Name: Corrección de alta precisión de los cambios cromáticos 3D en la era de las imágenes biológicas de superresoría utilizando Chromagnon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprende a corregir desplazamientos cromáticos 3D en imágenes de microscopía de superresolución utilizando el software Chromagnon con células HeLa. Este método mejora la precisión del análisis de colocalización en biología.

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Este estudio fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 a A.M., JP18H05528 y JP17H03636 a T.H., y JP17H01444 y JP18H05533 a H.Y. L.S. reconoce el apoyo de los Premios Estratégicos de Welcome Trust 091911 y 107457/Z/15/Z financiando imágenes avanzadas en Micron Oxford.

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<li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li>
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<li>Grünwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+%CE%B2-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li>
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<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-Field+Optical+Nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li>
<li>Müller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Scanning+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101(1981).</li>
<li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li>
<li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerin%2C+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy%2C+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li>
<li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li>
<li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li>
<li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento de corrección cromática es un equilibrio entre precisión y esfuerzo. Para ahorrar esfuerzos ins intrépidos, es mejor saber cuánta precisión se requiere para su estudio. La mayor precisión puede no ser necesaria para las imágenes convencionales de campo ancho (en vivo) y, por lo tanto, las imágenes de referencia de campo brillante a menudo son suficientes para corregir el desplazamiento cromático. Del mismo modo, cuando la condición de imagen y el entorno son constantes, el uso repetido de una calibración biológica ahorrará tiempo. Por otro lado, si se desea un registro muy preciso, se necesitan imágenes de referencia de calibración biológica o de conversación de alta calidad. Para obtener el mejor rendimiento, las imágenes de referencia deben obtenerse con las condiciones y los tiempos más similares posibles a las imágenes de destino. Siempre y cuando las imágenes de referencia y de destino se obtengan mediante la misma microscopía, una resolución espacial más alta mejorará la precisión de la corrección. Si la desconvolución está disponible para las imágenes de referencia y de destino, implementar esto antes de la corrección puede mejorar la precisión de corrección. Además, para obtener el mejor rendimiento, el teorema de muestreo para el eje óptico (Z) debe cumplirse tanto en el archivo de referencia como en el de destino para una interpolación precisa de subpíxeles (paso 2.1.3 del protocolo).
La falta de corrección del cambio cromático conduce a conclusiones incorrectas. Además, el uso de una calibración incorrecta puede incluso empeorar los cambios cromáticos en lugar de corregirlos, por lo que es necesario evitarlos. Hemos resumido las posibles causas de los fallos y sus soluciones comunes en el Cuadro 2. Para examinar la causa de un fallo, en primer lugar, es necesario comprobar visualmente si el desplazamiento cromático en la imagen de referencia se corrige con precisión (paso 3.12 del protocolo). La mayoría de los fallos se deben a la calidad de las imágenes de referencia y se corrigen fácilmente según las descripciones del Cuadro 2. En cuanto a la calidad de las imágenes de referencia, es importante tener en cuenta que la precisión de la alineación global disminuye si todo el campo de visión no se rellena con la muestra (Figura 7, Tabla 2). En comparación con el buen ejemplo que se muestra en la Figura 7A,el mal ejemplo que se muestra en la Figura 7B contiene sólo tres sobres nucleares en la región superior izquierda, y Chromagnon no pudo alinear una parte de esta imagen. Esto se debe a que el método de alineación global de Chromagnon divide el campo de visión en cuatro regiones (Figura 7C) con el fin de medir las diferencias en rotación y ampliación con alta precisión3. Este método, si se opera correctamente, es un orden más preciso que otros métodos lineales como la transformación polar de registro y los métodos simplex3. Si alguna de las cuatro regiones no está disponible, Chromagnon cambiará a métodos lineales menos eficaces. Por lo tanto, para obtener el mejor rendimiento, los ejemplos que se muestran en la figura 7B y la figura 7C no son deseables y las cuatro regiones deben rellenarse con objetos. Los usuarios pueden comprobar si alguna región cuadrática del campo de visión no está disponible para la medición mirando el archivo de registro ("Chromagnon.log"; consulte el paso de protocolo 3.10). Afortunadamente, este problema se puede superar fácilmente promediando varias imágenes de calibración biológicas o utilizando la alineación local para imágenes de referencia de campo brillante o de conversación(Tabla 2). Contrariamente al caso de no corregir las imágenes de referencia, la falta de corrección de las imágenes de destino es más difícil de identificar. Debido a que tales errores surgen debido a diferencias en los formatos de archivo, las condiciones de creación de imágenes, los tiempos de creación de imágenes, los métodos de imagen/alineación entre las imágenes de referencia y las imágenes de destino (Tabla 2), los usuarios siempre deben tener cuidado al utilizar imágenes de referencia que se obtienen en diferentes condiciones/timings de las imágenes de destino. Algunas imágenes de ejemplo están disponibles para pruebas (<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon</a>) para obtener una idea concreta de las imágenes de ejemplo buenas y malas.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema</td>
