Name: Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende un método rápido de tinción para imágenes multiespectrales en tejidos congelados que permite detectar y co-localizar múltiples biomarcadores simultáneamente. Esta técnica reduce significativamente el tiempo de análisis y puede realizarse en cualquier laboratorio.

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La guía de imágenes y análisis fue proporcionada por el Centro de Recursos de Investigación – Investigación histológica y núcleo de imágenes de tejidos en la Universidad de Illinois en Chicago establecido con el apoyo de la oficina del Vicecanciller de Investigación. El trabajo fue apoyado por NIH/NCI RO1CA191317 a CLP, por NIH/NIAMS (SBDRC otorgan 1P30AR075049-01) al Dr. A. Paller, y por el apoyo del Centro Integral del Cáncer Robert H. Lurie al Núcleo de Evaluación de Inmunoterapia en la Universidad Northwestern.

El bazo de ratón y los tejidos tumorales de ratón HLF1623 se obtuvieron de nuestro laboratorio. El tejido de las amígdalas humanas fue comprado a un vendedor comercial. Los detalles se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Incorporación de tejidos
<ol><li>Incruste tejido fresco en la solución OCT (temperatura de corte óptima) y congele a presión utilizando hielo seco o nitrógeno líquido.</li>
	<li>Conservar los tejidos a -80oC.</li>
</ol>2. Criosección
<ol><li>Cortar secciones de 8 m en un criostato con temperaturas fijas a -25 oC. NOTA: El grosor de sección preferido se puede ajustar para generar imágenes más nítidas.</li>
	<li>Coloque secciones en los portaobjetos de vidrio cargados.</li>
	<li>Secar al aire las secciones durante 1 h a temperatura ambiente (RT) antes de fijar las acetonas heladas de grado histológico durante 10 min. NOTA: La acetona causa la coagulación de proteínas solubles en agua y extrae lípidos, pero no afecta a los componentes que contienen carbohidratos. Por el contrario, la formalina preserva la mayoría de los lípidos y tiene poco impacto en los carbohidratos24. La elección del fijador es importante dependiendo de la elección del marcador que se detecte.</li>
	<li>Almacene las diapositivas a -20 oC.</li>
</ol>3. Selección de anticuerpos y fluoróforos
NOTA: Antes de la tinción tisular, los clones de anticuerpos que mancharán de forma robusta y específica sus antígenos de interés dentro de las secciones secuenciales del tejido fijo de acetona deben ser validados. Algunos anticuerpos pueden requerir un fijador diferente, y su compatibilidad con otros anticuerpos en el panel también tendrá que ser determinada empíricamente. El objetivo también es identificar fluoróforos con una superposición mínima que se pueden detectar con los filtros de epifluorescencia para DAPI, FITC, Cy3, Texas Red y Cy5.
<ol><li>Confirmar la tinción por IHC convencional o detección de inmunofluorescencia (IF) en secciones de tejido con antígeno diana de expresión conocida.</li>
	<li>Utilizando los conjuntos de filtros de excitación y emisión disponibles en el sistema de imágenes semiautomatizadas y después de probar varias combinaciones de anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos, prepare fluoróforos para ser utilizados que tengan una superposición espectral mínima (por ejemplo, ver Tabla 1).</li>
</ol>4. Tinción
NOTA: La rehidratación tisular y los lavados por diapositivas se realizaron en un frasco de Coplin. Los pasos de bloqueo e incubación de anticuerpos se realizaron en una caja de diapositivas humidificada.
