Name: Desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para Clostridioides difficile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo de infección larval en pez cebra con Clostridioides difficile mediante microinyección y microgavage no invasivo. Este método permite estudiar la respuesta inmune innata contra patógenos anaerobios en vivo.

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Estamos agradecidos a Timo Fritsch por su excelente cuidado animal. Agradecemos a los miembros de los laboratorios de Koster y Steinert el apoyo y las discusiones útiles. Agradecemos al Dr. Dandan Han por leer críticamente el manuscrito. Agradecemos la financiación del Estado Federal de Baja Sajonia, Nieders-chsisches Vorab (VWZN2889).

Todo el trabajo animal descrito aquí se realizó de acuerdo con las regulaciones legales (DIRECTIVA UE 2010/63, licencia AZ 325.1.53/56.1-TUBS y licencia AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Preparación de agarosa de baja fusión, placa de gel y agujas de microinyección/microgavage
<ol><li>Disolver 0,08 g de agarosa de baja fusión(Tabla de materiales, agarosa A2576) en 10 ml del medio de Danieau al 30% (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, HEPES de 1,5 mM (pH a 7,2) y 17,4 mM de NaCl, almacenados a temperatura ambiente (RT) para obtener una solución del 0,8%. NOTA: Se pueden utilizar concentraciones más altas o más bajas de agarosa. Sin embargo, el tiempo necesario para solidificar varía para diferentes marcas de agarosa, incluso en la misma concentración.</li>
	<li>Preparar agujas de microinyección y microvaage a partir de capilares de vidrio(Tabla de materiales).<ol>
<li>Utilice un tirador de micropipetas con los siguientes ajustes (tenga en cuenta que las unidades son específicas del tirador utilizado aquí; véase Tabla de materiales):agujas de microinyección (presión de aire 500; calor a 400; tirar a 125; velocidad a 75; tiempo a 150); y agujas de microvalamiento (presión de aire 500; calor a 400; tirar a 100; velocidad de 75; tiempo a 150). Utilice una punta de microcargador para cargar 3 l de H2O sin nucleasas en la aguja tirada.</li>
		<li>Introducir la aguja en el inyector y fijarla correctamente. Ajuste la aguja a un ángulo adecuado para la inyección. Ajuste la presión de inyección entre 600-900 hPa para la aguja de microinyección y 200–300 hPa para la aguja de gavage.</li>
		<li>Coloque una gota de aceite mineral en el círculo negro de la diapositiva de calibración. Utilice fórceps finos para sujetar la punta de la aguja. Inyecte una gota en el aceite mineral para medir el tamaño de la gota.</li>
		<li>Para la microinyección, ajuste el tiempo de inyección para obtener una gota con un diámetro de 0,10–0,12 mm, lo que equivale a un volumen de 0,5–1,0 nL. Para microvago, obtenga una gota con un diámetro de 0,18–0,20 mm, lo que equivale a un volumen de 3-5 nL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una placa de agarosa del 1,5 % con agarosa(Tabla de materiales,8050) en una placa Petri de 10 cm en un medio de Danieau al 30% utilizando un molde de plástico como molde de microvaage. Conservar a 4oC para evitar la desecación hasta que sea necesario. Caliente a RT o 28 oC antes del experimento.</li>
</ol>2. Preparación y etiquetado de C. difficile y esporas con tinte fluorescente
<ol><li>Preparar una solución de 1 mM de un tinte fluorescente (Tabla de materiales). Debido a que el tinte se vende en alícuotas de 50 g de polvo, añadir 69 ml de DMSO al vial para obtener una concentración de stock de 1 mM.</li>
	<li>Preparar una solución de trabajo de 100 m del tinte fluorescente añadiendo 2 ml de solución de material de 1 mM a 18 ml de DMSO en un tubo de centrífuga, y mezclar bien.</li>
	<li>Cultivo C. difficile (R20291, una cepa ribotipo 027) inoculando 10 ml de medio líquido BHIS con dos a tres colonias de una placa en una campana anaeróbica sin agitar durante la noche. BHIS es BHI complementado con 0.5% (p/v) Extracto de levadura y 0.1% (w/v) L-cisteína. Disolver 1 g de L-cisteína en 10 ml de ddH2O y esterilizar por filtración, luego añadir al medio autoclave para obtener una concentración final de 1 g/L. Las placas se preparan añadiendo 15 g/L agar-agar-agar al medio antes de la autoclave. El cultivo selectivo de C. difficile se realiza mediante el uso de placas cromólicas C. difficile (Tabla de materiales).</li>
	<li>Mancha c. difficile con el tinte fluorescente<ol>
<li>Cosecha C. difficile a una OD600 de 1.0–1.2 y lavar 1x con 1 mL de 1x PBS (5.000 x g durante 3 min a RT). Resuspender en 1 mL de 1 x PBS.</li>