			<td>Causa</td>
			<td>Solución</td>
		</tr>
<tr>
<td>No se pudo corregir la imagen de referencia</td>
			<td>Bajo contraste</td>
			<td>Adquiera una imagen de mayor contraste si es posible. Si se utiliza una imagen de referencia de campo brillante, vuelva a adquirir la imagen en una solución a base de agua para obtener un mayor contraste de la celda. Alternativamente, intente aplicar la reducción de ruido computacional (por ejemplo, filtrado gaussiano). Desactive la alineación local, que es más sensible al ruido.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Contaminación de imágenes no relacionadas</td>
			<td>Elimine el origen de las imágenes no relacionadas en la muestra si es posible. Para las imágenes de referencia de conversación cruzada, compruebe los espectros de excitación de los tintes utilizados para las imágenes de destino. Si los tintes se excitan durante la adquisición de una imagen de crosstalk (por ejemplo, Alexa Fluor 568 o 594), considere otros tintes (por ejemplo, Alexa Fluor 555). Si los polvos en el chip de la cámara crean una diferencia de canal obvia, limpie el chip de la cámara o utilice un método de campo plano computacional.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Un punto extremadamente brillante hecho por un rayo cósmico</td>
			<td>Vuelva a adquirir la imagen si es posible. Alternativamente, intente aplicar la reducción de ruido computacional (por ejemplo, filtrado medio o gaussiano).</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Artefactos de desconvolución (señales artificiales en los bordes axial y lateral)</td>
			<td>Recorte los píxeles de borde o las secciones Z después de la desconvolución. Si se recorta un lado, el otro lado también debe recortarse para mantener el centro de la imagen.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>El tamaño del paso Z demasiado disperso</td>
			<td>Se debe adquirir una pila Z para cumplir con el criterio Nyquist tal como está escrito en el protocolo 2.1.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Aberración óptica</td>
			<td>La aberración esférica es la principal aberración causada por los usuarios. Elija el objetivo adecuado para la muestra y utilice un espesor de cubreobjetos de 170 m. Si el objetivo está equipado con un anillo de corrección, ajústelo para encontrar la posición donde se obtiene el recuento de fluorescencia más alto del enfoque. En el caso de un objetivo de inmersión en aceite sin anillo de corrección, ajuste el índice de refracción del aceite de inmersión que aumenta el recuento de fluorescencia en el foco.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>El campo de visión no se rellena (Fig. 7)</td>
			<td>En el caso de las imágenes de referencia de calibración biológica, promedia muchas imágenes. En el caso de imágenes de referencia de crosstalk o de campo brillante, utilice la alineación local.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Un error de software no identificado</td>
			<td>Informar del problema a través de GitHub<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">(https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>No se pudo corregir la imagen de destino</td>
			<td>Se pierden los metadatos del archivo de imagen</td>
			<td>Utilice el formato de archivo de microscopio original que contiene metadatos completos y evite convertir a un archivo tiff de varias páginas antes de procesar. Utilice el mismo orden de canales que se escribe en el protocolo 3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Métodos de alineación incorrectos para la microscopía dada</td>
			<td>No aplique el método de alineación local al medir desde imágenes de referencia de calibración biológica a imágenes de destino. No utilice imágenes de referencia de conversación cruzada que no sean microscopía de campo ancho.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Diferencias en las condiciones de imagen</td>
			<td>Mantenga constantes las condiciones de imagen entre la referencia y las imágenes de destino tal como están escritas en el protocolo 2.3.3.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Diferencias en la muestra (incluyendo coverslip)</td>
			<td>Utilice siempre el mismo medio de montaje, el cubreobjeto (p. ej., no 1.5H) y una profundidad de enfoque similar.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Deriva del microscopio desde la última vez que se realizó la calibración</td>
			<td>Realice una calibración tantas veces como cada dos semanas. Mantenga la temperatura constante y utilice una mesa flotante para evitar la deriva de hardware del microscopio.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Solución de problemas para la corrección cromática.