las capacidades de autoorganización de las células primarias y sus contribuciones a la morfogénesis y diferenciación.
Presentado aquí es un protocolo para el cultivo de la epitelia murina que se puede diferenciar en acini productor de leche. Se utiliza una técnica de tripinización diferencial para aislar los MyoECs y LEC que componen los dos compartimentos celulares MG distintos. Estas fracciones celulares separadas pueden ser manipuladas genéticamente para sobreexpresar o derribar la función genética. Debido a que el linaje-intrínseco, la autoorganización es una propiedad innata de las células epiteliales mamarias15,16,17, la recombinación de estas fracciones celulares permite a los investigadores generar bicapas, organoides de mosaico. Comenzamos digiriendo enzimáticamente el tejido adiposo, y luego incubando los fragmentos mamarios en un plato de cultivo de tejido durante 24 h(Figura 1). Los fragmentos de tejido se asientan sobre platos de poliestireno como fragmentos bicapados con su organización in vivo: capa mioepitelial exterior que rodea las capas luminales internas. Esta organización celular permite el aislamiento de los MyoECexternos externos por trippsina-EDTA (0,05%) tratamiento durante 3-6 min seguido de una segunda ronda de trypsin-EDTA (0,05%) tratamiento que separa los LEC internos restantes(Figura 2). Por lo tanto, estos tipos de células con diferente sensibilidad a la trippsina se aíslan y posteriormente se pueden mezclar y chapar en ECM(Figura 3). Las células se someten a una autoorganización para formar esferas bicapas, que comprenden una capa externa de Micmy que rodean los LEC internos. La formación de lúmenes se produce a medida que las células crecen en un medio que contiene un cóctel de factores de crecimiento (ver recetas para el medio de crecimiento)13. Después de 5 días, los organoides se pueden diferenciar en acini productores de leche cambiando a Medio de Alveologénesis (ver recetas y Figura 3F)e incubados durante otros 5 días. Alternativamente, los organoides continuarán expandiéndose y ramificándose en el Medio de Crecimiento durante al menos 10 días. Los organoides pueden analizarse utilizando inmunofluorescencia(Figura 3D-F)o liberarse del ECM utilizando una solución de recuperación (ver Tabla de Materiales)y analizarse a través de otros métodos (por ejemplo, inmunoblot, RT-qPCR).