<ol><li>Deje que las diapositivas se calienten a RT durante 5-10 min.</li>
	<li>Rehidratar en solución salina tamponada de fosfato (PBS) durante 5 min.</li>
	<li>Realice un paso de bloqueo antes de manchar los tejidos con anticuerpos. Para las secciones del ratón, utilice la solución de bloqueo especializada (ver Tabla de materiales)durante 10 minutos en RT. Para las secciones humanas, utilice un 10% de suero humano agrupado normal (NHS) diluido en PBS durante 15 minutos a RT. NOTA: Se pueden probar diferentes búferes de bloqueo según sea necesario para conservar las propiedades específicas de las secciones en función de los procedimientos de seguimiento que se utilizarán.</li>
	<li>Lave los portaobjetos durante 5 minutos en PBS después del bloqueo.</li>
	<li>Para la tinción múltiple, prepare un cóctel de anticuerpos con fluoróforos compatibles en diluciones óptimas predeterminadas.</li>
	<li>Añade el cóctel de anticuerpos conjugados con fluoróforoa a las diapositivas. Para la tinción de un solo marcador, agregue solo el anticuerpo conjugado primario a la diapositiva.</li>
	<li>Incluya una diapositiva de control sin manchar que se someta al mismo procedimiento de tinción sin la adición de ningún anticuerpo conjugado primario.</li>
	<li>Incubar los portaobjetos durante 1 h a RT en la oscuridad y luego lavar los portaobjetos 2x con PBS durante 5 minutos cada uno. A partir de ahora, la diapositiva resultante se conoce como multiplex-tainedtained.</li>
	<li>Para contramancha, agregue DAPI a la diapositiva teñida de multiplex, incubar durante 7 minutos en la oscuridad en RT, y lavar las diapositivas 2x con PBS durante 5 minutos cada uno. No contrarreste las diapositivas de un solo mancha y sin manchas.</li>
	<li>Para cubrir, agregue una gota del medio de montaje y coloque suavemente el cubreobjetos de vidrio sobre el tejido.</li>
</ol>5. Preparación de una biblioteca espectral
<ol><li>
Adquisición de imágenes
	<ol>
<li>Ajuste la potencia de la lámpara al 100%. Por lo general, la potencia se establece en 10% porque la detección de fluorescencia en los tejidos FFPE incluye un paso de amplificación de señal.</li>
		<li>Comience abriendo el software operativo del microscopio (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Seleccione Editar protocolo y, a continuación, Nuevo protocolo.</li>
		<li>Proporcione un "Nombre de protocolo" y seleccione Fluorescencia en el modo de imageny proporcione un "Nombre de estudio".</li>
		<li>Coloque las diapositivas de un solo punto en el escenario y examine cada marcador en su canal de fluorescencia correspondiente para asegurar la tinción. Elija una región en el tejido que exprese la señal más fuerte para el marcador.</li>
		<li>Ajuste los tiempos de exposición con las opciones Enfoque automático y Autoexponer.</li>
		<li>Adquiera instantáneas para las diapositivas de un solo mancha dote y sin manchas y guarde el protocolo. NOTA: Los siguientes pasos se realizan en el software de aprendizaje automático (consulte Tabla de materiales),utilizando las diapositivas individuales manchadas y no manchadas para verificar manchas específicas, así como para determinar la conversación cruzada de anticuerpos.</li>
		<li>En la pestaña Build Libraries del software, cargue cada imagen de diapositiva de un solo mancha, elija el Fluor adecuado y haga clic en Extraer. El software extraerá automáticamente la señal de fluorescencia elegida en el Fluor.</li>
		<li>Para guardar el color extraído, haga clic en Guardar en tienda. Se puede crear un "Nuevo grupo" o el color extraído se puede almacenar en un grupo existente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificación de la biblioteca espectral
	<ol>
<li>Compruebe la ventana de curva espectral de emisión, situada a la derecha de la imagen extraída, para cada conjunto de filtros. NOTA: La señal extraída es correcta si la curva espectral sólo se observa en los conjuntos de filtros donde se detecta el fluoróforo. Si se observa una curva espectral en el conjunto de filtros incorrecto, puede significar que la señal primaria esperada en el conjunto de filtros no es lo suficientemente fuerte, o el software está detectando otra señal que es demasiado alta, posiblemente debido a la superposición espectral. En este caso, primero intente utilizar la herramienta Dibujar regiones de procesamiento para dibujar regiones alrededor de áreas que expresan el marcador fluorescente y la autofluorescencia en la imagen. Esto entrena el software para detectar la señal verdadera y eliminar cualquier señal que interfiera. Si esto no funciona, repita el proceso de tinción de la diapositiva de un solo mancha para probar diferentes valoraciones de anticuerpos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Imágenes multiespectrales
NOTA: Una vez creada y verificada la biblioteca espectral, realice los pasos siguientes para la diapositiva manchada de multiplex.