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg"> Figura 7: Ejemplos de imágenes de referencia. Sobre nuclear en células de levadura de fisión etiquetadas con GFP y mCherry. Las imágenes se adquirieron con microscopía convencional de campo ancho. Los cambios cromáticos se corrigieron utilizando Chromagnon sin alineación local utilizando las propias imágenes como imágenes de referencia. Las imágenes se desconvolvieron para mostrar los detalles. (A) Un buen ejemplo con muchos objetos en el campo de visión. (B) Un mal ejemplo con objetos solo en la esquina superior izquierda. La desalineación es obvia en una determinada región de la imagen. (C) Un ejemplo no deseado donde uno de los cuadrisecciones (separados por líneas cruzadas punteadas) está vacío. La barra de escala en el panel A indica 5 m para la vista de campo completa y 1,25 m para la vista ampliada y es aplicable a todos los paneles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En este protocolo, describimos tres tipos de referencia diferentes (Tabla 1). Entre ellas, las imágenes de referencia de conversación cruzada y las imágenes de referencia de calibración biológica necesitan una discusión más cuidadosa. Para imágenes de referencia de interferencia, las muestras teñidas con DAPI o Hoechst 33342, y montadas en glicerol o medios de montaje comerciales se pueden utilizar eficientemente para alinear los canales azul, verde y rojo. Del mismo modo, Alexa Fluor 488 se puede utilizar para alinear los canales verde y rojo. Sin embargo, obtener fluorescencia de crosstalk es a menudo difícil ya que muchos tintes azules excepto DAPI y Hoechst son más tenues y decaen más rápido que la mayoría de los tintes verdes y rojos. Además, los espectros de emisión de los tintes modernos son más estrechos, lo que hace que la alineación de más de tres canales por este método sea un reto. También se debe prestar atención a algunos tintes rojos comunes (por ejemplo, Alexa Flour 568 y 594, pero no Alexa Fluor 555) que pueden ser excitados por la luz violeta, que impiden obtener imágenes cruzadas de alto contraste de tintes azules. Otro inconveniente es que este método no puede medir la aberración cromática de las trayectorias de luz de excitación en la excitación multicolor, porque sólo se utiliza una sola longitud de onda de excitación para la excitación (Tabla 1). Como la mayoría de la microscopía avanzada utiliza óptica de iluminación alterada, la aplicación de este método es limitada. Aún así, su mayor precisión de corrección es lo suficientemente ventajosa como para que se describa en este protocolo. En general, se debe tomar una imagen de conversación cruzada después de una imagen objetivo para evitar el blanqueo o los efectos fototóxicos. Para SMLM observado con el modo de campo ancho, se debe adquirir una imagen de referencia antes de adquirir una imagen de destino, ya que los tintes de fluorescencia se pueden blanquear durante la toma de imágenes.
Las imágenes de referencia de calibración biológica permiten a los usuarios alinear fácilmente cualquier número deseado de canales a costa de una preparación de muestra adicional. Otra ventaja de las imágenes de referencia de calibración biológica es la disponibilidad de múltiples referencias "promedio" que ayuda a rellenar todos los campos de visión. Este método puede sufrir diferencias en las condiciones de imagen si la muestra de calibración está preparada en una diapositiva diferente. La mayor parte de este problema se puede resolver si tanto los objetivos como las referencias se preparan en la misma diapositiva utilizando vidrios de cubierta con cámara comercial(Tabla 1),y otras condiciones de imagen se mantienen constantes como en el paso de protocolo 2.3.3. En este caso, se puede esperar una precisión de corrección similar a la de las imágenes de referencia de conversación cruzada3. El protocolo para utilizar faloideína como se muestra aquí es una de las maneras más fáciles de manchar una sola estructura celular con múltiples colores. Existen numerosos escenarios posibles para preparar muestras de calibración biológicas. Para la inmunosuchación, una muestra se puede etiquetar con un solo anticuerpo primario seguido de tinción con anticuerpos secundarios de múltiples colores. De este modo, una sola estructura de destino se puede etiquetar con varios colores. Alternativamente, 5-etilnyl-2'-deoxyuridine, detectado por "clic" etiquetas químicas recién sintetizado ADN en múltiples colores de alta densidad, como se describió en detalle anteriormente8. Para las células vivas, es útil preparar una cepa transgénica que contenga dos copias de un gen que se fusionan con GFP o mCherry para etiquetar la misma estructura con dos colores. Si el número de copia del gen es crítico como se observa a menudo para las proteínas de membrana, una sola copia del gen se puede fusionar en tándem con la GFP y mCherry (Figura 7). Las proteínas fluorescentes fotoconvertibles, como mEOS218,también se pueden utilizar iluminando un nivel moderado de luz violeta para obtener ambas especies proteicas con o sin fotoconversión. En condiciones de bajo oxígeno, GFP también se puede utilizar como una proteína fotoconvertible de verde a rojo19,20. La elección de la muestra de calibración correcta hará que el experimento sea más robusto.

La imagen multicolor es uno de los aspectos fundamentales de la microscopía de fluorescencia biológica, en los casos en que la relación espacial de diferentes moléculas o estructuras es de gran interés. La aberración cromática, una aberración óptica de la luz policromática causada por la dispersión, cambia la posición aparente de los objetos de color de interés. Del mismo modo, los microscopios equipados con múltiples cámaras dedicadas a adquirir cada color tienen cambios cromáticos más complejos debido a las diferencias en los elementos ópticos y la alineación imperfecta entre los canales. Por lo tanto, tales cambios cromáticos pueden conducir a una conclusión falsa a menos que el usuario lo corrija explícitamente. Aunque los cambios cromáticos no han sido un problema importante mientras la resolución de la microscopía esté limitada por el límite de resolución clásico, el reciente desarrollo de la microscopía de superresor resolución1 ha provocado la necesidad de una corrección más precisa de los cambios cromáticos.