		<li>Añadir 3 ml de solución de trabajo del tinte fluorescente en 1 ml de suspensión bacteriana. Incubar la muestra durante 15 minutos a RT en la oscuridad. Lavar el C. difficile teñido una vez con 1 ml de PBS para eliminar el tinte residual y resuspender en 1x PBS a una DoT600 de 1.0 (1.0 OD600 es aproximadamente equivalente a 108 cfu/ml).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Inyección de C. difficile manchado en larvas de pez cebra
<ol><li>Anestetizar 20–30 larvas de pez cebra a los 5 días posteriores a la fertilización (referido aquí como 5 dpf) con 0.02% –0.04% tricaína (polvo de tricaína se disuelve en agua de doble destilación y se ajusta al pH 7 con 1 M Tris-HCL solución) en 30% medio de Danieau 10 min antes Inyección. Transfiere las larvas anestesiadas a un plato Petri fresco de 10 cm y elimina cualquier exceso del medio de Danieau.</li>
	<li>Coloque una gota de agarosa baja de fusión del 0,8% sobre las larvas del pez cebra para cubrir. Ajuste suavemente las larvas a una posición lateral. Coloque la placa Petri sobre hielo durante 30-60 s para permitir que la baja agarosa de fusión se solidifique. Añadir 30% medio de Danieau que contiene 0.02%–0.04% tricaína para cubrir la agarosa.</li>
	<li>Prepare la solución de inyección. Añadir 1 l de 0,5% de color rojo fenol en solución de PBS en 9 l del inóculo de C. difficile teñido de tinte para visualizar el proceso de inyección.</li>
	<li>Cargue una aguja de microinyección calibrada con la solución de inyección utilizando un microcargador. Monte la aguja cargada en un micromanipulador y colóquela bajo un estereomicroscopio.</li>
	<li>Ajuste la presión de inyección entre 600–900 hPa. Establezca el tiempo de inyección en 0,1–0,3 s para obtener 0,5–1,0 nL. Ajuste la aguja en el micromanipulador en un ángulo de 45o apuntando hacia las larvas incrustadas.</li>
	<li>Coloque la punta de la aguja por encima del tracto gastrointestinal cerca del poro urogenital. Perforar a través de agarosa entonces el músculo con la punta de la aguja, a continuación, insertarlo en el lumen intestinal e inyectar 0.5–1.0 nL de C. difficile. Utilice un microscopio de fluorescencia para monitorear las larvas inyectadas y recoger las larvas inyectadas correctamente para obtener imágenes confocales.</li>
</ol>4. Generación de larvas gnotobióticas de pez cebra
<ol><li>Utilice el método de reproducción natural bien establecido para generar embriones de pez cebra gnotobióticos, incluyendo: fertilización in vitro, lavado con medio que contenga antibióticos (1 g/ml de anfotericina B, kanamicina de 10 g/ml y ampicilina de 20 g/ml), lavado con solución de pirrolidona-yodo de polivinilo de 1,1% wt/vol, e incubación de embriones en un campana de cultivo celular12.</li>
	<li>Mantener todas las larvas de pez cebra gnotobiótico en condiciones gnotobióticas hasta 5 dpf o justo antes del gavage. Después del gavage, las larvas de pez cebra serán transferidas a una incubadora estándar pero con un medio estéril del 30% de Danieau.</li>
</ol>5. Gavage de larvas de pez cebra
<ol><li>Calibre la aguja de microgavage como se describe en el paso 1.2.</li>
	<li>Mida el diámetro de la punta de la aguja colocando la aguja en un portaobjetos de calibración con una gota de aceite mineral. Asegúrese de que la punta tenga un diámetro de 30-40 m, contundente y lisa. Deseche las agujas afiladas o ásperas. NOTA: Los bordes afilados de las agujas se pueden atenuar mediante llamas rápidas.</li>
	<li>Prepare la solución de gavage como se describe en el paso 3.3.</li>
	<li>Cargue y monte la aguja en un micromanipulador como se describe en el paso 3.4. Ajuste el micromanipulador para colocar la aguja en un ángulo de 45o.</li>
	<li>Anestetizar las larvas de pez cebra mencionadas en el paso 3.1. Cuando las larvas dejen de moverse, transfiéralas a la ranura de un molde de microvalaje utilizando una pipeta Pasteur.</li>
	<li>Coloque una gota de agarosa baja de fusión del 0,8% sobre las larvas del pez cebra para cubrir. Ajuste suavemente las larvas con las cabezas orientadas hacia arriba en ángulos de 45o en la ranura y las colas contra la pared de la ranura. Asegúrese de que los ángulos de las cabezas sean aproximadamente los mismos para que estén alineados con el ángulo de las agujas de gavage. Colocar el molde de microgavage sobre hielo durante 30-60 s, permitiendo que la baja agarosa de fusión se solidifique para estabilizar las posiciones de las larvas.</li>
	<li>Ajuste la presión de inyección entre 200–300 hPa. Establezca el tiempo de inyección en 0.1–0.3 s para obtener un volumen de inyección de 3–5 nL de C. difficile.
