Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales
3 de diciembre de 2020
Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.
Mediante microscopía intravital, este protocolo permite la visualización en tiempo real del tejido intestinal hasta una resolución de una sola célula y el estudio de procesos altamente dinámicos como el desprendimiento celular. En combinación con los experimentos de trazador estándar, este protocolo permite la identificación tanto de las perturbaciones de permeabilidad intestinal in vivo como de la distinción entre permeabilidad para y transcelular. Este protocolo podría utilizarse como base para el desarrollo de enfoques adicionales de microscopía intravital para visualizar otros procesos celulares altamente dinámicos de intereses dentro de diversos tejidos.
La demostración visual de este método es esencial para entender los pasos de preparación quirúrgica y posicionar al animal vivo de una manera que facilite la adquisición de imágenes en la superficie de la mucosa intestinal. Antes de comenzar el procedimiento, encienda la base y la caja del escáner de un microscopio de escaneo láser confocal y pulse Start para encender el ordenador. Inicie el software de adquisición de imágenes y seleccione la configuración adecuada.
Para establecer la resolución de imagen adecuada, seleccione la configuración, el hardware, la resolución, la profundidad de bits y 12. En el menú de adquisición, seleccione XYZT para el modo de adquisición de imágenes y establezca el objetivo en 20 o 40X. Para configurar la configuración de adquisición secuencial, haga clic en Buscar y agregar y seleccionar entre fotogramas.
Para configurar la secuencia uno, active el cuadro láser visible. Ajuste el tubo fotomultiplicador uno a activado y defina la longitud de onda de emisión. Para configurar la secuencia dos, active el cuadro láser visible.
Ajuste el tubo fotomultiplicador dos en encendido y defina la longitud de onda de emisión. A continuación, active los láseres apropiados. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro, usa un bastoncillo de algodón para aplicar un ungido en los ojos del ratón anestesiado y haz una incisión de un centímetro en la región del ventrículo izquierdo del abdomen.
Use fórceps para exteriorizar un segmento de tres a cinco centímetros del intestino. Haga dos pequeñas incisiones en la parte superior e inferior del segmento intestinal e introduzca una micropipeta de vidrio en el lumen intestinal. Luego utilice la electrocauterización para abrir el segmento intestinal exteriorizado longitudinalmente a lo largo del lado antimesentérico y exponer la mucosa.
Enjuague brevemente el tejido con solución salina para eliminar el contenido fecal. Para la tinción de la superficie de la mucosa intestinal, aplicar 100 microlitros de un miligramo por mililitro de solución de acriflavina en gotas sobre la superficie de la mucosa expuesta y permitir que la mancha se desarrolle durante tres minutos antes de lavar la solución restante con PBS. A continuación, aplicar 100 microlitros de una solución de dextrano de rhodamina de dos miligramos por mililitro en gotas a la mucosa para una incubación de tres minutos antes de lavar con PBS.
A continuación, coloque el ratón anestesiado supino en una corredera de cubierta montada en la cámara enjuagado con 37 grados Celsius salina, ajustando la posición si es necesario, y coloque la preparación en la etapa del microscopio invertido. Inmediatamente después de colocar el ratón en el escenario, encienda la fuente de luz y ajuste la posición XY hasta que el eje de iluminación se centre en la preparación del tejido. Para seleccionar el campo de visión, seleccione el cubo de filtro apropiado.
Abra el obturador y utilice las ruedas macro y micro para centrarse en la superficie de la mucosa intestinal. Ajuste la posición XY para localizar un área en la que se puedan visualizar varias vellosidades dentro del campo de visión y cambie el cubo del filtro para verificar que la tinción de dextrano de rhodamine también sea visible en esa área. Cuando se haya identificado un área de interés, inicie la adquisición de la imagen y seleccione la secuencia uno para ajustar la potencia, ganancia y desplazamiento del láser para la secuencia uno.