Ha sido una práctica común medir los cambios cromáticos de los sistemas de microscopio utilizando una diapositiva de calibración de perlas multicolor2. El método de calibración basado en perlas es adecuado para medir los desplazamientos cromáticos de toda la óptica del microscopio hacia la superficie del cubreobjetos2. Este método, sin embargo, es incapaz de medir los cambios cromáticos en las muestras biológicas de interés. Es importante tener en cuenta que muchas muestras biológicas son tridimensionales (3D), y los cambios cromáticos de tales muestras son diferentes de los que se encuentran en la superficie del cubreobjetos. Además, los cambios cromáticos cambian con las condiciones de imagen2,,3. Hemos medido los cambios cromáticos en muestras biológicas 3D y hemos encontrado que la incertidumbre de los cambios cromáticos era a menudo hasta 350 nm por el método clásico de calibración multicolor-perla3. Por lo tanto, los cambios cromáticos deben medirse en muestras biológicas a la profundidad de interés y en las condiciones de imagen que se utilizan.
Aquí, describimos procedimientos para medir los cambios cromáticos en muestras biológicas y corregir estos cambios utilizando nuestro software, Chromagnon3. Para medir los cambios cromáticos en muestras biológicas, nuestro método utiliza dos tipos de conjuntos de datos, una imagen "objetivo" y una imagen de "referencia". La imagen "objetivo" es una imagen multicolor de interés, por ejemplo, imágenes manchadas para ADN, envolvente nuclear y microtúbulos. A menudo es imposible medir los cambios cromáticos en una imagen de este tipo. Por lo tanto, necesitamos una imagen de "referencia" que se dedique a medir los cambios cromáticos en la muestra. La única definición de una imagen de "referencia" es una imagen multicolor del mismo objeto. En este sentido, una imagen de cuentas multicolor también es un tipo de imagen de referencia. Aquí, describimos tres tipos diferentes de imagen de referencia que se utilizan para medir los cambios cromáticos en las muestras biológicas: "imágenes de referencia de habla cruzada", "imágenes de referencia de campo brillante" e "imágenes de referencia de calibración biológica". El tipo de imagen de referencia depende del tipo de microscopio utilizado o de la precisión de corrección requerida como se resume en la Tabla 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Diafonía</td>
			<td>Campo brillante</td>
			<td>Calibración biológica (en una diapositiva diferente)</td>
			<td>Calibración biológica (en la misma diapositiva)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Precisióna
</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b
</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Simplicidad</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microscopía aplicable</td>
			<td>Campo amplio</td>
			<td>Campo amplio</td>
			<td>todo</td>
			<td>todo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Disponibilidad de la alineación local</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c
</td>
			<td>-c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
a: El número de "+" indica un aumento de la calificación. Una sola ventaja es de aproximadamente 50 nm y tres más es de aproximadamente 15 nm en 3D. b: La precisión depende de cuánto se mantengan constantes las condiciones de imagen variables. c: La calibración local medida por muestras de perlas multicolores se puede combinar como se describe en la sección 4 del protocolo.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Parámetros al elegir el tipo de imágenes de referencia.
Las "imágenes de referencia de crosstalk" tienen la mayor precisión de corrección y son relativamente sencillas de lograr3,4 (Tabla 1). El inconveniente es su limitación en aplicaciones de microscopía debido a su incapacidad para medir los cambios cromáticos en las trayectorias de excitación. Además, para obtener estas imágenes, el microscopio debe estar equipado con espejos dicroicos multibanda y filtros de emisión que se controlen independientemente de los filtros de excitación o fuentes de luz. La microscopía adecuada incluye microscopía convencional de campo ancho, microscopía de localización de molécula única (SMLM) como microscopía de localización fotoactivada/microscopía de reconstrucción óptica estocástica (PALM/STORM)5,6 y microscopía de expansión7 observada con microscopía de campo ancho. Se adquiere una imagen de referencia de conversación cruzada desde el propio ejemplo de destino. Es una imagen de fluorescencia de crosstalk (sangrado a través) de un tinte obtenido en todos los canales requeridos. La emisión de fluorescencia siempre se expande hacia las longitudes de onda más largas, por lo tanto, los tintes con la longitud de onda de emisión más corta se excitan para obtener fluorescencia de interferencia en canales de longitudes de onda más largas. Por ejemplo, cuando la muestra se tiñe con azul, verde y rojo, solo se excita el tinte azul y la luz de emisión se obtiene en los canales azul, verde y rojo. En este protocolo, se utilizó ADN manchado con 4o,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para obtener fluorescencia de interferencia.