</li>
	<li>Operar suavemente la aguja a través de la agarosa y luego en la boca de larvas de pez cebra, a través del esófago. Una vez que la punta de la aguja está dentro del bulbo intestinal anterior, presione el pedal de inyección para liberar la bacteria. Llene el lumen del intestino con el volumen entregado. No deje que se desborde del esófago o cloaca. Retire suavemente la aguja de la boca del pez cebra.</li>
	<li>Después de la gavage, rescata las larvas de pez cebra infectadas de la agarosa con una punta de microcargador flexible cortando primero la agarosa y luego levantando las larvas. Transfiere estas larvas al medio estéril del 30% de Danieau. Enjuague las larvas en un medio estéril dos veces. Transfiera las larvas a un plato Petri fresco de 10 cm. Las larvas se mantendrán hasta 11 dpf.</li>
</ol>6. Análisis de microscopía confocal de larvas de pez cebra inyectadas
<ol><li>Anestetizar las larvas de pez cebra referida al paso 3.1. Haga un agujero en la parte inferior de una placa Petri de 35 mm con un portaobjetos de vidrio unido al orificio, conocido como la cámara de imágenes. Transfiera embriones a la parte inferior de la cámara de imágenes con una cantidad adecuada del 30% del medio de Danieau.</li>
	<li>Añadir de 200 a 300 l de agarosa de fusión baja al 1% para cubrir las larvas anestesiadas. Puesto que se utiliza un microscopio confocal invertido, coloque la región infectada de las larvas contra el portaobjetos de vidrio lo más cerca posible.</li>
	<li>Deje que la agarosa se solidifique en hielo durante 30-60 s. Sumerja la agarosa con 30% de Danieau que contiene 0.02%–0.04% tricaína.</li>
	<li>Imagen de las larvas con un microscopio de escaneo láser confocal (Tabla de Materiales).</li>
</ol>7. Disección del intestino larvario de peces cebra para recuperar Viable C. difficile
<ol><li>Aislar los tracto gastrointestinales de las larvas para analizar la carga bacteriana. Comience por eutanasia larvas de pez cebra con 0,4 % de tricaína.</li>
	<li>Enjuague brevemente el pez cebra con 1x PBS estéril y transfiéralo a una placa de agarosa fresca.</li>
	<li>Disección de peces cebra<ol>
<li>Inserte una aguja en el tronco dorsal de larvas de pez cebra cerca de la cabeza para inmovilizar al pez cebra. Retire la cabeza detrás de las branquias con una lanceta.</li>
		<li>Inserte la segunda aguja en el centro del tronco dorsal. Inserte la tercera aguja en el abdomen del pez cebra y extraiga el intestino de la cavidad corporal. NOTA: Se necesita un cuidado extremo para aislar el intestino intacto. Si es difícil hacerlo, realice extracciones adicionales para separar el resto del intestino de los órganos internos restantes.</li>
		<li>Utilice una aguja de microinyección para transferir de 10 a 15 intestinos a un tubo de 1,5 ml que contenga 200 ml estériles de 1 x PBS.</li>
		<li>Homogeneizar los intestinos con un pestillo para interrumpir el tejido y preparar homogeneiza. Asegúrese de que el pestillo llegue a la parte inferior del tubo para interrumpir todos los intestinos por completo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar los homogenates en C. difficile medio de cría que contiene D-cicloserina y cefoxitina, con o sin taurochola (TCA, un germinante de C. difficile esporas) en una cámara anaeróbica.</li>
	<li>Incubar la placa anaeróbicamente durante 48 h a 37oC.</li>
	<li>Utilice el cultivo bacteriano para 16S rRNA-PCR.<ol>
<li>Resuspender una colonia en 50 oL de H2O y hervirla a 95 oC durante 15 minutos. Pellet los restos de levas por centrifugación (14.000 rpm durante 2 min a RT) y utilizar 2 l del sobrenadante como plantilla en 25 éL de reacción PCR utilizando C. difficile-específico sillas (Cdiff16Sfw: 5' GTG Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').</li>
		<li>Cuando se utilizan bacterias de cultivo líquido, cosechar 1 ml de cultivo y lavar una vez con 1 ml de PBS (14.000 rpm durante 2 min en RT). Resuspenda el gránulo en 100 ml de H2Odd y trate como se ha hecho anteriormente. Para caracterizar aún más las colonias bacterianas, raya en una placa BHIS o cromoID(Tabla de Materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos presentados modifican y amplían un enfoque existente para infectar las larvas de peces cebra mediante la realización de inyección y microvaage10,14. También demuestra un enfoque para estudiar patógenos anaeróbicos con larvas de peces cebra22. Además, el protocolo facilita el análisis de las respuestas innatas de las células inmunitarias in vivo sobre el CDI y sobre la colonización de C. difficile en el pez cebra. El mé...