A continuación, seleccione la secuencia dos y ajuste la potencia, ganancia y desplazamiento del láser para la secuencia dos. Para definir el rango de la pila Z, abra el menú desplegable de la pila Z. Utilice el control de acceso Z para centrarse en la superficie de la mucosa y haga clic en comenzar.
Concéntrese en el límite inferior de donde la señal todavía es detectable y haga clic en end. Defina los números de pilas Z, evitando lapsos de tiempo de más de dos minutos durante dos puntos de tiempo consecutivos y abra el menú de tiempo para seleccionar minimizar y adquirir hasta detenerse. Para definir el promedio de línea, seleccione buscar uno, el promedio de línea dos, busque dos y el promedio de línea dos.
A continuación, para adquirir imágenes, establezca el formato en 1024 x 1024 píxeles y la velocidad en 400 y haga clic en Iniciar. Los ratones condicionales con deficiencia de células epiteliales intestinales y los ratones condicionales deficientes de células epiteliales desarrollaron patología intestinal grave como lo demuestra un aumento en la puntuación de daño histológico del intestino delgado y el aumento de la permeabilidad epitelial intestinal también se puede detectar a través del trazador en experimentos in vivo utilizando FITC-dextran administrado por vía oral. Los eventos de desprendimiento celular podrían ser identificados como células que se mueven fuera de la monocapa epitelial en el lumen, lo que conduce a huecos temporales en el techo del epitelio que finalmente se cierran por el contacto entre las células vecinas, un llamado efecto de cremallera.
Estas brechas se observan tanto en ratones con control como en ratones con deficiencia de GGTase, aunque la frecuencia de estos fenómenos es mayor en este último. Curiosamente, otras células también parecen captar dextrán. Estos llamados eventos celulares permeables también ocurren principalmente en ratones nocaut condicionales.
La inmunostaining de proteínas de unión estrecha y relacionadas con citoesqueletos se puede realizar para identificar objetivos específicos que contribuyen a posibles alteraciones de la permeabilidad epitelial determinadas a través de la microscopía intravital. Este método se puede utilizar para el análisis de otros fenómenos en la superficie de la mucosa intestinal, como la fuga endotelial o la comunicación epitelial inmune en el contexto de la infección intestinal.
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Descripción general
Este protocolo utiliza microscopía intravital para visualizar en tiempo real la exfoliación de células epiteliales intestinales en animales vivos. El método permite obtener imágenes de la mucosa intestinal con resolución a nivel de célula individual, facilitando el estudio de procesos celulares dinámicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Técnicas de microscopía
Antecedentes
- La microscopía intravital proporciona información sobre la dinámica de tejidos vivos.
- Comprender la permeabilidad intestinal es fundamental para diversos estudios biológicos.
- La descamación celular es un proceso significativo en la salud y enfermedad intestinales.
- La imagenología en tiempo real mejora el estudio de los comportamientos celulares.
Objetivo del estudio
- Visualizar la exfoliación de células epiteliales intestinales in vivo.
- Identificar alteraciones en la permeabilidad de la barrera intestinal.
- Distinguir entre mecanismos de permeabilidad paracelular y transcelular.
Métodos Utilizados
- Microscopía intravital para imágenes en tiempo real.
- Tinción tópica de la mucosa intestinal con acriflavina y dextrano-rhodamina B.
- Microscopía confocal para lograr resolución a nivel de célula individual.
- Experimentos estándar con trazadores para evaluar la permeabilidad.
Resultados principales
- Visualización exitosa de la exfoliación celular en tejido intestinal vivo.
- Identificación de procesos dinámicos que afectan la permeabilidad intestinal.
- Demuestra la aplicabilidad del método a otros tejidos.
- Mejor comprensión de la preparación quirúrgica para la obtención de imágenes.
Conclusiones
- El protocolo proporciona una herramienta valiosa para estudiar la dinámica intestinal.
- La imagen en tiempo real puede conducir a nuevas perspectivas sobre los procesos celulares.