<table><tbody><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de alta claridad de 15 ml (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>placa de fijación ultrabaja de 24 pocillos (Corning)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3473-24EA 35</td><td></td></tr><tr><td>mm Placa de cultivo celular de estilo fácil agarre con tratamiento TC (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de alta claridad de 50 ml (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>Placa de cultivo celular de estilo fácil agarre con tratamiento TC de 60 mm (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific 353004</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; M colador de células de nylon (Corning)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Pen/Strep también funciona</td></tr><tr><td>suplemento de B27 sin vitamina A (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>ratones B6 ACTb-EGFP</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringa de insulina 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>Clase 2 Dispasa (Roche)</td><td>Millipore Sigma</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Clase 3 Colagenasa</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>LS004206</td><td></td></tr><tr><td>Corning Solución de recuperación celular</td><td>Fisher Scientific 354253</td><td></td><td>Siga las pautas de uso &ndash; Extracción de estructuras tridimensionales de Corning Matrigel Matrix</td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, sin rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>DNasa (Desoxirribonucleasa I)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Cabra 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21447</td><td>Uso a 1:500, Lote: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864</td></tr><tr><td>Burro anti-Ratón 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-606-150</td><td>Uso a 1:1000, Lote: 140554, stock 1.4 mg/mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de DulbeccoThermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14190-250</td><td>sin Mg2+/Ca2+</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF-100-15-100ug</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>VWR</td><td>97068&ndash; 085</td><td>100% Origen estadounidense, grado premium, Lote: 059B18</td></tr><tr><td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td><td>Fisher Scientific</td><td>0100-01</td><td>Referido como medios de montaje en el texto</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-WAP</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-14832</td><td>Uso a 1:250, Lote: J1011, stock 200 y micro; g/mL, RRID:AB_677601</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AnaSpec</td><td>AS-83218</td><td>Uso 1:2000, el stock es de 20mM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6634-100mg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>KRT14&ndash; CreERtam</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5107</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Factor de Crecimiento Reducido (GFR); Libre de fenol rojo; 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td>Lote: 8204010, concentración de stock 8,9 mg/mL</td></tr><tr><td>MillexGV Unidad de filtro 0,22 y micro; m</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ SLIDE de 8 pocillos de vidrio, estéril</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td>Estas correderas de cámara son excelentes para la extracción de juntas, pero otras marcas pueden funcionar bien (por ejemplo, Lab Tek II).</td></tr><tr><td>Ratón anti-SMA</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2547</td><td>Uso a 1:500, Lote: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701</td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Nrg1</td><td>R& D</td><td>5898-NR-050</td><td></td></tr><tr><td>Programa Nacional de Hormonas y Péptidos</td> de<td>Prolactina Pituitaria Ovina</td><td>Comprado al Dr. Parlow en el Instituto de Investigación y Educación de Harbor-UCLA</td>Paraformaldahído Millipore Sigma PX0055-3 Pentobarbital Millipore Sigma P3761 R26R-EYFP El Laboratorio Jackson 6148 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de Rho Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>R-espondina</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro filtrado estéril</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro filtrado estéril</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>x100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA de grado de laboratorio 0.05%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Los organoides ofrecen estructuras de tejido tridimensionales autoorganizadas que recapitulan los procesos fisiológicos en la comodidad de un plato. La glándula mamaria murina se compone de dos compartimentos celulares epiteliales distintos, que cumplen diferentes funciones: el compartimento mioepitelial externo y contractilo y el compartimento luminal interior y secretor. Aquí, describimos un método por el cual las células que componen estos compartimentos se aíslan y luego se combinan para investigar sus contribuciones individuales de linaje a la morfogénesis y diferenciación de la glándula mamaria. El método es simple y eficiente y no requiere tecnologías de separación sofisticadas como la clasificación celular activada por fluorescencia. En su lugar, cosechamos y digerimos enzimáticamente el tejido, sembramos el epitelio en platos de cultivo de tejidoadherente, y luego usamos trippsinización diferencial para separar el mioepitelial de las células luminales con una pureza del 90 %. Las células se platean en una matriz extracelular donde se organizan en organoides bicapados tridimensionales (3D) que se pueden diferenciar para producir leche después de 10 días en cultivo. Para probar los efectos de las mutaciones genéticas, las células se pueden cosechar a partir de modelos de ratón de tipo salvaje o genéticamente diseñados, o pueden ser manipuladas genéticamente antes del cultivo 3D. Esta técnica se puede utilizar para generar organoides de mosaico que permiten la investigación de la función génica específicamente en el compartimento luminal o mioepitelial.

El protocolo presentado aquí describe un método para investigar las contribuciones específicas del linaje de las células epiteliales mamarias mediante el uso de organoides de mosaico. Para obtener células murinas primarias para organoides, el epitelio de la glándula mamaria primero debe aislarse del estroma rico en adipocitos circundantes(Figura 1). Este proceso se describe brevemente aquí y también se describe en un estudio publicado anteriormente<sup class=...

La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Nuestro método es significativo porque permite a los investigadores aislar y manipular diferentes tipos de células para la investigación de sus contribuciones individuales de linaje a la forma y función del tejido. Esta técnica es un método suave y eficaz para separar los tipos de celda y, como resultado, la integridad de las celdas se conserva para el cultivo 3D. Esta técnica también se puede aplicar a otros sistemas para aislar células que no tienen biomarcadores bien caracterizados.Para cosechar las glándulas mamarias número dos, tres, cuatro y cinco de un ratón hembra de 10 a 14 semanas de edad, primero haga una incisión de un centímetro en la línea media entre las dos extremidades posteriores. Extienda el corte hasta el cuello y haga pequeños cortes laterales desde la incisión de la línea media hacia las extremidades. Luego estira la piel enseñada antes de asegurarla con un alfiler a cada lado del animal.Usando fórceps, recoge los ganglios linfáticos de las glándulas número cuatro. Para eliminar las glándulas mamarias, utilice tijeras afiladas para cortar debajo de cada región de tejido, colocando los tejidos en 50 mililitros de cuatro grados Celsius DMEM-F12 complementados co

