Name: Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprende a cuantificar el tamaño hepático en larvas de pez cebra mediante microscopía Brightfield. Este método permite evaluar manipulaciones genéticas y farmacológicas en el desarrollo del hígado.

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Nos gustaría reconocer a Maurine Hobbs y el Centrald Zebrafish Animal Resource (CZAR) en la Universidad de Utah por proporcionar cría de peces cebra, espacio de laboratorio y equipo para llevar a cabo porciones de esta investigación. La expansión del CZAR es apoyada en parte por la subvención NIH n.o 1G20OD018369-01. También nos gustaría dar las gracias a Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum, y la instalación de pez cebra del Huntsman Cancer Institute (HCI) para el cuidado del pez cebra. Nos gustaría agradecer a Kenneth Kompass por su ayuda con la programación R. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Fundación Huntsman Cancer (en conjunto con la subvención P30 CA042014 otorgada al Huntsman Cancer Institute) (KJE) y NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

Los estudios en animales se llevan a cabo siguiendo procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Utah.
1. Fijación de larvas
<ol><li>A los 3-7 días después de la fertilización (dpf), larvas de eutanasia con tricaína metanoesulfonato (0,03%) y recoger hasta 15 larvas en un tubo de 2 ml utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta.</li>
	<li>Lave las larvas dos veces con 1 ml de frío (4 oC) 1 x solución salina con fosfato (PBS) sobre hielo. Para cada lavado, retire la mayor cantidad de líquido posible del tubo con una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta, y luego agregue 1 ml de PBS frío al tubo.</li>
	<li>Retire tanto PBS como sea posible utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta, y agregue 1 ml de frío (4 oC) 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS. ADVERTENCIA: La PFA es un carcinógeno irritante y sospechoso. Los guantes deben usarse al manipular PFA, y las soluciones concentradas deben manipularse en una campana de humo químico.</li>
	<li>Incubar a 4oC al menos durante la noche (pero hasta varios meses) con un suave balanceo.</li>
</ol>2. Diseción de los tejidos que rodean el hígado
<ol><li>Retire las larvas de PFA enjuagando 3 veces con 1 ml de PBS frío (4 oC) y mecendo durante 5 minutos entre enjuagues. NOTA: Está bien mantener las larvas enjuagadas en PBS durante uno o dos días a 4oC.</li>
	<li>Pipetear varias larvas en PBS en un pozo de un plato de vidrio de fondo redondo de 9 pozos.</li>
	<li>Retire la piel que rodea el hígado.<ol>
<li>Utilice fórceps finos para sostener la larva en su espalda (vientre hacia arriba), aferrándose a cada lado de la cabeza tan suavemente como sea posible. Luego usa fórceps muy finos en la otra mano para agarrar la piel justo sobre el corazón.</li>
		<li>Tire de la piel hacia abajo diagonalmente hacia la cola del pez y la parte inferior del plato en el lado izquierdo o derecho del pez. Repita para el otro lado (lado derecho o izquierdo).</li>
		<li>Continúe agarrando colgajos de piel y tirando hacia abajo/hacia atrás hasta que se hayan extirpado toda la piel y los melanoforos que se encuentran sobre el hígado o cerca del hígado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire la yema, si está presente.<ol>
<li>Para larvas de 5-6 dpf, levante la yema en una sola pieza sosteniendo el pez con fórceps finos en su espalda y usando los fórceps muy finos para empujar la yema suavemente.</li>
		<li>Para larvas de 3-4 dpf, raspe la yema en pedazos. Sostenga el pez con fórceps finos en su espalda y use los fórceps muy finos para acariciar la yema, comenzando desde el lado ventral.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque las larvas diseccionadas en PBS frío fresco utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta.</li>
</ol>3. Imágenes
<ol><li>Para montar larvas, vierta unos pocos ml de 3% de celulosa metilenenente en la tapa de un plato Petri de plástico limpio.</li>
	<li>Utilice una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta para agregar larvas a la celulosa metil, añadiendo el menor PBS con las larvas como sea posible.</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección con bajo aumento, usa fórceps finos para orientar a los peces para que estén acostados en su lado derecho, mirando hacia la izquierda. NOTA: Asegúrese de que los peces estén orientados perfectamente de su lado o que las mediciones hepáticas no sean precisas.</li>
	<li>Tome una foto de cada pez.<ol>
<li>Confirme que el pez a fotografiar está perfectamente alineado, con un ojo directamente en la parte superior del otro ojo. Si es necesario, utilice fórceps finos para tocar ligeramente la cabeza o la cola de los peces para ajustar la orientación. Si la cola del pez está doblada, retira la cola pellizcándola con fuerza con fórceps para eliminarla para que el pez quede plana.</li>
		<li>Acercar a un aumento alto y centrarse en el hígado, asegurándose de que el contorno del hígado es claramente visible.</li>
		<li>Toma una foto y guarda el archivo.</li>
		<li>Repita el proceso para todos los peces, asegurándose de que el aumento sea el mismo para cada imagen.</li>
		<li>Tome una foto de un micrómetro utilizando el mismo aumento (consulte la Figura 2H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de imagen
<ol><li>Mida el área del hígado de cada pez utilizando un software de procesamiento de imágenes.<ol>
<li>Cegar todas las imágenes del hígado para evitar posibles sesgos de investigador y promover el rigor científico15. Este paso puede ser realizado manualmente por otro miembro del laboratorio o utilizando un programa de computadora (Material Suplementario). Cambie el nombre de los archivos aleatoriamente y cree un "archivo de aleatorización" que contenga una lista de los nombres de archivo originales y los nombres de archivo cegados correspondientes.</li>
		<li>Abra los archivos aleatorios en orden, empezando por el archivo 1.</li>
		<li>Elija la herramienta de selecciones a mano alzada y delinee cada hígado.</li>
		<li>Presione Ctrl-M para medir el área de cada hígado.</li>
		<li>Para cualquier hígado que no se pueda medir con precisión, inserte una medida de marcador de posición (muy pequeña o muy grande, para que pueda excluirse fácilmente más adelante).</li>
		<li>Guarde las medidas en un archivo de texto ("archivo de medidas").</li>
	</ol>
</li>
	<li>No ciego y analizar datos<ol>
<li>Abra "archivo de medidas" y "archivo de aleatorización" en un programa de hoja de cálculo.</li>
		<li>Inserte una nueva columna en el "archivo de medidas" y agregue los nombres de archivo originales para los archivos cegados, utilizando el "archivo de aleatorización". Guarde este archivo como "archivo de medidas sin ciegas".</li>
		<li>Ordene los datos por nombre de archivo original.</li>
		<li>Asegúrese de excluir las mediciones hepáticas para las que las imágenes fueron inadecuadas (ver Figura 2A–G).</li>
		<li>Si es necesario, convierta los valores de medición en la escala deseada (mm2, por ejemplo).<ol>
<li>Abra la barra de escala en el software de procesamiento de imágenes.</li>
			<li>Utilice la herramienta de línea recta para medir 1 mm en la barra de escala. El software de procesamiento de imágenes medirá en las mismas unidades que los hígados (píxeles), dando un factor de conversión.</li>
			<li>Utilice el factor de conversión para convertir las mediciones en el "archivo de medidas sin ciegas".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizando el programa de hoja de cálculo o pegando datos en un software científico de gráficos y estadísticas, determine la media y la desviación estándar y calcule los valores p.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lin, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li>
<li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Epidemiology%2C+etiology%2C+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+%CE%B2-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras%28V12%29+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+kras%28V12%29+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).</li>
<li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish%3A+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).</li>
<li>Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li>
<li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).</li>
<li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La cuantificación del tamaño del hígado es crucial en estudios dirigidos a comprender el desarrollo hepático, regeneración y oncogénesis. El protocolo descrito aquí es una técnica relativamente rápida, fácil y barata para la cuantificación del tamaño del hígado en peces cebra larvaria. Ejercer la precaución apropiada mientras se realizan ciertos aspectos del protocolo puede ayudar a aumentar la precisión de los resultados y disminuir la frustración.
La fijación adecuada de las larvas es crucia...

