Etiquetado y toma de Dextran en células de cabello cocleares de murine en vivo y funcionales
8 de febrero de 2020
Aquí, presentamos un método para visualizar la toma de 3 kDa Texas Red-labeled dextran en células vellosas auditivas con canales funcionales de mechanotransducción. Además, dextrans de 3-10 kDa se puede utilizar para estudiar la endococitosis en el cabello y las células de soporte del órgano de Corti.
El objetivo general de este protocolo es estudiar la absorción de dextrán regularmente etiquetados fluorescentemente con Texas Red en células pilosas vivas con canales funcionales de mecanotransducción. La principal ventaja de esta técnica es que el dextrán de tres kilodalton Texas Red se puede utilizar para evaluar la función del canal de mecanotransducción en células pilosas vivas. Para cosechar la cóclea, coloque el cráneo de un ratón de seis días postnatales en un plato de cultivo de 60 milímetros que contenga el medio L-15 de Leibovitz y use tijeras quirúrgicas para hacer un corte superficial desde el extremo anterior hasta el extremo posterior del cráneo y a través de los canales auditivos externos.
Dobla la piel hacia la nariz para exponer el cráneo y haz una incisión desde la parte posterior hasta la parte delantera del cráneo y a través de la línea del ojo. Separe el cráneo en dos mitades y use una pequeña espátula para extirpar el cerebro. Cuando se puedan observar los huesos temporales, utilice tijeras pequeñas para cortar alrededor de estos huesos para extirpar el tejido.
Sumerja los huesos temporales en el plato de 35 milímetros que contiene el medio L-15 fresco y coloque el plato bajo un microscopio estéreo equipado con un ocular de campo ancho y una fuente de luz halógena de corriente alterna externa. Utilice fórceps para extraer el tejido coclear circundante, los canales semicirculares y los órganos vestibulares. Una vez que la cóclea ha sido diseccionada y colocada en un nuevo plato con medios frescos L-15, utilice fórceps quirúrgicos para hacer una herida punzante en la ventana redonda y una punción en la región coclear apical.
Cuando se hayan cosechado todas las cócleas, coloque el tejido en un pozo de una placa de depresión de vidrio de nueve pozos que contenga 200 microlitros de medio L-15 fresco. Para el etiquetado de dextrán de los tejidos aislados, reemplace el medio de cada pozo de muestra por 200 microlitros de medio L-15 fresco complementado con dos miligramos por mililitro del dextrano conjugado de fluorescencia de interés. Incubar las muestras durante dos horas a temperatura ambiente y 25 rotaciones por minuto en un agitador tridimensional en un ángulo inclinado de 25 grados protegido de la luz.
Al final de la incubación, lave los tejidos una vez con medio y una vez con HBSS durante dos minutos por lavado. Después del segundo lavado, fijar las muestras en 4%paraformaldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido de dos lavados rápidos y suaves en HBSS. Después del segundo lavado, utilice fórceps de punta fina para extraer el hueso coclear, el ligamento espiral y la membrana tectorial y lavar el órgano aislado de Corti en HBSS.
Tenga especial cuidado al extraer la membrana tectorial transparente ya que el tejido de las células pilosas puede dañarse fácilmente durante este paso. Para etiquetar la F-actina, permeabilizar las muestras en 0.5%Triton X-100 en PBS complementado con 100 a 200 dilución de faloide con etiqueta fluorescente durante 30 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación, lave los tejidos de dos a tres veces en HBSS fresco por lavado, como se demuestra seguido de un solo lavado en PBS.
Utilice un medio de montaje adecuado para montar el órgano de los tejidos Corti en un microscopio de vidrio, deslice los lados de la estereocía del cabello e imagine las muestras en un microscopio confocal fluorescente utilizando el objetivo de inmersión de aceite 63X. Después de una incubación de dos horas con tres kilodalton dextran conjugados fluorescentemente con Texas Red, órgano de Corti explant de tipo salvaje postnatal día seis ratones demuestran un etiquetado robusto y específico de las células del cabello interior y exterior. Las imágenes de la estereocilia de las células pilosas y los cuerpos celulares revelan que sólo aquellas células que han incorporado tres kilodalton dextran Texas Red en su cuerpo celular también demostraron el etiquetado fluorescente de su estereocilia.
Es importante destacar que se observa una señal fluorescente uniforme a lo largo de la estereocilia con enriquecimiento en las puntas de las filas estereocilias más cortas donde se encuentra el canal de mecanotransducción. También se observan estructuras similares a las vesículas en el cuerpo celular de las células pilosas y las células auxiliares vecinas, lo que sugiere que dextran Texas Red también puede ser tomado por endocitosis. Más grande 10 kilodalton dextrans también produjo un patrón similar a la vesícula en el cuerpo celular de las células pilosas y las células de apoyo.
En particular, la presencia de un quelante de calcio o bloqueadores de canales de mecanotransducción previene el etiquetado de estereocilias y la absorción de tres kilodalton dextran Texas Red en las células pilosas. El patrón similar a la vesícula todavía se observa en presencia de bloqueo del canal de mecanotransducción, sin embargo, lo que indica que este patrón de absorción es independiente de los canales funcionales del MET. Es muy importante diseccionar cuidadosamente el órgano del tejido Corti y confirmar la orientación adecuada de las células pilosas antes de montar el tejido para la toma de imágenes.
