Identificación de alto rendimiento de la resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas
10 de marzo de 2020
El ensayo de inundación de plántulas facilita el cribado rápido de las adhesiones de tomate silvestre para la resistencia a la bacteria pseudomonas de las siestas. Este ensayo, utilizado junto con el ensayo de crecimiento bacteriano de plántulas, puede ayudar a caracterizar aún más la resistencia subyacente a la bacteria, y se puede utilizar para examinar las poblaciones de mapeo para determinar la base genética de la resistencia.
Este protocolo de alto rendimiento permite el cribado rápido de plántulas de tomate de las adhesiones silvestres al patógeno bacteriano Pseudomonas syringae. El ensayo de inundación de plántulas minimiza el tiempo de crecimiento de la planta y las necesidades de la cámara de crecimiento, permite una rápida rotación de las plantas y permite probar grandes tamaños de muestra. Este ensayo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para detectar resistencia en adhesiones salvajes y otras líneas con antecedentes genéticos complejos.
El protocolo proporciona instrucciones específicas para la inoculación de inundación de dos cepas de Pseudomonas syringae. Sin embargo, es versátil y se puede modificar para detectar la resistencia del huésped a otros patógenos bacterianos. Demostrando el procedimiento estará Yana Hasan, especialista en investigación en mi laboratorio.
Comience por cultivar las plántulas de tomate. Coloque las semillas de tomate en un tubo de microcentrífuga de 2,2 mililitros y agregue dos mililitros de solución de lejía al 50%. Mece el tubo durante 25 minutos y retire la solución de lejía con una pipeta.
Añadir dos mililitros de agua ultra pura y lavar las semillas invirtiendo el tubo cinco veces. Aspirar el líquido del tubo y repetir el lavado cuatro veces más. Después del lavado final, añadir dos mililitros de agua ultrapura y verter las semillas en un plato estéril de Petri.
Esterilice los fórceps en llamas en etanol y luego utilícelos para transferir de cinco a siete semillas a una placa de 100 por 25 mililitros con 0,5 XMS más 0,8 por ciento de medios de agar. Selle los bordes de la placa con cinta quirúrgica. Asegúrese de que las placas estén apiladas planas y boca arriba.
Estratificar las semillas esterilizadas a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante al menos tres días para sincronizar la germinación. Después de tres días, orientar verticalmente las placas para que las raíces crezcan a lo largo de la superficie de la placa y la línea de semillas se oriente horizontalmente. Transfiera las semillas a una cámara de crecimiento establecida a 22 grados Celsius con un ciclo oscuro de 16 horas de luz y 8 horas.
Cultivar las plántulas durante diez días en la cámara, momento en el que normalmente se mostrarán completamente emergidos y expandidos cotiledones y saliendo primero hojas verdaderas. Raya las bacterias frescas sobre el agar KB apropiado con un palillo de dientes plano y estéril. Para PstT1, incubar la placa a 28 grados centígrados durante 48 horas antes de usar las bacterias en el experimento de inundación.
Para preparar el inóculo, reanimar asépticamente las bacterias en cloruro de magnesio estéril de diez mililitros a una densidad óptica de 0,1. A continuación, realice dos diluciones en serie para obtener una concentración de trabajo con un OD600 de 0075. También preparar una dilución de uno a diez de copolímero tensioactivo organosilicio no iónico en cloruro de magnesio de diez milimolares.
Vórtice y agréguelo a las bacterias, remondo el tubo para mezclar. Transfiera las placas con las plántulas de diez días de edad de la cámara de crecimiento al gabinete de bioseguridad y retire la cinta quirúrgica. A continuación, transfiera seis mililitros de inóculo a cada plato.
Empuje suavemente las plántulas en el inóculo con una punta de pipeta e inicie un temporizador durante tres minutos. Sostenga una placa en cada mano e incline la parte delantera de la placa hacia abajo para sumergir los cotiledones y las hojas de las plántulas. Swish el inóculo de lado a lado de cinco a siete veces, a continuación, inclinar las placas hacia atrás para cubrir las raíces con el inóculo.