generation-of-mosaic-mammary-organoids-by-differential-trypsinization

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Cultivo de células primarias de tejido intacto utilizando organoides proporciona un sistema modelo que imita el microambiente multi-celular in vivo. Desarrollamos un modelo de cultivo libre de suero primaria tejido epitelio de mama que perpetúa los linajes de cultivo de células mixtas y exposiciones morfología diferenciados, sin interrupción tejido enzimática. Organoides mamarios permanecen viables durante&gt; 6 meses.

No enzimática, libre de suero Cultivo de Tejidos de lesiones de mama pre-invasivas para la generación espontánea de mammospheres

Este protocolo describe métodos para purificar, cuantificar y caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exosomas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales y para usarlas para transferir la capacidad de formación de glándulas mamarias a células epiteliales mamarias luminales. Los EVs / exosomas derivados de células epiteliales mamarias de tipo tallo pueden transferir esta propiedad celular a células que ingieren los EVs / exosomas.

Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

Disponibilidad de SCs somáticas es crucial para la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y para profundizar en las propiedades de la SC. Aquí presentamos estrategias experimentales para reprogramar, in vitro, adultos células diferenciadas en sus correspondientes celdas extensibles progenitoras específicas de tejido por la expresión transitoria de la sola coactivador transcripcional YAP.

De Novo Generación de células somáticas por YAP/TAZ

Los organoides desarrollados a partir de glándulas mamarias de ratones fueron irradiados y caracterizados para evaluar rasgos epiteliales e interacciones con las células inmunitarias. Los organoides irradiados se pueden utilizar para evaluar mejor las interacciones de células celulares que pueden conducir al reclutamiento de células tumorales en tejido normal irradiado.

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

Este protocolo discute un enfoque para generar organoides epiteliales a partir de tejido mamario primario normal y tumoral a través de centrifugación diferencial. Además, se incluyen instrucciones para el cultivo tridimensional, así como imágenes inmunofluorescentes de organoides incrustados.

Generación y obtención de imágenes de organoides epiteliales humanos y de ratón a partir de tejido mamario normal y tumoral sin pasar

Aquí se proporciona un protocolo detallado para establecer organoides mamarios humanos a partir de resecciones de tumores de mama derivados de pacientes o tejido mamario normal. El protocolo proporciona instrucciones completas paso a paso para el cultivo, la congelación y la descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes humanos.

Establecimiento y cultivo de organoides mamarios derivados de pacientes

Este protocolo detalla el desarrollo de modelos de ratón de carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir de la derivación de organoides de trompas de Falopio murinos, su modificación genética para recapitular la genética HGSOC humana y su introducción en la bolsa ovárica de ratones singénicos para el desarrollo in vivo de tumores.

Desarrollo de líneas de organoides derivados de ratones a partir de células epiteliales de trompas de Falopio para el modelado de carcinoma de ovario seroso de alto grado

Este protocolo describe un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos que recapitulan características clave de la morfogénesis mamaria en un sistema de cultivo tridimensional controlado.

Un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos tridimensionales que recapitulan la morfogénesis mamaria

El objetivo de este estudio es demostrar cómo se puede utilizar la estrategia de transgénesis en mosaico en pez cebra para evaluar rápida y eficientemente las contribuciones relativas de múltiples oncogenes en la iniciación y progresión tumoral in vivo.

Mosaico de pez cebra transgénesis de Análisis Genómica Funcional de candidatos genes cooperativos en la patogénesis del tumor

Aprende a generar organoides mamarios de mosaico mediante tripsinización diferencial para estudiar células mioepiteliales y luminales. Este método preserva la integridad celular y permite investigar la biología de la glándula mamaria en cultivo 3D.

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

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