Las "imágenes de referencia de campo brillante" son una alternativa más fácil y menos fototóxica a las "imágenes de referencia de conversación cruzada", pero son las menos precisas3 (Tabla 1). Se trata de imágenes de campo brillantes de la muestra de destino, adquiridas en todos los canales de color utilizados en la imagen de destino.
Las "imágenes de referencia de calibración biológica" tienen la ventaja de ser aplicables a cualquier tipo de microscopía debido a su capacidad para medir los cambios cromáticos tanto en las rutas de excitación como en las rutas de emisión3,8 (Tabla 1). La microscopía adecuada incluye microscopía de campo amplio, microscopía confocal, microscopía de láminas de luz, agotamiento de emisiones estimulada (STED)9,microscopía de iluminación estructurada (SIM)10,Airyscan/SORA11,12, SMLM observado con el modo de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), Olympus super resolución (OSR)13,etc. Una imagen de referencia de calibración biológica se adquiere a partir de una muestra de calibración preparada de forma similar a la muestra objetivo, pero con la tinción de una sola estructura con múltiples colores. La precisión de corrección sobresale la resolución de la mayoría de la microscopía de superresor resolución y la preparación de una muestra de calibración biológica puede ser relativamente simple. Otra ventaja es la disponibilidad para "promedio" de múltiples imágenes de referencia. Por lo tanto, aunque las imágenes individuales contienen poca información para la medición de los cambios cromáticos, el contenido de la información se puede aumentar promediando varias imágenes. La precisión depende de cuánto se mantengan constantes las condiciones de imagen. En este sentido, se obtiene el mejor rendimiento cuando las muestras de destino y de referencia están en la misma diapositiva, utilizando, por ejemplo, vidrios de cubierta de cámara de 8 pozos(Tabla 1, más a la derecha). En este protocolo, actin manchado con tres colores de faloide se utilizó como calibración biológica.
Una vez que se obtiene una imagen de referencia, el desplazamiento cromático es medido y corregido por nuestro software Chromagnon. No hay limitación en el número de canales, secciones Z y marcos de tiempo para los que Chromagnon puede medir y corregir los cambios cromáticos. Chromagnon mide los cambios cromáticos en dos pasos. El primer paso adquiere los parámetros de alineación "global" o "afines" de la traducción en los ejes X, Y, Z, la ampliación a lo largo de los ejes X, Y, Z y la rotación alrededor del eje Z. La precisión del cálculo de la alineación global es de 16 nm en 3D y 8 nm en 2D. El segundo paso es una "alineación local" iterativa 2D opcional en imágenes proyectadas para obtener una mayor precisión. En el proceso de alineación local, las imágenes se subdividen en varias regiones y se miden los desplazamientos cromáticos en estas regiones locales. Posteriormente, las regiones se dividen y los desplazamientos cromáticos en las subregiones se miden de forma iterativa hasta que el número de píxeles de la región alcanza el número mínimo de píxeles (normalmente 60 x 60 píxeles). El mapa de alineación local resultante se combina con el parámetro de alineación global y se aplica a la imagen de destino mediante una transformación elástica. Después de este paso, la precisión del cálculo se mejora a 14 nm en 3D y 6 nm en 2D. La alineación local no es adecuada para imágenes de referencia de calibración biológica porque la estructura biológica de la referencia es diferente de la del objetivo (Tabla 1). Por lo tanto, solo se utiliza la alineación global para las imágenes de referencia de calibración biológica.
Los cambios cromáticos locales se originan en dos fuentes; distorsión local instrumental del microscopio y la inhomogeneidad estructural biológica. Debido a que la distorsión local instrumental del microscopio es constante, esto se puede medir a partir de la muestra de referencia de cuentas multicolor y corregirse como un parámetro fijo. Chromagnon puede combinar el mapa de distorsión local instrumental del microscopio y los parámetros de alineación global de las calibraciones biológicas (Tabla 1). Usando este método, se espera que la precisión media de la calibración biológica se mejore en un adicional de 1-2 nm.
Aquí, describimos un protocolo para corregir los cambios cromáticos de las imágenes de fluorescencia 3D utilizando nuestro software Chromagnon,desde el extremo inferior más fácil hasta la más alta precisión. Utilizamos la inmunostaining de las células de HeLa como ejemplo y las observamos usando microscopía de campo ancho 3D y 3D-SIM. En la primera sección, describimos cómo preparar muestras de destino y muestras de calibración biológica. Esta parte del protocolo debe optimizarse para los objetivos específicos de la investigación. En la segunda sección, describimos los métodos de adquisición para tres tipos de imágenes de referencia por microscopios. La suposición era obtener canales azules, verdes y rojos, pero la composición del canal debía ser modificada por los objetivos específicos de la investigación y por las configuraciones del microscopio. No importa si el microscopio está equipado con una sola cámara o varias cámaras. En la tercera sección, describimos cómo se puede utilizar nuestro software para medir y corregir los cambios cromáticos de la imagen de destino mediante el uso de imágenes de referencia. Por último, en la cuarta sección, describimos un método para complementar las imágenes de referencia de calibración biológica mediante la calibración local instrumental de un microscopio.