C. difficile es un bacilo grampositivo, formador de esporas, anaeróbico y productor de toxinas que es la principal causa de infecciones graves en el tracto gastrointestinal1. Los síntomas típicos de la ICD incluyen diarrea, dolor abdominal y colitis pseudomembranosa fatal, y a veces puede llevar a la muerte1,2. La evidencia ha demostrado que las respuestas inmunitarias del huésped desempeñan un papel crítico tanto en la progresión como en el resultado de esta enfermedad3. Además de la respuesta inmunitaria, la microbiota intestinal autóctona es crucial para la aparición y la patogénesis de la CDI4. En la última década, tanto el número de casos como la tasa de mortalidad de la CDI han aumentado significativamente debido a la aparición de una cepa hipervirulenta de C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Una mejor comprensión de los mecanismos inmunitarios subyacentes y el papel de la microbiota durante la CdC ayudará a dar lugar a nuevos desarrollos y avances terapéuticos, lo que permitirá un mejor control de esta epidemia.
Varios modelos animales, como el hámster y el ratón, se han desarrollado para proporcionar una visión de la defensa inmune contra C. difficile7,8. Sin embargo, el papel de las células inmunitarias innatas todavía se entiende mal, particularmente porque el comportamiento innato de las células inmunitarias se deriva principalmente del análisis histológico o de las células cultivadas in vitro. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo transparente de pez cebra para revelar la respuesta inmune innata a C. difficile dentro de un organismo vertebrado vivo facilitará tales estudios. Las larvas de peces cebra tienen un sistema inmunitario innato funcional, pero carecen del sistema inmunitario adaptativo hasta 4-6 semanas después de la fertilización9. Esta característica única hace que las larvas de pez cebra sean un excelente modelo para estudiar la respuesta aislada y la función de las células inmunitarias innatas en la ICD.
Este informe describe nuevos métodos que utilizan larvas de peces cebra para estudiar las interacciones entre C. difficile y las células inmunitarias innatas, como macrófagos y neutrófilos. En primer lugar, se presenta un protocolo de microinyección localizado que incluye C. difficile inoculum y tinción. Utilizando imágenes confocales in vivo de lapso de tiempo, se registra la respuesta de neutrófilos y macrófagos hacia el sitio de la infección, y se observa la fagocitosis de bacterias por neutrófilos y macrófagos. Sin embargo, se ha informado de que la inyección en sí causa daño tisular y conduce al reclutamiento de leucocitos independientes de la bacteria10. Por lo tanto, posteriormente se describe un protocolo de microgavage no invasivo para administrar C. difficile en el intestino de las larvas de peces cebra. Estudios anteriores han demostrado que la microbiota gastrointestinal indígena protege a un huésped contra la colonización de C. difficile11. Por lo tanto, las larvas de pez cebra gnotobióticas también se utilizan para predisponer el pez cebra que están infectados 12. Después, la disección intestinal se realiza para recuperar la C. difficile viable y validar la duración de su presencia en los tracto intestinales del pez cebra.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td>Agarosa gelificante ultra baja</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión (LM)</td><td>Pronadisa</td><td>8050</td><td>Se utiliza en placas de agarosa</td></tr><tr><td>BacLight Tinción bacteriana roja</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35001</td><td>Colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Caldo de infusión cerebro-corazón</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X916.1</td><td></td></tr><tr><td>Latón (tipo salvaje)</td><td></td><td></td><td>deficiente en la síntesis de melanina, utilizada para generar líneas transgénicas estables</td></tr><tr><td>Nitrato de calcio (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio capilar</td><td>Aparato Harvard</td><td>30-0019</td><td>Agujas de inyección</td></tr><tr><td>Clostridioides difficile</td><td></td><td></td><td>R20291,, una cepa del ribotipo 027, producción de TcdA+/TcdB+/CDT+</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A994</td><td></td></tr><tr>Plataforma <td></td><td>de código abierto</td><td>FIJI</td><td>Procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de agujas horizontal</td><td>Sutter instrument Inc</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica</td><td></td><td>Procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P026</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>eppendorf</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de microinyección Herramientas</td> de <td>ciencia adaptativa</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Leica SP8</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Taurocolato</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8149</td><td></td></tr><tr><td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td>línea transgénica estable en la que los promotores lyZ impulsan la expresión de la proteína fluorescente EGFP en los neutrófilos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td></td><td></td><td>línea transgénica estable en la que los mpeg1.1 impulsan la expresión de la proteína fluorescente EGFP en macrófagos</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD Bacto</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para clostridioides difficile

