Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield

Este método proporciona una manera de cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval. También permite la evaluación de los efectos de la manipulación genética y farmacológica en el crecimiento y desarrollo hepático. Esta técnica proporciona una forma rápida y precisa de visualizar y medir el hígado, así como el intestino y el páncreas.

Además de cuantificar el tamaño del hígado, este método de disección puede ser útil para preparar el hígado, el intestino y el páncreas para la hibridación in situ o imágenes confocales. Antes de intentar desfalar en larvas experimentales, asegúrate de haber pasado mucho tiempo practicando en muestras no experimentales y tener una tasa de éxito significativa. Es fundamental visualizar la orientación y el movimiento adecuados de las larvas y fórceps de peces cebra para eliminar la piel sin perturbar los órganos circundantes.

A los tres a siete días después de la fertilización, después de eutanasiar larvas, utilice una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta para recoger hasta 15 larvas en un tubo de dos mililitros. Lave las larvas dos veces con un mililitro de PBS frío 1X sobre hielo. Retire tanto PBS como sea posible usando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta y agregue un mililitro de PFA frío de cuatro por ciento en PBS.

Incubar a cuatro grados centígrados al menos durante la noche con un suave balanceo. Con una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta, retire el PFA del tubo y enjuague tres veces con un mililitro de PBS frío. Mece durante cinco minutos entre enjuagues.

Pipetear varias larvas en PBS en un pozo de nueve pozos de plato de vidrio de fondo redondo. Bajo un microscopio, retire la piel que rodea el hígado usando fórceps finos para sostener una larva en su espalda, agarrándose a cada lado de la cabeza tan suavemente como sea posible. Luego usa fórceps muy finos en la otra mano para agarrar la piel justo sobre el corazón.

Tire de la piel hacia abajo diagonalmente hacia la cola del pescado en la parte inferior del plato en el lado izquierdo o derecho del pescado. Repita para el otro lado. Continúe agarrando aletas de piel y tirando hacia abajo hasta que toda la piel y los melanoforos que se extienden o cerca del hígado hayan sido eliminados.

Si la yema está presente durante cinco a seis días después de la fertilización, levante la yema en una sola pieza sosteniendo el pez con fórceps finos en su espalda y usando los fórceps muy finos para prodear suavemente la yema. Para tres a cuatro larvas de DPF, sostenga el pez con fórceps finos en su espalda y use los fórceps muy finos para acariciar la yema a partir del lado ventral. Raspa la yema en pedazos.

Coloque las larvas diseccionadas en PBS fresco y frío en un tubo de dos mililitros utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta. Para montar las larvas, vierta unos mililitros de tres por ciento de metilcelulosa en la tapa de la placa limpia y plástica de Petri. Utilice una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta para añadir larvas a la metilcelulosa, añadiendo el menor PBS con las larvas como sea posible.

Bajo un microscopio diseccionando con un aumento bajo, utilice fórceps finos para orientar a los peces de modo que estén acostados en su lado derecho mirando hacia la izquierda. Confirme que el pez a fotografiar está perfectamente alineado con un ojo directamente encima del otro ojo. Si la cola del pez está doblada, retire la cola pellizcándola con fuerza con fórceps para retirarla de modo que el pez quede plano.

Acércate a un aumento alto y concéntrate en el hígado, asegurándote de que el contorno del hígado sea claramente visible. Pulse el botón Capturar imagen para ajustar una imagen y guardar el archivo. Repita el proceso para todos los peces, asegurándose de que el aumento sea el mismo para cada imagen.

Tome una foto de un micrómetro usando el mismo aumento. Para utilizar el programa R para cegar todas las imágenes hepáticas para evitar posibles sesgos de investigador y promover el rigor científico, cambiar el nombre de los archivos al azar y crear un archivo de aleatorización que contiene una lista de los nombres de archivo originales y los nombres de archivo cegados correspondientes. Abra los archivos aleatorios en orden, empezando por el archivo uno.

Elija la herramienta Selecciones a mano alzada y delinee cada hígado. Presione Control-M para medir el área de cada hígado. Para cualquier hígado que no se pueda medir con precisión porque tienen piel residual, yema, están fuera de foco, o no están intactos, inserte una medida de marcador de posición.

Guarde las medidas en un archivo de texto. Para desabromar y analizar datos, abra el archivo de mediciones y el archivo de aleatorización en un programa de hoja de cálculo. Inserte una nueva columna en el archivo de medidas y agregue los nombres de archivo originales para los archivos ciegos mediante el archivo de aleatorización.

Guarde este archivo como el archivo De medidas sin ciegos. Ordene los datos por el nombre de archivo original. Excluir cualquier medida hepática para la que las imágenes no fueran adecuadas.

Si es necesario, convierta los valores de medición en la escala deseada en milímetros cuadrados. Abra la barra Escala en el software de procesamiento de imágenes. Utilice la herramienta Línea recta para medir un milímetro en la barra de escala.

El software de procesamiento de imágenes mide en las mismas unidades que los hígados, dando un factor de conversión. Utilice el factor de conversión para convertir medidas en el archivo Mediciones no ciegas. Determine la media y la desviación estándar y calcule los valores P.

A los seis días después de la fertilización, las larvas de pez cebra no transgénicas mostraron la posición natural y la forma del hígado sobre el intestino. El pez cebra transgénico ha aumentado significativamente el tamaño del hígado en comparación con sus hermanos no transgénicos. Aquí se muestran algunos ejemplos de imágenes y micrómetros inadecuados.

Larva con piel cubriendo el hígado, larvas con yema que oscurecen el hígado, larvas con partes del hígado pellizcadas, y larvas con hígado dislocado y cayendo, larva con hígado perdido, larva con contorno hepático que es difícil de identificar, y larvas con posicionamiento inadecuado. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar movimientos pequeños y controlados para prevenir daños en el hígado. Además de la microscopía de campo brillante, también podemos utilizar larvas diseccionadas de esta manera, para la microscopía confocal, para visualizar proteínas fluorescentes de reportero o tinción inmuno fluorescente, y para la hibridación en situación.

El formaldehído o PFA es un irritante y presunto carcinógeno. Los guantes deben usarse cuando se manipula PFA y las soluciones concentradas deben manipularse en una campana de humos química.