<ol><li>
Escaneo de diapositivas enteras
	<ol>
<li>Ajuste los tiempos de enfoque y exposición en la diapositiva teñida de múltiplex como se menciona en la sección 5.1.
</li>
		<li>En Escanear diapositivas, cree una nueva tarea y elija el protocolo guardado anteriormente.</li>
		<li>Realice un escaneo de diapositivas completo en la diapositiva con punto multiplex.</li>
		<li>Con todo el software de escaneo de diapositivas, abra toda la imagen de escaneo de diapositivas. Esta imagen no se ha desmezclado espectralmente.</li>
		<li>Seleccione regiones de interés (ROI) en toda la imagen de escaneado de diapositivas utilizando la herramienta Sello o ROI. Estos ROI se analizarán utilizando los tiempos de exposición establecidos en 6.1.1 para ser utilizados para la desmezcla espectral y el análisis.</li>
		<li>Haga clic en Procesar diapositiva para adquirir ROI con aumento de 20x</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desmezcla espectral
	<ol>
<li>Una vez adquiridos los ROI, en el software de aprendizaje automático, en la pestaña Análisis manual, cargue las imágenes manchadas multiplex haciendo clic en Abrir en Archivo.</li>
		<li>En el menú desplegable Fuente de la biblioteca espectral, haga clic en Seleccionar fluores.</li>
		<li>Se abrirá una nueva ventana. Aquí, elija la biblioteca espectral o el grupo creado anteriormente.</li>
		<li>Cargue la imagen de diapositiva sin conservar. Haga clic en el icono del marcador de tinta AF situado encima de la biblioteca espectral seleccionada y dibuje una línea o región en la diapositiva no manchada para identificar la autofluorescencia en el tejido.</li>
		<li>En la pestaña Editar marcadores y colores, asigne nombres para cada marcador. Los pseudocolores se pueden asignar en este paso. NOTA: El color de la imagen Autofluorescence se establece de forma predeterminada en DarkSlateGray. Cambia esto a Negro.</li>
		<li>Haga clic en Preparar todo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificación de imágenes espectralmente no mezcladas NOTA: Cuando se completa el paso de desmezcla espectral, se crea una imagen compuesta que consta de todos los colores.<ol>
<li>Haga clic en el icono Editar el ojo de vista. Aquí, cada color de la "Visualización de componentes" se puede desactivar o activar para ver la tinción de cada marcador individual.</li>
		<li>Inspeccione visualmente la tinción y la morfología de las células para asegurarse de que no hay superposición de marcador, a menos que sea biológicamente relevante. Un patólogo también puede ayudar a verificar la tinción. NOTA: La tinción en la diapositiva multiplexada debe validarse dejando fuera un fluoróforo a la vez y revisando el patrón de tinción. Además, la validación también ayudará a identificar fluoróforos fuertes que aparecen en espectros adyacentes debido a la conversación cruzada de anticuerpos o sangrado.</li>
		<li>Para Vistas de patología, que simulan imágenes de campo brillante para cada marcador fluorescente, haga clic en el botón Seleccionar una imagen de componente. Aquí, elija un marcador para ver una imagen de campo brillante simulada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Análisis de imágenes multiespectrales a través de la segmentación celular y la fenotipación
NOTA: Después de verificar la imagen espectralmente no mezclada, la segmentación de celdas se puede realizar utilizando el software de aprendizaje automático, que proporcionará instrucciones paso a paso. La segmentación de tejidos no se realizó aquí. Si el panel incluye uno o más marcadores específicos de tejido y especialmente si el tejido es desordenado, se debe realizar la segmentación del tejido.