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infección (CDI) se considera una de las infecciones gastrointestinales más comunes asociadas a la atención médica en los Estados Unidos. Se ha descrito la respuesta inmune innata contra C. difficile, pero se entienden menos los roles exactos de los neutrófilos y los macrófagos en la CDI. En el estudio actual, las larvas de Danio rerio (pez cebra) se utilizan para establecer un modelo de infección por C. difficile para tomar imágenes del comportamiento y la cooperación de estas células inmunitarias innatas in vivo. Para monitorear C. difficile, se ha establecido un protocolo de etiquetado utilizando un tinte fluorescente. Una infección localizada se logra mediante microinyección etiquetada C. difficile, que crece activamente en el tracto intestinal del pez cebra e imita el daño epitelial intestinal en CDI. Sin embargo, este protocolo de infección directa es invasivo y causa heridas microscópicas, que pueden afectar los resultados experimentales. Por lo tanto, aquí se describe un protocolo de microgavage más no invasivo. El método consiste en la entrega de células C. difficile directamente en el intestino de las larvas de peces cebra por intubación a través de la boca abierta. Este método de infección imita de cerca la ruta de infección natural de C. difficile.

C. difficile es estrictamente anaeróbico, pero el cromóforo de las proteínas fluorescentes generalmente requiere oxígeno para madurar. Para superar este problema, se utilizó un tinte fluorescente para manchar las células vivas de C. difficile que estaban creciendo activamente (R20291, una cepa ribotipo 027; Figura 1A). Utilizando el sistema Gal4/UAS, se generaron líneas estables transgénicas de peces cebra para imágenes en vivo, en las que los promotores <e...