<table><tbody><tr><td>Solución de formaldehído al 16%</td><td>Polyscience</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30104</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16170078</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Matsunami</td><td>No. 1S HT</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diaminino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle modificado con L-Gln y piruvato de sodio</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-16</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje (VECTASHIELD)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-tubulina de ratón (TAT1)</td><td></td><td></td><td>Descrito en Ref 15.</td></tr><tr><td>Vitrina con cámara Nunc Lab-Tek II (8 pocillos)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-emerina de conejo (ED1)</td><td></td><td></td><td>Un regalo de Hiroshi Yorifuji, Universidad de Gunma, Gunma, Japón y Kiichi Arahata, Centro Nacional de Neurología y Psiquiatría, Tokio, Japón; fallecido.</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario con Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario con Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21424</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario con Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas TetraSpeck, 0,2 y micro; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7280</td><td></td></tr></tbody></table>

corrección de alta precisión de los cambios cromáticos 3d en la era de las imágenes biológicas de superresoría utilizando chromagnon

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

La microscopía cuantitativa de fluorescencia multicolor se basa en la cuidadosa coincidencia espacial de los canales de color adquiridos en diferentes longitudes de onda. Debido a la aberración cromática y la alineación imperfecta de las cámaras, las imágenes adquiridas en cada canal pueden ser desplazadas y magnificadas, así como rotadas en relación entre sí en cualquiera de las tres dimensiones. Con el método de calibración clásico, los cambios cromáticos se miden por cuentas multicolores unidas a la superficie de un cubreobjetos, y hay una serie de software disponibles para medir los cambios cromáticos de dichas muestras de calibración. Sin embargo, la aberración cromática puede variar con la profundidad, el cambio con las condiciones de observación y ser inducida por la propia muestra biológica, lo que dificulta la determinación de la verdadera cantidad de desplazamiento cromático en la muestra de interés y a través del volumen. La corrección de los cambios cromáticos con mayor precisión es particularmente relevante para la microscopía de superresor resolución, donde sólo los ligeros cambios cromáticos pueden afectar a los análisis cuantitativos y alterar la interpretación de las imágenes multicolor. Hemos desarrollado un software de código abierto Chromagnon y métodos de acompañamiento para medir y corregir los cambios cromáticos 3D en muestras biológicas. Aquí proporcionamos un protocolo de aplicación detallado que incluye requisitos especiales para la preparación de muestras, la adquisición de datos y el procesamiento de software para medir los cambios cromáticos en muestras biológicas de interés.

Un ejemplo de corrección cromática de turnos utilizando una imagen de referencia de habla cruzada se muestra en la Figura 5. La imagen se obtuvo con un microscopio de campo ancho equipado con una sola cámara. La emisión de fluorescencia de DAPI se utilizó como referencia (Figura 5A, B) para corregir los canales azul, verde y rojo. La imagen consta de 3 canales de 60 sectores Z, cada uno compuesto de 256 x 256 píxeles. Las imágenes fueron desconvolucionadas antes de medir los cambios cromáticos. La medición de los cambios cromáticos locales con Chromagnon tomó 51 s en un Mac con Intel Core i7 (núcleo cuádruple, 8 hilos, 2,7 GHz), 16 GB de RAM y 1 TB de almacenamiento flash. El parámetro de alineación se aplicó a la imagen de destino(Figura 5C,D), que tiene exactamente el mismo número de vóxeles que la imagen de referencia. La preparación del archivo alineado tomó 3 s. Como resultado de recortar los píxeles de borde durante el proceso de alineación (casilla de verificaciónde márgenes de recorte en la figura 1C), el número de vóxeles se redujo después de la alineación(Figura 5B,51 sectores Z, 252 x 251 píxeles). El ADN en el puente antófago (indicado por puntas de flecha) se ve incorrectamente fuera de la envolvente nuclear antes de la alineación(Figura 5C, obvia en el panel inferior que muestra la vista XZ), pero como se esperaba dentro del sobre después de la alineación(Figura 5D).