El carcinoma hepatocelular (HCC) es la neoplasia maligna primaria más común del hígado1 y la tercera causa de mortalidad relacionada con el cáncer2. Para comprender mejor los mecanismos de la hepatocarcinogénesis e identificar posibles terapias de HCC, nosotros y otros hemos desarrollado peces cebra transgénicos en los que la expresión específica de hepatocitos de oncogenes tales como la -catenina3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, o Yap18 conduce a HCC en animales adultos. En estos peces cebra, el agrandamiento del hígado se observa ya 6 días después de la fertilización (dpf), proporcionando una plataforma fácil para probar los efectos de los fármacos y alteraciones genéticas en el crecimiento excesivo del hígado impulsado por oncógeno. La medición precisa y precisa del tamaño del hígado larvaria es esencial para determinar los efectos de estas manipulaciones.
El tamaño y la forma del hígado pueden evaluarse semicuantitativamente en larvas fijas de peces cebra etiquetando CY3-SA9 o en larvas de peces cebra vivos utilizando reporteros fluorescentes específicos de hepatoparcitos y microscopía de disección de fluorescencia5,6. Este último método es relativamente rápido, y su falta de precisión se puede abordar fotografiando y midiendo el área de cada hígado utilizando el software de procesamiento de imágenes7,10. Sin embargo, puede ser técnicamente difícil posicionar uniformemente todas las larvas vivas en un experimento tal que el área hepática bidimensional es una representación precisa del tamaño del hígado. Una técnica similar para cuantificar el tamaño del hígado implica el uso de microscopía de fluorescencia de láminas de luz para cuantificar el volumen del hígado larvario8, que puede ser más precisa para detectar diferencias de tamaño cuando el hígado se expande de forma no uniforme en diferentes dimensiones. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se puede utilizar para contar el número de hepatocitos etiquetados fluorescentemente y otros tipos de células hepáticas en hígados larvarios8,11. En este método, los hígados larvales se agrupan y se disocian, por lo que se pierde información sobre el tamaño y la forma del hígado individual. En combinación con otro método de determinación del tamaño del hígado, FACS permite la diferenciación entre el aumento del número de células (hiperplasia) y el aumento del tamaño celular (hipertrofia). Todos estos métodos emplean costosa tecnología de fluorescencia (microscopio o clasificador celular) y, a excepción del etiquetado CY3-SA, requieren el etiquetado de hepatocitos con un reportero fluorescente.
Aquí describimos en detalle un método para cuantificar el área del hígado larvario de peces cebra utilizando microscopía de campo brillante y software de procesamiento de imágenes3,12,13,14. Este protocolo permite cuantificar con precisión el área de hígados individuales in situ sin el uso de microscopía de fluorescencia. Al analizar el tamaño del hígado, cegamos la identidad de la imagen para reducir el sesgo del investigador y mejorar el rigor científico15.