<ol><li>Seleccione"Citoplasma"y"Membrana"bajo la opción "Segmento". NOTA: "Nuclei" se elige por defecto.</li>
	<li>Seleccione un marcador en el panel. Configure el marcador para detectar núcleos, citoplasma o membrana. Por ejemplo, se puede seleccionar DAPI para detectar núcleos y CD3 para membrana.</li>
	<li>Haga clic en el botón de puntos suspensivos ('...') para seleccionar una opción en"utilizar esta señal para encontrar". Por ejemplo, 'núcleos' para DAPI. Se pueden seleccionar varios marcadores del panel para la segmentación. NOTA: Para marcadores citoplasmas mifósicos o de membrana, seleccione la opción "Utilice esta señal para ayudar en lasegmentación nuclear".</li>
	<li>El software detecta y crea automáticamente una máscara para el núcleo, el citoplasma y la membrana en la imagen.</li>
	<li>Asegúrese de que todas las celdas estén 'enmascaradas' para la segmentación. Para ajustar, cambie a la vista Patología para el marcador específico elegido en 7.3. y utilizar las opciones de configuración en el software.</li>
	<li>Haga clic en "Segmentar todo" para segmentar celdas.</li>
	<li>Después de la segmentación celular, proceda con las células de fenotipado. En este paso, elija los marcadores necesarios para el fenotipado y seleccione manualmente al menos cinco celdas que estén claramente teñidas con el marcador elegido. Esto entrena el software para detectar automáticamente todas las celdas manchadas con el marcador elegido en la imagen.</li>
	<li>Se crea un mapa de fenotipo. Analice para asegurarse de que la célula manchada con el marcador está correctamente fenoticada. NOTA: El fenotipado celular puede ser un proceso iterativo. Si el software no puede fenotipo de las células correctamente, significa que el entrenamiento es inadecuado o incorrecto. En este caso, el usuario tiene que seleccionar manualmente más celdas y volver a entrenar el software y repetir este paso hasta que el usuario esté satisfecho con el entrenamiento.</li>
	<li>Cree un grupo denominado "Otros" e incluya celdas que no estén manchadas para ninguno de los marcadores. NOTA: Este paso es importante para entrenar el software para excluir todas las células no retenidas de la fenotipación.</li>
</ol>8. Exportación de imágenes y tablas de análisis
<ol><li>Haga clic en el botón Exportar para ver el panel Configuración de exportación.</li>
	<li>En el "Directorio de exportación", haga clic en Examinar para seleccionar una ubicación para exportar las imágenes.</li>
	<li>En "Opciones de exportación de imagen", elija Formato de salidade imagen .</li>
	<li>En la lista "Imágenes para exportar", seleccione las imágenes que desea exportar. "Imagen compuesta" es la imagen final sin mezclar pseudocolor. "Vistas patológicos" son las imágenes de campo brillante simuladas individuales y las "Imágenes de componentes (TIFF multiimagen)" es un archivo TIFF de varias imágenes de datos de componentes que puede ser utilizado por software de análisis de terceros.</li>
	<li>Haga clic en el botón"Exportar para todos"para exportar las imágenes. NOTA: Las tablas del análisis también se pueden seleccionar y exportar en este paso.</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Los tejidos congelados se han utilizado ampliamente para la toma de imágenes mIF para detectar tradicionalmente de tres a cuatro marcadores31 en un tejido utilizando el método directo e indirecto32. En el método directo, los anticuerpos se conjugan con los tintes fluoresciosos o los puntos cuánticos33 para etiquetar el tejido, mientras que en el método indirecto, se utiliza un anticuerpo primario no conjugado para etiquetar el tejido seguido de un an...

