Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia

Cuantificar los cambios conformacionales en biomoléculas individuales bajo flujo de cizallamiento es útil para entender la función y la biofísica de las macromoléculas como la proteína y el ADN. La microscopía de fluorescencia permite la visualización in situ en tiempo real de moléculas individuales en entornos de flujo fisiológico con alta resolución temporal y espacial. Esto no tiene comparación con otras técnicas como AFM.

Al caracterizar la fuerza de cizallamiento bajo la cual las proteínas nuestro ADN tienen cambios conformacionales globales, uno puede diseñar mejor fármacos que imitan estas propiedades biofísicas. Este protocolo se puede aplicar ampliamente para estudiar el comportamiento u otros polímeros, especialmente biomé polímeros, en diferentes condiciones de flujo e investigar la reología de fluidos complejos. El momento de los pasos es fundamental para el éxito.

Sugerimos practicar el tratamiento de la superficie del dispositivo microfluídico y los pasos de la microscopía de fluorescencia muchas veces para ejecutarlos de una manera eficiente. Capturar los cambios conformacionales en las biomoléculas es un fenómeno visual y dinámico mejor visto en el cine. Los científicos comprenderán mejor este método después de ver la microscopía de proteína y ADN en tiempo real presentada en este video.

Para preparar el dispositivo microfluídico, agregue cinco partes de la base de elastómero de silicona a un agente de curado de una parte en un bote de pesaje. y remueva el contenido a fondo durante un minuto para crear una solución PDMS precurada. Coloque la oblea de silicio maestro en un plato de Petri de plástico y vierta la solución PDMS sobre la oblea para crear una capa de cinco milímetros.

Cubra el plato y déjelo en un desecador al vacío durante una hora para eliminar las burbujas de aire. Luego incuba el plato De Petri cubierto a 60 grados Celsius durante la noche para curar el PDMS en un sólido flexible, lo que resultará en canales microfluídicos siendo moldeados en el PDMS en la interfaz de oblea PDMS. Al día siguiente, utilice una maquinilla de afeitar para cortar rectángulos de 20 por 10 milímetros alrededor de cada canal microfluídico en el PDMS y quitar los bloques rectangulares con pinzas.

Utilice una aguja de extremo contundente de calibre 25 con bordes afilados para perforar un agujero de 0,5 milímetros de diámetro en un extremo del canal, asegurándose de que el agujero pasa completamente a través del bloque PDMS. Utilice una aguja delgada para perforar el PDMS fuera del agujero y repetir el proceso en el otro extremo del canal. Coloque el bloque PDMS con el lado del canal hacia arriba y el cubreobjetos en la cámara de una máquina de unión de plasma e inicie el tratamiento.

Una vez completado el tratamiento, coloque rápidamente el bloque PDMS en un cubreobjetos para que el canal esté en contacto con el resbalón. Aplique presión en los bordes del bloque y, a continuación, coloque el conjunto PDMS de contracción en una placa caliente a 115 grados Celsius durante 15 minutos para reforzar la unión permanente. Finalmente, inserte un 10 centímetros de largo.

Tubo de 0,25 milímetros de diámetro interior en el orificio de salida en la parte superior del bloque PDMS para permitir que el fluido fluya fácilmente fuera del canal. Para experimentos con factor von Willebrand o VWF, inyectan hasta 10 microlitros de 10 microgramos por mililitro BSA-Biotin disuelto en 1X PBS estéril en la entrada del dispositivo microfluídico. Retenga unos microlitros de BSA-Biotin en la punta de la pipeta después de la inyección y permita que la punta permanezca incrustada en la entrada.

Permita que la BSA-Biotina se incuba en el dispositivo durante dos horas, lo que dará lugar a la unión de BSA no específicamente a la superficie del cubreobjetos. A continuación, retire la punta de la pipeta e inyecte hasta 10 microlitros de solución de bloqueo de caseína en el canal. Permita que la solución de caseína se incuba durante 30 minutos para que pueda bloquear cualquier sitio libre y reducir la unión inespecífico de las biomoléculas a la superficie.