Después del etiquetado de dextrán de las células pilosas vivas y funcionales, se puede realizar una inmunosumanidad del tejido fijo para identificar tipos celulares específicos de proteínas de interés.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para visualizar la captación de dextrano marcado con Texas Red de 3 kDa en células pilosas auditivas con canales de mecanotransducción funcionales. Esta técnica permite evaluar la función de los canales de mecanotransducción en células pilosas vivas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Investigación Auditiva
Antecedentes
- Comprender la mecanotransducción en las células ciliadas auditivas es fundamental para la función auditiva.
- Los dextranos de diferentes tamaños pueden utilizarse para estudiar procesos celulares como la endocitosis.
- El órgano de Corti es una estructura clave en la cóclea implicada en la audición.
- La marcación fluorescente facilita la visualización de los procesos de captación celular.
Objetivo del estudio
- Visualizar la incorporación de dextrano marcado con Texas Red en células pilosas auditivas vivas.
- Evaluar la funcionalidad de los canales de transducción mecanica en estas células.
- Explorar el uso de dextranos para estudiar la endocitosis en células pilosas y células de sostén.
Métodos Utilizados
- Extracción de cócleas de ratones del sexto día postnatal.
- Uso de técnicas quirúrgicas para exponer las estructuras cocleares.
- Aplicación de dextrano marcado con Texas Red a las células ciliadas auditivas.
- Visualización de la captación mediante microscopía de fluorescencia.
Resultados principales
- Visualización exitosa de la captación de dextrano en células pilosas vivas.
- Funcionalidad demostrada de los canales de mecanotransducción.
- Proporcionó información sobre los mecanismos de endocitosis en el órgano de Corti.
- Estableció un método confiable para estudiar la biología celular auditiva.
Conclusiones
- El método visualiza eficazmente la captación de dextrano en las células ciliadas auditivas.
- Este enfoque puede mejorar la comprensión de la transducción mecanica en la audición.
- Estudios futuros pueden basarse en esta técnica para explorar procesos celulares relacionados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Evaluar la función del canal de mecanotransducción en células pilosas auditivas vivas es fundamental para la validación de objetivos terapéuticos en el tratamiento de la pérdida auditiva. Este método proporciona una lectura directa y cuantitativa de la actividad del canal mediante la absorción de dextrano fluorescente, permitiendo reducir el riesgo mecanicista de dianas implicadas en la transducción sensorial. El enfoque refuerza la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular la función molecular con el fenotipo celular en un sistema relevante para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la medición directa de la actividad funcional de los canales de mecanotransducción en células pilosas vivas.
- Valor operativo: Permite la desestimación biológica de dianas mediante un ensayo sólido, basado en imágenes, de la función del canal.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al distinguir los compuestos que conservan o modulan la función del canal MET de aquellos que no lo hacen.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la selección de compuestos posteriores, confirmando la captación de dextrano dependiente de MET como biomarcador funcional.
- Resultado cuantitativo: Genera señales de fluorescencia medibles en las estereocilias y el cuerpo celular que se correlacionan con la actividad del canal y pueden normalizarse entre muestras.
- Escalabilidad y reutilización: Permite la adaptación de la plataforma para el análisis de alto contenido de la cinética de captación de colorante en explantes del órgano de Corti.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Utiliza explantes del órgano de Corti murino posnatal como un sistema relevante para la enfermedad para estudiar la función de las células ciliadas auditivas.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos de descubrimiento con validación preclínica al proporcionar una lectura consistente de la actividad de transducción mecánica en todas las etapas experimentales.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar o no continuar al identificar compuestos que interrumpen la captación de dextrano mediante el bloqueo del canal de transducción mecánica.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos líderes, donde la validación funcional de los canales de mecanotransducción precede al cribado y optimización de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al proporcionar una lectura directa de la captación celular dependiente de los canales MET en las células pilosas.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante protocolos estandarizados de marcado con dextrano que producen resultados de fluorescencia cuantitativos y reproducibles en las estereocilias y el cuerpo celular.
- Análisis: Proporciona variables dependientes mensurables (intensidad de fluorescencia en hileras de estereocilias y patrones similares a vesículas) que permiten comparar condiciones experimentales y efectos de compuestos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al utilizar la misma lectura de actividad MET para evaluar la interacción con el blanco en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para evaluar la función de transducción sensorial en diversos programas de investigación auditiva.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en el análisis de las vías de mecanotransducción.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante parámetros definidos de incubación, lavado y adquisición de imágenes para la captación de dextrano.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción al vincular la modulación del objetivo con lecturas funcionales de las células pilosas, reduciendo el riesgo biológico en etapas tardías.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos según su efecto sobre la captación de dextrano dependiente del MET en un sistema relevante para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección coclear de ratón, aislamiento del órgano de Corti y microscopía fluorescente.
- Depende de una infraestructura de imagen confocal con láser y configuraciones de detección adecuadas para la fluorescencia de Texas Red.
- Necesita la estandarización de la concentración de dextrano, el tiempo de incubación y las condiciones del agitador entre laboratorios.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes modelos mamíferos o etapas del desarrollo.
- Se encuentra limitado por la necesidad de preparar tejido vivo y por la sensibilidad de las células pilosas al estrés mecánico y ambiental durante la disección.