Aquí se presenta un método seguro y eficaz para infectar las larvas de pez cebra con C. difficile anaeróbico etiquetado fluorescentemente por microinyección y microvago no invasivo.

Desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Este método puede responder a la pregunta clave sobre el papel del sistema inmunitario innato en la infección por Clostridium, como si y cómo los macrófagos reconocen o fagocitos de este patógeno. La principal ventaja de este método es que se puede aplicar a muchas bacterias anaeróbicas diferentes, que el tiempo de infección puede ser manipulado, y que la administración oral representa la infección humana normal mucho más cerca. Después del cultivo, transfiera un mililitro del cultivo a una cubeta espectrofotómetro, y mida el OD600.Transfiera la cantidad requerida a un tubo fresco de 1,5 mililitros para alcanzar un OD final de uno a 1,2 en un mililitro de volumen final. Lave una vez con un mililitro de 1X PBS y centrifugar a 5.000 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Resuspend en un mililitro de 1X PBS.Añadir tres microlitros de solución de trabajo del tinte fluorescente preparado en la suspensión bacteriana de un mililitro. Incubar la muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de eso, lavar el Clostridioides difficile manchado una vez con 1X PBS para eliminar el tinte residual, y resuspend en un mililitro de 1X PBS para lograr un OD600 de 1.0.En primer lugar, coloque una gota de 0,8% de agarosa de baja fusión sobre las larvas de pez cebra en un plato de Petri para cubrir. Ajuste suavemente las larvas a una posición lateral. Coloque el plato Petri sobre hielo durante 30 a 60 segundos para permitir que la agarosa de bajo derretimiento se solidifique.Añadir 30%Danieau medio que contiene 0.02%a 0.04%tricaína para cubrir la agarosa. Para preparar la solución inyectable, añada un microlitro de 0,5% rojo fenol en solución PBS en nueve microlitros del inóculo Clostridioides difficile teñido con tinte. Cargue una aguja de microinyección calibrada con la solución de inyección utilizando un microcargador.Monte la aguja cargada en un micromaniprógrafo y colóquela bajo un microscopio estéreo. Ajuste la presión de inyección entre 600 y 900 hectopascales. Ajuste el tiempo de inyección en 0,1 a 0,3 segundos para obtener nanolitros de 0,5 a 1,0.Ajuste la aguja en el micromaniprógrafo en un ángulo de aproximadamente 45 grados, apuntando hacia las larvas incrustadas. Coloque la punta de la aguja por encima del tracto gastrointestinal, cerca del poro urogenital. Perforar a través de la agarosa, luego el músculo con la punta de la aguja.A continuación, insértelo en el lumen intestinal e inyecte de 0,5 a 1,0 nanolitros de Clostridioides difficile. Utilice un microscopio de fluorescencia para monitorear las larvas inyectadas, y utilice una punta flexible de Microfúnte para recoger las larvas inyectadas correctamente para obtener imágenes confocales. En una placa de agarosa del 1,5% con ranuras, coloque una gota de 0,8% de agarosa de baja fusión sobre las larvas de pez cebra para cubrir.Ajuste suavemente las larvas con las cabezas orientadas hacia la erguida en ángulos de 45 grados en la ranura y las colas contra la pared de la ranura. Operar suavemente la aguja a través de la agarosa, luego en la boca de las larvas de pez cebra, a través del esófago. Una vez que la punta de la aguja está dentro de la bombilla intestinal anterior, presione el pedal de inyección para liberar 0.5 a una nanolitros de cultivo de bacterias.Llena el lumen del intestino. No deje que se desborde del esófago o cloaca. Retire suavemente la aguja de la boca del pez cebra.Después de la gavage, rescatar las larvas de pez cebra infectadas de la agarosa con una punta flexible