<table><tbody><tr><td>Cámara para microscopio de disección</td><td>Leica, por ejemplo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica, por ejemplo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>Image J/FIJI</td><td></td><td>ImageJ/FIJI se puede descargar de forma gratuita: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Varios proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pipeta</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>de plástico USA Scientific Inc</td><td>2906</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Plato de vidrio de fondo redondo de 9 pocillos</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>El software para cegar archivos</td><td>R project</td><td></td><td>R se puede descargar de forma gratuita: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>Software de gráficos y estadísticas científicas</td><td>GraphPad Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programa de hoja de cálculo</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine metanosulfonato (Tricaine-S)</td><td>Western Chemical</td><td>200-226</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas muy finas (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía brightfield

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

En varios modelos transgénicos de peces cebra de carcinoma hepatocelular (HCC), se puede observar hepatomegalia durante las primeras etapas larvales. La cuantificación del tamaño del hígado larvario en los modelos de HCC de pez cebra proporciona un medio para evaluar rápidamente los efectos de los fármacos y otras manipulaciones en un fenotipo relacionado con oncogén. Aquí mostramos cómo reparar larvas de peces cebra, diseccionar los tejidos que rodean el hígado, fotografiar hígados usando microscopía de campo brillante, medir el área hepática y analizar los resultados. Este protocolo permite una cuantificación rápida y precisa del tamaño del hígado. Como este método implica medir el área hepática, puede subestimar las diferencias en el volumen hepático, y se requieren metodologías complementarias para diferenciar entre los cambios en el tamaño celular y los cambios en el número de células. La técnica de disección descrita en este documento es una excelente herramienta para visualizar el hígado, el intestino y el páncreas en sus posiciones naturales para innumerables aplicaciones aguas abajo, incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la hibridación in situ. La estrategia descrita para cuantificar el tamaño del hígado larvario es aplicable a muchos aspectos del desarrollo y la regeneración del hígado.

El pez cebra transgénico que expresa balasteo específico de hepatocitos activado (Tg(fabp10a:pt-a-cat) -cat) 3 y los hermanos de control no transgénicos fueron eutanasiados a 6 dpf y el área hepática se cuantificó utilizando microscopía de campo brillante y software de procesamiento de imágenes. El pez cebra transgénico ha aumentado significativamente el tamaño del hígado (0.0006 cm2) en comparación con sus hermanos no transgénicos (0.0004 cm2, p &l...

Aquí demostramos un método para cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval, proporcionando una manera de evaluar los efectos de las manipulaciones genéticas y farmacológicas en el crecimiento y desarrollo del hígado.

Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Este método proporciona una manera de cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval. También permite la evaluación de los efectos de la manipulación genética y farmacológica en el crecimiento y desarrollo hepático. Esta técnica proporciona una forma rápida y precisa de visualizar y medir el hígado, así como el intestino y el páncreas.Además de cuantificar el tamaño del hígado, este método de disección puede ser útil para preparar el hígado, el intestino y el páncreas para la hibridación in situ o imágenes confocales. Antes de intentar desfalar en larvas experimentales, asegúrate de haber pasado mucho tiempo practicando en muestras no experimentales y tener una tasa de éxito significativa. Es fundamental visualizar la orientación y el movimiento adecuados de las larvas y fórceps de peces cebra para eliminar la piel sin perturbar los órganos circundantes.A los tres a siete días después de la fertilización, después de eutanasiar larvas, utilice una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta para recoger hasta 15 larvas en un tubo de dos mililitros. Lave las larvas dos veces con un mililitro de PBS frío 1X sobre hielo. Retire tanto PBS como sea posible usando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta y agregue un mililitro de PFA frío de cuatro por ciento en PBS.Incubar a cuatro grados centígrados al menos durante la noche con un suave balanceo. Con una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta, retire el PFA del tubo y enjuague tres veces con un mililitro de PBS frío. Mece durante cinco minutos entre enjuagues.Pipetear varias larvas en PBS en un pozo de nueve pozos de plato de vidrio de fondo redondo. Bajo un microscopio, retire la piel que rodea el hígado usando fórceps finos para sostener una larva en su espalda, agarrándose a cada lado de la cabeza tan suavemente como sea posible. Luego usa fórceps muy finos en la otra mano para agarrar la piel justo sobre el corazón.Tire de la piel hacia abajo diagonalmente hacia la cola del pescado en la parte inferior del plato en el lado izquierdo o derecho del pescado. Repita para el otro lado. Continúe agarrando aletas de piel y tirando hacia abajo hasta que toda la piel y los melanoforos que se extienden o cerca del hígado hayan sido eliminados.Si la yema está presente durante cinco a seis días después de la fertilización, levante la yema en una sola pieza sosteniendo el pez con fórceps finos en su espalda y usando los fórceps muy finos para prodear suavemente la yema. Para tres a cuatro larvas de DPF, sostenga el pez con fórceps finos en su espalda y use los fórceps muy finos para acariciar la yema a partir del lado ventral. Raspa la yema en pedazos.Coloque las larvas diseccionadas en PBS fresco y frío en un tubo de dos mililitros utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta. Para montar las larvas, vierta unos mililitros de tres por ciento de metilcelulosa en la tapa de la placa limpia y plástica de Petri. Utilice una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta para añadir larvas a la metilcelulosa, añadiendo el menor PBS con las larvas como sea posible.Bajo un microscopio diseccionando con un aumento bajo, utilice fórceps finos para orientar a los peces de modo que estén acostados en su lado derecho mirando hacia la izquierda. Confirme que el pez a fotografiar está perfectamente alineado con un ojo directamente encima del otro ojo. Si la cola del pez está doblada, retire la cola pellizcándola con fuerza con fórceps para retirarla de modo que el pez quede plano.Acércate a un aumento alto y concéntrate en el hígado, asegurándote de que el contorno del hígado sea claramente visible. Pulse el botón Capturar imagen para ajustar una imagen y guardar el archivo. Repita el proceso para todos los peces, asegurándose de que el aumento sea el mismo para cada imagen.Tome una foto de un micrómetro usando el mismo aumento. Para utilizar el programa R para cegar todas las imágenes hepáticas para evitar posibles sesgos de investigador y promover el rigor científico, cambiar el nombre de los archivos al azar y crear un archivo de aleatorización que contiene una lista de los nombres de archivo originales y los nombres de archivo cegados correspondientes. Abra los archivos aleatorios en orden, empezando por el archivo uno.Elija la herramienta Selecciones a mano alzada y delinee cada hígado. Presione Control-M para medir el área de cada hígado. Para cualquier hígado que no se pueda medir con precisión porque tienen piel residual, yema, están fuera de foco, o no están intactos, inserte una medida de marcador de posición.Guarde las medidas en un archivo de texto. Para desabromar y analizar datos, abra el archivo de mediciones y el archivo de aleatorización en un programa de hoja de cálculo. Inserte una nueva columna en el archivo de medidas y agregue los nombres de archivo originales para los archivos ciegos mediante el archivo de aleatorización.Guarde este archivo como el archivo De medidas sin ciegos. Ordene los datos por el nombre de archivo original. Excluir cualquier medida hepática para la que las imágenes no fueran adecuadas.Si es necesario, convierta los valores de medición en la escala deseada en milímetros cuadrados. Abra la barra Escala en el software de procesamiento de imágenes. Utilice la herramienta Línea recta para medir un milímetro en la barra de escala.El software de procesamiento de imágenes mide en las mismas unidades que los hígados, dando un factor de conversión. Utilice el factor de conversión para convertir medidas en el archivo Mediciones no ciegas. Determine la media y la desviación estándar y calcule los valores P.A los seis días después de la fertilización, las larvas de pez cebra no transgénicas mostraron la posición natural y la forma del hígado sobre el intestino. El pez cebra transgénico ha aumentado significativamente el tamaño del hígado en comparación con sus hermanos no transgénicos. Aquí se muestran algunos ejemplos de imágenes y micrómetros inadecuados.Larva con piel cubriendo el hígado, larvas con yema que oscurecen el hígado, larvas con partes del hígado pellizcadas, y larvas con hígado dislocado y cayendo, larva con hígado perdido, larva con contorno hepático que es difícil de identificar, y larvas con posicionamiento inadecuado. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar movimientos pequeños y controlados para prevenir daños en el hígado. Además de la microscopía de campo brillante, también podemos utilizar larvas diseccionadas de esta manera, para la microscopía confocal, para visualizar proteínas fluorescentes de reportero o tinción inmuno fluorescente, y para la hibridación en situación.El formaldehído o PFA es un irritante y presunto carcinógeno. Los guantes deben usarse cuando se manipula PFA y las soluciones concentradas deben manipularse en una campana de humos química.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Presentamos un protocolo para capturar la dinámica de la regeneración de la aleta caudal de las larvas de pez cebra a escala de tejido completo utilizando estereomicroscopía basada en campo claro. Esta técnica permite capturar la dinámica de regeneración con resolución de una sola célula. Esta metodología se puede adaptar a cualquier microscopio estereoscópico equipado con una cámara CCD y software de lapso de tiempo.