Un ejemplo de corrección cromática del cambio utilizando una imagen de referencia de calibración biológica se muestra en la Figura 6. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio SIM equipado con tres cámaras. Se promediaron tres imágenes de células de HeLa teñidas con faloides conjugados con tintes azules, verdes y rojos(Figura 6A). La imagen de referencia consta de 3 canales de 76 sectores Z, cada uno compuesto de 1.024 x 1.024 píxeles. La medición de los cambios cromáticos utilizando Chromagnon sin alineación local requería 194 s en el sistema Mac descrito anteriormente. El parámetro se aplicó a una imagen de destino que consta de 3 canales de 73 sectores Z, cada uno compuesto de 1.024 x 1.024 píxeles. La generación del archivo alineado tomó 25 s. La vista XZ muestra posiciones de canal incorrectas a lo largo de la Z, y ligeramente a lo largo de las direcciones X (Figura 6A,C) pero este registro incorrecto se corrigió después de la alineación (Figura 6B,D).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg"> Figura 5: Un ejemplo de alineación con una imagen de referencia de conversación cruzada. Las células HeLa se tiñeron con DAPI para ADN (mostrado en magenta), Alexa Fluor 488 (mostrado en amarillo) para sobre nuclear y Alexa Fluor 555 (mostrado en azul) para microtúbulos. Las imágenes fueron adquiridas por microscopía de campo ancho 3D con una sola cámara y desconvolucionadas. (A,B) Una imagen de referencia de conversación cruzada representativa utilizando la emisión DAPI, antes y después de la alineación por Chromagnon. Tres canales de color se muestran como superpuesta. (C,D) Una sección óptica de la pila 3D en tres canales antes y después de la alineación. La aberración cromática axial es obvia en el puente anafásico mostrado por las puntas de flecha. La barra de escala en el panel A indica 5 m para todos los paneles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg"> Figura 6: Un ejemplo de alineación con una imagen de referencia de calibración biológica Las imágenes fueron adquiridas con 3D-SIM equipado con tres cámaras. (A,B) Una imagen de referencia promediada a partir de tres imágenes antes de la alineación (A) y después (B). Las células de HeLa estaban manchadas con faloide conjugado con Alexa Fluor 405, 488 o 594. (C,D) La imagen de destino antes(C) y después de la alineación (D). Las células HeLa se teñiron con DAPI para ADN (mostrado en magenta), Alexa Fluor 488 (mostrada en amarillo) para sobre nuclear y Alexa Fluor 594 (mostrada en azul) para microtúbulos. La barra de escala en el panel A indica 5 m para todos los paneles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La corrección de los cambios cromáticos en imágenes de microscopía de fluorescencia multicolor tridimensionales (3D) es crucial para los análisis cuantitativos de datos. Este protocolo se desarrolla para medir y corregir los cambios cromáticos en muestras biológicas a través de la adquisición de imágenes de referencia adecuadas y el procesamiento con el software de código abierto, Chromagnon.

Corrección de alta precisión de los cambios cromáticos 3D en la era de las imágenes biológicas de superresoría utilizando Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to ...

Las imágenes de microscopía de coral de pantano contienen cambio cromático en tres dimensiones. Eso deteriora el análisis de colocación de imágenes de alta resolución. Generalmente es difícil eliminar el cambio cromático originado de una muestra biológica en sí, nuestro método puede corregir el cambio cromático en una muestra biológica utilizando imágenes de referencia adquiridas por separado.Demostrando el procedimiento será Takako Koujin un técnico de mi grupo. Comience por sembrar 2.5 veces 10 a las quintas células sanadoras en un plato inferior de vidrio de 35 milímetros y cultivarlas en una incubadora de dióxido de carbono. Después de 24 horas de incubación reemplace el medio con dos mililitros de 3.7%formaldehído en PBS y mezcle suavemente.Fije las ventas durante 15 minutos a temperatura ambiente en una plataforma giratoria. Lave las células tres veces con dos mililitros de PBS durante cinco a 10 minutos. Permeabilizarlos con dos mililitros del punto 1%probar el siguiente 100 en PBS mientras gira y repetir los lavados con PBS.A continuación, manche las células utilizando un protocolo estándar de tinción de anticuerpos como se describe en el manuscrito de texto. Para obtener una imagen de referencia de referencia de referencia de crosstalk para microscopía de campo ancho, agregue dos mililitros de punto cinco microgramos por mililitro Dappy para permanecer en el ADN. Deje las celdas en la plataforma giratoria durante 30 minutos.A continuación, sustituya la solución por 100 microlitros de medio de montaje Para obtener una imagen de referencia de referencia de calibración biológica para cualquier tipo de microscopía, incluida la microscopía confocal y de superrescía. Fijar las células como se describió anteriormente, y preparar la solución de stock un colorante fluorescente conjugado falhalloidin en 1.5 mililitros de metanol. Agregue la faloideina en PBS en una dilución de uno a 100 para Alexa piso 405 uno a 1000 para Alexa piso 488 y