de Microloader cortando primero la agarosa, luego levantando las larvas. Transfiera estas larvas al medio estéril de 30%Danieau y enjuague dos veces. Después de anestesiar las larvas de pez cebra, agregue de 200 a 300 microlitros de 1% de agarosa de bajo derretimiento para cubrir las larvas anestesiadas.Coloque la región infectada de las larvas contra un tobogán de vidrio lo más cerca posible. Deje que la agarosa se solidifique sobre hielo durante 30 a 60 segundos. Sumerja la agarosa en el medio de Danieau al 30%que contiene 0,02% a 0,04%tricaína.Proceda a la imagen de las larvas con un microscopio de escaneo láser confocal. Después de eutanasiar las larvas de pez cebra infectadas, inserte una aguja en el tronco dorsal de las larvas de pez cebra cerca de la cabeza para inmovilizar el pez cebra. Retire la cabeza detrás de las branquias con una lanceta.Inserte una segunda aguja en el centro del tronco dorsal. Inserte una tercera aguja en el abdomen del pez cebra y extraiga el intestino de la cavidad corporal. Utilice una aguja de microinyección para transferir de 10 a 15 intestinos a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de 1X PBS estéril.Homogeneizar los intestinos con un peste para interrumpir el tejido y preparar homogeneizaciones. Asegúrese de que el pestillo llegue al fondo del tubo para interrumpir todos los intestinos por completo. En los homogeneizas, añadir Clostridioides difficile medio de cría que contenga ciclonestrina D y cefoxitina, con o sin taurocholato, e incubar en una cámara anaeróbica.En este estudio, tanto los neutrófilos como los macrófagos llegan a los sitios de infección. El ejemplo de un fagocito de macrófago activado que fagoticiona dos bacterias muestra la limpieza por fagocitosis y la digestión de la etiqueta Clostridioides difficile. El microgavage para entregar Clostridioides difficile con etiqueta de fluorescencia en el lumen intestinal de las líneas de reportero de macrófagos y neutrófilos a los cinco días después de la fertilización imita el camino natural de la infección por Clostridioides difficile.Sin embargo, los neutrófilos y macrófagos no mostraron una migración obvia al tracto gastrointestinal hasta 12 horas después del microgage. Mientras tanto, la fluorescencia de la etiqueta Clostridioides difficile desapareció después de unas cinco horas después de la microgavage. Las muestras intestinales 24 horas después de la infección fueron diseccionadas y mostraron crecimiento bacteriano.No creció ninguna bacteria en el grupo de control. En puntos posteriores, las muestras incubadas sólo crecían en el medio que contenía TCA, lo que sugiere que el total de Clostridioides difficile en el intestino había formado esporas. 16S rDNA PCR identificó la bacteria cultivada como Clostridioides difficile, que produce ampecados específicos de PCR de tamaño predecible alrededor de 800 pares de bases.Los cultivos de bacterias cultivados en una placa CHROMID aparecieron como colonias negras típicas, lo que indicó además que las bacterias de los intestinos del pez cebra eran Clostridioides difficile. Trabajar con bacterias anaeróbicas requiere que los pasos aeróbicos se mantengan cortos porque eso influye en la biología de las bacterias, por supuesto. La célula inmune innata en el pez cebra puede ser manipulada.Por ejemplo, pueden descifrar el mecanismo de las respuestas innatas de las células inmunitarias a la infección. Nuestro método indicó que el pez cebra puede ser una herramienta para estudiar el patógeno anaeróbico del intestino humano. Trabajar con patógenos multirresistentes requiere que se tomen las medidas de seguridad adecuadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales...

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la...