Incline las placas de nuevo y repita el ciclo durante un total de tres minutos. Vierta el inóculo de las placas, colóquelos sobre una superficie plana y vierta cualquier inóculo residual por segunda vez. Vuelva a envolver las placas y colóquelas de nuevo en la cámara de crecimiento.
Los cultivares Moneymaker-PtoR y Moneymaker-PtoS se inundaron con PSTDC3000 y fenotipos de siete a diez días después de la inundación. Las plántulas Moneymaker-PtoR llevan el grupo genético PtoPRF y eran resistentes a la PSTDC3000. Mientras que las plántulas casi isógenas Moneymaker-PtoS, que no pueden reconocer los efectores PSTDC3000 AVRPto o AVRPto-B murieron rápidamente, dentro de los siete días después de la inundación.
Las plántulas de diez días de edad se inundaron con PstT1 y fenotiparon al menos diez días después de la inundación. Las adhesiones susceptibles estaban muertas, tenían meristems apicales marrones y carecían de un nuevo crecimiento. Por el contrario, las plántulas resistentes mostraron un alto nivel de nuevo crecimiento verde y sobrevivieron a la infección con PstT1.
Se llevaron a cabo ensayos de crecimiento bacteriano para confirmar cuantitativamente la resistencia a la PstT1 y Solanum NeoRici LA1329. Hubo una diferencia de registro de 1,7 en el crecimiento bacteriano entre LA1329 resistente y susceptible y una diferencia de registro de 1,6 entre la resistencia LA1329 y Moneymaker-PtoS, que se correlacionó con los resultados fenotípicos. Al realizar este ensayo, las cosas más importantes a recordar son prestar mucha atención a la técnica aséptica en todo el protocolo y asegurarse de que todas las plántulas en la placa están completamente inundadas.
Asegúrese de autoclave el tejido y las bacterias de las plantas infectadas y deseche los materiales de acuerdo con las regulaciones apropiadas.
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Descripción general
El ensayo de inundación de plántulas permite la selección rápida de accesiones silvestres de tomate para evaluar su resistencia a la bacteria Pseudomonas syringae. Este protocolo de alto rendimiento minimiza el tiempo de crecimiento de las plantas y permite probar eficientemente tamaños grandes de muestras.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Patología Vegetal
- Genética
- Microbiología
Antecedentes
- El ensayo de inundación de plántulas está diseñado para la selección de plántulas de tomate.
- Pseudomonas syringae es un patógeno bacteriano importante que afecta al tomate.
- Este ensayo puede adaptarse para otros patógenos bacterianos.
- Facilita la identificación de resistencia genética en accesiones silvestres de tomate.
Objetivo del estudio
- Evaluar accesiones silvestres de tomate para detectar resistencia a Pseudomonas syringae.
- Caracterizar la base genética de la resistencia en poblaciones de mapeo.
- Proporcionar un método de alto rendimiento para probar tamaños grandes de muestras.
Métodos Utilizados
- Inoculación por inundación de plántulas de tomate con cepas de Pseudomonas syringae.
- Evaluación del crecimiento bacteriano en plántulas.
- Comparación de los niveles de resistencia entre diferentes accesiones.
- Uso de condiciones de cámara de crecimiento para optimizar el crecimiento de las plantas.
Resultados principales
- El ensayo identifica eficazmente accesiones de tomate resistentes.
- Permite un rápido procesamiento y la evaluación de grandes tamaños de muestras.
- Versatilidad demostrada en la detección de resistencia frente a diversos patógenos bacterianos.
- Facilita análisis genéticos posteriores de los caracteres de resistencia.
Conclusiones
- El ensayo de inundación de plántulas es una herramienta poderosa para evaluar la resistencia en tomate.
- Puede adaptarse para aplicaciones más amplias en la patología vegetal.