- Este método podría inspirar investigaciones adicionales en diversos contextos biológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microscopía intravital permite la visualización en tiempo real de la dinámica del epitelio intestinal, proporcionando una observación directa de la función de barrera y la descamación celular in vivo. Este enfoque facilita la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas gastrointestinales al vincular perturbaciones moleculares con resultados funcionales de permeabilidad. El método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al proporcionar datos cuantitativos y con resolución espacial sobre la integridad epitelial y los procesos de reparación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la correlación de intervenciones genéticas o farmacológicas con eventos de descamación epitelial y fuga de barrera en tiempo real.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante la visualización directa de alteraciones en la permeabilidad intestinal en sistemas vivos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al distinguir entre mecanismos de permeabilidad paracelular y transcelular, aportando información para la evaluación de riesgos basada en mecanismos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante el establecimiento de fenotipos basales de desprendimiento y permeabilidad en modelos relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante imágenes cuantitativas del flujo de trazadores y eventos de extrusión celular.
- Valor de la plataforma: Destaca la capacidad de cribado y escalabilidad al permitir el monitoreo longitudinal de procesos intestinales dinámicos en preparaciones anestesiadas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor Científico: Analiza la relevancia de la enfermedad y la alineación de biomarcadores traslacionales mediante la conexión de observaciones intravital con puntuaciones de daño histológico y ensayos de permeabilidad basados en trazadores.
- Valor Operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la evaluación longitudinal de la reparación epitelial y la restauración de la barrera.
- Avance Ajustado al Riesgo: Se centra en el valor predictivo de reducción de riesgos al identificar eventos de células permeables y la recomposición mediada por cremallera como lecturas funcionales de la resiliencia epitelial.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuación del descubrimiento, desde la prueba de hipótesis del objetivo hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica, apoyando la refinación iterativa de objetivos gastrointestinales basada en resultados funcionales de la barrera.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método respalda la prueba de hipótesis, la aclaración de vías o la reducción de riesgos biológicos mediante la correlación en tiempo real de modificaciones moleculares con la exfoliación epitelial y la función de barrera.
- Selección: Describe la disponibilidad del ensayo, su reproducibilidad o sus resultados cuantitativos cuando el artículo lo respalda mediante la administración estandarizada de trazadores y la obtención de imágenes confocales del flujo de dextrano a través de la mucosa intestinal.
- Análisis: Destaca las mediciones, lecturas o resultados estadísticos que ayudan a los equipos a comparar condiciones, incluyendo la adquisición de Z-stacks, el promedio de líneas y la obtención de imágenes de lapso de tiempo de la frecuencia de exfoliación y la formación de brechas.
- Investigación Translacional: Relaciona el método con la continuidad preclínica o la alineación de biomarcadores solo cuando la fuente lo respalda, vinculando eventos de exfoliación intravital con un mayor daño histológico y una mayor permeabilidad al FITC-dextrano en modelos de eliminación condicional.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable en lugar de una técnica de uso único, enfatizando su aplicabilidad a otros procesos celulares altamente dinámicos en diversos tejidos más allá de la mucosa intestinal.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo y decisiones de avance.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados necesarios en microscopía intravital, preparación quirúrgica e imágenes confocales.
- Requisitos de infraestructura instrumental y analítica, incluyendo microscopio confocal de barrido láser, objetivos adecuados (20X/40X) y capacidades de adquisición secuencial.
- Requisitos de estandarización entre equipos para protocolos de tinción (acriflavina y dextrano de rodamina-B), configuración de Z-stacks y parámetros de lapso de tiempo.
- Consideraciones de adaptación en diferentes sistemas modelo, incluyendo cepas con reporteros transgénicos y modelos de eliminación condicional para análisis específicos por tipo celular.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la bibliografía: las propiedades ópticas del tejido, la tecnología de imagen y la configuración del microscopio determinan la distancia de trabajo y la resolución.