uno a 200 para Alexa piso 594.Añadir un mililitro de la solución a las células e incubarlas durante 30 minutos mientras gira. Lavar las células de tres a cinco veces con dos mililitros de PBS. A continuación, sustituya el PBS por 100 microlitros de medio de montaje.Para adquirir imágenes de fluorescencia mediante microscopía de campo ancho, coloque la muestra objetivo en el microscopio en el software de imágenes, abra la ventana de diseño y ejecución del experimento, establezca el paso Z adecuado y seleccione los canales azul, verde y rojo. En la pestaña Ejecutar, agregue el nombre del archivo de imagen y comience la creación de imágenes. Para adquirir imágenes de referencia de conversación cruzada para medir los cambios cromáticos en la muestra, seleccione la luz de excitación solo para Dappy y asegúrese de utilizar exactamente la misma posición de etapa y la altura Z que para la muestra de destino.Alternativamente, utilizar una imagen de campo brillante como un lugar de referencia a la muestra de destino en el microscopio de campo ancho y adquirir una imagen de fluorescencia del objetivo en canales azul, verde y rojo. A continuación, adquiera imágenes de campo brillante del objetivo en canales azules, verdes y rojos en la misma posición exacta de la etapa y utilizando la misma altura Z. Para adquirir imágenes de fluorescencia mediante una microscopía de super resolución, como 3D Sim, coloque la muestra objetivo en el microscopio y adquiera una imagen sim de fluorescencia del objetivo en canales azules, verdes y rojos.A continuación, reconstruya la imagen super resuelta. A continuación, coloque la mancha de muestra con falhalloidina multicolor en un microscopio sim 3D. Y adquiera múltiples imágenes sim de fluorescencia como imágenes de referencia de calibración biológica en posiciones de etapa puntuales, luego reconstruya las imágenes súper resueltas.Utilice un navegador web para descargar la versión binaria más reciente de Chromagnon. Extraiga el programa y coloque el archivo ejecutable en una ubicación conveniente. Arrastre y suelte los archivos de referencia del campo derecho de conversación cruzada o de las referencias de calibración biológica al cuadro de referencia o haga clic en los archivos de referencia para abrir un cuadro de diálogo de selector de archivos.Si el programa solicita instalar un Kit de desarrollo de Java, pulse Sí y vaya a la página descargada. A continuación, descargue e instale el JDK para el sistema operativo según las instrucciones. Arrastre y suelte los archivos de destino de la tinción de anticuerpos en el cuadro de destino.Elija un formato de imagen de salida y especifique el sufijo para el nombre del archivo de salida. Para imágenes de referencia de conversación cruzada con alta relación señal-ruido. Elija la proyección de la lista de opciones de alineación local y utilice un tamaño mínimo de ventana de 60.Para varias imágenes de referencia de calibración biológica, marque la opción de referencias medias y elija ninguna para la alineación local, luego haga clic en Ejecutar todas para iniciar las mediciones. Para asegurarse de que la medición se ha realizado correctamente, arrastre y suelte las imágenes de referencia en el cuadro de referencia y el cuadro de destino. A continuación, ejecute el programa y compruebe que las imágenes están perfectamente superpuestas.La corrección cromática del cambio en la microscopía de campo ancho se puede realizar utilizando una imagen de referencia de conversación cruzada. Esta imagen fue obtenida con un microscopio de campo ancho equipado con una sola cámara. La emisión de fluorescencia de Dappy se utilizó como referencia para corregir los canales azul, verde y rojo.Después de la alineación con Chromagnon se corrigió el cambio cromático y la imagen de referencia. Cuando el parámetro de alineación fue aplicado a la imagen de destino por Chromagnon el ADN y el puente anafásico, que se ve incorrectamente fuera de la envolvente nuclear antes de que la alineación aparezca como se esperaba dentro de la envolvente. La corrección cromática del cambio de una imagen sim 3D se puede realizar utilizando una imagen de referencia de calibración biológica.Tres imágenes sim 3D de células de HeLa teñidas con faloidinas conjugadas con tintes azules, verdes y rojos fueron averged y el cambio cromático fue medido por Chromagnon. Después de la alineación, se corrigió el cambio cromático y la imagen de referencia. El parámetro de alineación se aplicó a una imagen de destino.La vista XZ muestra una posición de canal incorrecta a lo largo de la Z y ligeramente a lo largo de las direcciones X, que se corrigió después de la alineación. Para obtener el mejor rendimiento, es importante obtener imágenes de referencia en las mismas condiciones y el tiempo que las imágenes de destino.

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Corrección de alta precisión de los cambios cromáticos 3D en la era de las imágenes biológicas de superresoría utilizando Chromagnon (Video) | JoVE Journal

Corrección de alta precisión de los cambios cromáticos 3D en la era de las imágenes biológicas de superresoría utilizando Chromagnon

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