- Este método mejora la eficiencia del cribado de resistencia en la investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La identificación rápida de la resistencia a patógenos en sistemas vegetales apoya la validación temprana de objetivos en el descubrimiento de agroquímicos y biopesticidas. El ensayo de inundación en plántulas permite la selección fenotípica de alto rendimiento de germoplasma silvestre, acelerando el descubrimiento de rasgos de resistencia con valor predictivo para las líneas de protección de cultivos. Este enfoque reduce el riesgo biológico mediante la validación funcional de mecanismos de resistencia antes de realizar ensayos de campo intensivos en recursos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina los mecanismos de interacción huésped-patógeno para esclarecer las vías de resistencia en el tomate.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de loci genéticos mediante fenotipos de supervivencia discretos o métricas cuantitativas de crecimiento.
- Valor predictivo: Facilita la priorización de candidatos de resistencia mediante la correlación de resultados fenotípicos con ensayos de crecimiento bacteriano.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera fenotipos de resistencia reproducibles en plántulas de 10 días de edad, lo que permite la evaluación a gran escala del germoplasma.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de inoculación e inundación para garantizar una exposición constante al patógeno en todas las muestras.
- Escalabilidad: Reduce el tiempo de crecimiento y el espacio requerido en la cámara, permitiendo un rápido recambio y la prueba de diversas accesiones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor Translacional: Relaciona los fenotipos de resistencia en plántulas con resultados relevantes para el campo mediante la correlación con datos de proliferación bacteriana.
- Reducción Mecanística de Riesgos: Distingue la susceptibilidad inducida por efectores (por ejemplo, reconocimiento de AvrPto) de la resistencia de amplio espectro mediante líneas casi isogénicas.
- Continuidad Preclínica: Proporciona una criba primaria escalable que orienta el mapeo genético posterior y la validación de rasgos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuum de descubrimiento desde la selección de germoplasma hasta la identificación de factores líderes, lo que permite la detección temprana de rasgos de resistencia antes del mapeo genético o la validación en campo.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa los efectos del genotipo del hospedador sobre la supervivencia del patógeno y el vigor de las plántulas tras una inoculación controlada mediante inundación.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos (medición del nuevo crecimiento) y cualitativos (supervivencia/muerte) para la calificación de resistencia.
- Análisis: Permite correlacionar la resistencia fenotípica con diferencias en el crecimiento bacteriano (por ejemplo, una reducción de 1,6–1,7 logarítmicas) para validar los resultados positivos.
- Investigación Traducional: Relaciona los ensayos en plántulas con la validación de genes de resistencia mediante comparaciones de líneas casi isogénicas.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a múltiples cepas de Pseudomonas syringae y otros patógenos bacterianos con modificaciones mínimas del protocolo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al vincular fenotipos de resistencia a contextos genéticos definidos (por ejemplo, presencia/ausencia de Pto/Prf).
- Valor operativo: Aumenta el rendimiento mediante un ciclo de crecimiento reducido e inoculación por inundación estandarizada.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o descarte en el desarrollo de rasgos de resistencia al proporcionar confirmación fenotípica y cuantitativa temprana.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de accesiones silvestres según la intensidad de resistencia validada y la trazabilidad genética.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas asépticas, manejo de patógenos y cultivo de plantas bajo condiciones controladas.
- Depende de una cabina de seguridad biológica, cámaras de crecimiento con ciclos precisos de luz/temperatura y espectrofotometría para la normalización del inóculo.
- Exige la estandarización conjunta entre equipos del momento del encharcamiento, los ciclos de inclinación y el volumen del inóculo para lograr reproducibilidad entre experimentos.
- La adaptación a nuevas cepas de patógenos requiere la optimización de la DO600 bacteriana y de la concentración del tensioactivo, manteniendo al mismo tiempo la viabilidad de las plántulas.
- La precisión en la calificación fenotípica depende de períodos de incubación posteriores al encharcamiento consistentes y de una evaluación objetiva del nuevo crecimiento verde.