Retire la punta e inyecte hasta 10 microlitros de estreptavidina en PBS estéril en el canal, que se unirán a los grupos de biotina de la BSA-Biotina. A continuación, inyecte hasta 10 microlitros de solución detergente para eliminar el exceso de estreptavidina. Retire la punta e inyecte VWF en solución de caseína o ADN lambda.

Incubar el VWF durante tres minutos o ADN lambda durante 45 minutos. A continuación, inyecte cinco biotina libre de mililitros para bloquear el exceso de sitios de unión a estreptavidina. Cargue un mililitro de solución de bloqueo de caseína en una jeringa y fíjela en una bomba de jeringa.

A continuación, conecte un extremo del tubo a la aguja de la jeringa y fluya en la solución para eliminar las burbujas de aire. Aproximadamente tres minutos después de la inyección de biotina libre, conecte el otro extremo del tubo a la entrada del dispositivo microfluídico. Seleccione el objetivo de aumento más alto del microscopio TIRF o fluorescencia confocal.

Si es necesario, añada una gota de aceite de inmersión en el objetivo. Coloque el dispositivo microfluídico en la etapa del microscopio para que el cubreobjetos esté al ras del objetivo. Inicie la microscopía de campo brillante y ajuste el enfoque para que funciones como desechos y burbujas sean visibles.

A continuación, ajuste el escenario en las direcciones X e Y hasta que el borde del canal microfluídico sea visible y bisects el marco. Cambie al canal FITC y ajuste el nivel Z y el ángulo TIRF según sea necesario hasta que se puedan distinguir las moléculas globulares verdes individuales. Ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición para visualizar moléculas fluorescentes sin fotoblanquearlas demasiado rápido.

A continuación, ajuste el contraste para visualizar mejor las moléculas. Exactamente cinco minutos después de la inyección libre de biotina iniciar y detener el flujo de la bomba de la jeringa para observar los cambios en la conformación molecular utilizando caudales entre 5000 y 30 000 microlitros por hora. Con VWF es fundamental aplicar al menos una pequeña cantidad de flujo, como 30 segundos de 10.000 microlitros por hora fluyen exactamente cinco minutos después de la inyección gratuita de biotina.

Repita esto en varias áreas del dispositivo microfluídico y localice moléculas que puedan extenderse y relajarse en múltiples ciclos de flujo de arranque y parada. Tenga en cuenta cuánto tiempo tardan las moléculas en alcanzar la máxima extensión y completar la relajación y grabar videos del comportamiento continuo de las moléculas bajo flujo de cizallamiento. La flexibilidad de una molécula para cambiar la confirmación a menudo se demuestra por su capacidad de alargarse a medida que se aplican tasas de cizallamiento más altas debido al aumento del flujo.

La curva de extensión frente a la velocidad de cizallamiento de una molécula de factor von Willebrand es útil para caracterizar las propiedades biomecánicas de la proteína. Las imágenes de microscopía de fluorescencia del ADN lambda muestran de manera similar una mayor extensión sobre tasas de cizallamiento más altas a los 30 segundos y relajación gradual durante dos minutos después de detener el flujo. Cuando trabaje con VWF, recuerde incubarlo solo durante tres minutos y liberar biotina durante cinco minutos antes de iniciar el flujo.

Esto es fundamental para formar el número óptimo o los enlaces de biotina-estreptavidina necesarios para el desenmarañado reversible. Este método se puede adaptar para visualizar interacciones en tiempo real entre múltiples biomoléculas y caracterizar sus funciones. Por ejemplo, se podría entender mejor la formación de tapones plaquetario visualizando el VWF desentrañando bajo alta cizalladura y su unión con la molécula de adhesión plaquetaria GPIb-alpha con este método.