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

Fuente: Li, J. et al. Desarrollo de un modelo de infección por larvas de pez cebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la administración basada en microinyección de Clostridioides difficile marcado con fluorescencia en la luz intestinal de una larva de pez cebra anestesiada. Describe los pasos involucrados en la preparación de larvas, la inyección bacteriana y la confirmación basada en microscopía de fluorescencia de la localización bacteriana dentro del...

Suministro localizado de bacterias en la luz intestinal de una larva de pez cebra mediante microinyección

Fuente: Li, J., et. al., Desarrollo de un modelo de infección de larvas de pez cebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el aislamiento y cultivo de la bacteria Clostridioides difficile del intestino de las larvas de pez cebra. El intestino infectado se disecciona, homogeneiza e incuba en medios anaeróbicos selectivos que contienen antibióticos. Estas condiciones suprimen los microbios competidores y promueven el crecimiento de células viables.

Aislamiento y cultivo de bacterias Clostridioides difficile a partir de larvas de intestino de pez cebra

Fuente: Flores, E., et al. Utilizando el protozoo Paramecium caudatum como vehículo para infecciones alimentarias en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demuestra el método para establecer un modelo de infección intestinal bacteriana transmitida por alimentos en larvas de pez cebra, alimentándolas con paramecia infectada con E. coli fluorescente.

Modelado de la infección intestinal en larvas de pez cebra utilizando bacterias transmitidas por alimentos

Fuente: Winston, J. A., et al. Modelo murino tratado con cefoperazona de la cepa clínicamente relevante de Clostridium difficile R20291.  J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo muestra el procedimiento para inocular ratones pretratados con antibióticos con esporas de Clostridium difficile para establecer un modelo murino de infección que estudie la patogénesis y las respuestas del huésped.

Establecimiento de un modelo murino de infección por Clostridium difficile

Fuente: Li, J., et al. Desarrollo de un modelo larvario de infección por peces cebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo muestra el procedimiento de microgavage, en el que una larva de pez cebra anestesiada es inmovilizada en agarosa e inyectada oralmente con una bacteria patógena usando una aguja guiada por trazadores. El parto no invasivo imita la infección natural, permitiendo analizar la replicación bacteriana, la liberación de toxinas y el daño epitelial...

Desarrollo de un modelo de infección larvaria de pez cebra usando microgavage

Las interacciones espacio-temporales in vivo del patógeno y las defensas inmunitarias a nivel de la mucosa no se visualizan fácilmente en los huéspedes vertebrados existentes. El método presentado aquí describe una plataforma versátil para estudiar la candidiasis de la mucosa en vertebrados vivos utilizando la vejiga natatoria del pez cebra juvenil como sitio de infección.

Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

Los embriones de pez cebra ópticamente transparentes se utilizan ampliamente para estudiar y visualizar en tiempo real las interacciones entre los microorganismos patógenos y las células inmunitarias innatas. La microinyección de Mycobacterium abscessus, combinada con imágenes de fluorescencia, se utiliza para examinar las características patógenas esenciales, como la formación del cordón en los embriones de pez cebra.

Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; En embriones de pez cebra

Este protocolo se describe el modelo de ratón cefoperazona de la infección por Clostridium difficile (CDI), utilizando una cepa clínicamente relevante y genéticamente manejable, R20291. Énfasis en el seguimiento clínico de la enfermedad, C. difficile enumeración bacteriana, la citotoxicidad de la toxina, y los cambios histopatológicos en todo CDI en un modelo de ratón se detalla en el protocolo.

Cefoperazona tratados modelo de ratón clínicamente relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

El presente estudio describe un modelo de embrión de pez cebra para visualización in vivo y análisis intravital de infecciones asociadas a biomateriales en el tiempo basado en microscopía de fluorescencia. Este modelo es un sistema prometedor complementando modelos animales mamíferos como los modelos de ratón para el estudio de las infecciones asociadas a biomateriales en vivo.

Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

Aprende a desarrollar un modelo de infección larval en pez cebra con Clostridioides difficile mediante microinyección y microgavage no invasivo. Este método permite estudiar la respuesta inmune innata contra patógenos anaerobios en vivo.

Desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para Clostridioides difficile

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