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz es una excelente herramienta para obtener imágenes del desarrollo embrionario. Permite la grabación de vídeos de largo lapso de tiempo de embriones vivos en condiciones casi fisiológicas. Demostramos su aplicación para obtener imágenes del desarrollo del ojo del pez cebra a través de amplias escalas espacio-temporales y presentamos una línea para la fusión y deconvolución de conjuntos de datos multivista.

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

El pez cebra está emergiendo como un modelo valioso de procesamiento de lípidos en la dieta y enfermedades metabólicas. Se describen los protocolos de alimentación para larvas ricas en lípidos, imágenes en vivo de análogos lipídicos fluorescentes en la dieta y cuantificación de la ingesta de alimentos. Estas técnicas se pueden aplicar a una variedad de técnicas de detección, imágenes e indagación basada en hipótesis.

La alimentación de las larvas de pez cebra paradigma para la alta en grasas: Alimentación, imágenes en vivo, y Cuantificación de la ingesta de alimentos

Aquí describimos un método para reducir el tamaño de los embriones de pez cebra sin interrumpir los procesos normales de desarrollo. Esta técnica permite el estudio de la escala del patrón y la robustez del desarrollo contra el cambio de tamaño.

Reducción de tamaño quirúrgico del pez cebra para el estudio de la escala de patrón embrionario

Este protocolo describe el procedimiento para eliminar el lóbulo ventral del hígado en el pez cebra adulto para permitir el estudio de la regeneración hepática.

Hepatectomía parcial en pez cebra adulto

Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

Aquí, presentamos cómo generar un modelo de pez cebra de carcinoma hepatocelular (HCC) asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) para estudiar el impacto del excedente de colesterol en el microambiente hepático y el paisaje de las células inmunes.

Análisis del microambiente hepático durante la progresión temprana del carcinoma hepatocelular asociado a la enfermedad del hígado graso no alcohólico en pez cebra

La claridad óptica es una gran ventaja para el trabajo biológico y fisiológico celular en el pez cebra. Se describen métodos robustos para medir el crecimiento celular en animales individuales que permiten nuevos conocimientos sobre cómo el crecimiento del músculo esquelético y los tejidos vecinos se integran con el crecimiento de todo el cuerpo.

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes in vivo de todo el cerebro de larvas de pez cebra utilizando microscopía de fluorescencia tridimensional. El procedimiento experimental incluye la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y la visualización.

In vivo Imágenes de todo el cerebro de larvas de pez cebra usando microscopía de fluorescencia tridimensional

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Aprende a cuantificar el tamaño hepático en larvas de pez cebra mediante microscopía Brightfield. Este método permite evaluar manipulaciones genéticas y farmacológicas en el desarrollo del hígado.

Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield

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