Los avances recientes en las técnicas de imágenes microscópicas han mejorado significativamente nuestro conocimiento y comprensión de los procesos biológicos y los estados de las enfermedades. La detección in situ de proteínas en los tejidos a través de la inmunohistoquímica cromogénica (IHC) se realiza rutinariamente en patología. Sin embargo, la detección de múltiples marcadores mediante la tinción cromogénica de IHC es un desafío1 y se están desarrollando métodos más recientes para utilizar enfoques de tinción de inmunofluorescencia múltiple (mIF), en los que se están desarrollando múltiples marcadores biológicos etiquetados en una sola muestra de tejido. La detección de múltiples marcadores biológicos es útil, ya que la información relacionada con la arquitectura tisular, la distribución espacial de las células y la coexpresión de antígenos se capturan en una sola muestra de tejido2. El uso de la tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia ha hecho posible la detección de múltiples marcadores biológicos. En esta tecnología, utilizando ópticas específicas, los espectros de fluorescencia de cada fluoróforo individual pueden separarse o "sin mezclar", permitiendo la detección de múltiples marcadores sin ninguna conversación cruzada espectral3. La fluorescencia multiespectral se está convirtiendo en un enfoque crítico en biología celular, desarrollo de fármacos preclínicos, patología clínica y perfilinmune tumoral4,,5,6. Es importante destacar que la distribución espacial de las células inmunitarias (específicamente células T CD8) puede servir como factor pronóstico para los pacientes con tumores existentes7.
Se han desarrollado varios enfoques para la tinción de fluorescencia multiplex y se pueden realizar simultáneamente o secuencialmente. En el método de tinción simultánea, todos los anticuerpos se suman como un cóctel en un solo paso para etiquetar el tejido. La tecnología UltraPlex utiliza un cóctel de anticuerpos primarios conjugados con ya hapten seguido de un cóctel de anticuerpos secundarios anti-hapten conjugados con fluoróforos. La tecnología InSituPlex8 utiliza un cóctel de anticuerpos primarios únicos conjugados por EL ADN que se añaden simultáneamente al tejido seguido de un paso de amplificación y finalmente sondas conjugadas con fluoróforoque que son complementarias a cada secuencia de ADN única en el anticuerpo primario. Ambas tecnologías permiten la detección de cuatro marcadores más 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para la tinción nuclear. Otros dos enfoques para la tinción multiplexación simultánea se basan en espectrometría de masas iónquinassecundarias 9. El sistema de imágenes Hyperion utiliza citometría de masa de imágenes10 para detectar hasta 37 marcadores. Esta tecnología utiliza un cóctel de anticuerpos conjugados metálicos para manchar los tejidos, y áreas específicas de los tejidos son abladas por un láser y transferidas a un citómetro de masa donde se detectan los iones metálicos. Otra tecnología similar es la IONPath, que utiliza la tecnología de imágenes de haz iónico multiplexado11. Esta tecnología utiliza un instrumento de espectrometría de masas modificado y una fuente de iones de oxígeno en lugar de láser para ablar los anticuerpos conjugados de metal. Si bien todos estos enfoques simultáneos de tinción múltiple permiten la detección de múltiples marcadores, no se pueden subestimar los costos involucrados por la conjugación de ADN, hapens o metales a anticuerpos, la pérdida de tejido debido a la ablación y el procesamiento de imágenes extenso para la desmezcla. Además, los kits y los protocolos de tinción están actualmente disponibles sólo para los tejidos FFPE y el desarrollo de paneles personalizados implica tiempo y gastos adicionales.
El método de tinción múltiple secuencial, en cambio, incluye etiquetar el tejido con un anticuerpo en un marcador, desmontar para eliminar el anticuerpo, seguido de repeticiones secuenciales de este proceso para etiquetar múltiples marcadores12. La amplificación de señal de tiramida (TSA) es el método de multiplexación secuencial más utilizado. Otras dos tecnologías de multiplexación utilizan una combinación de métodos de tinción simultáneos y secuenciales. La plataformaCODEX 13 emplea un cóctel de anticuerpos conjugados con secuencias únicas de oligonucleótidos de ADN que finalmente se etiquetan con un fluoróforo utilizando un paso de polimerización indexado seguido de imágenes, desmontaje y repetición del proceso para detectar hasta 50 marcadores. El enfoque de tinción múltiple MultiOmyx14 es una iteración de tinción con un cóctel de tres a cuatro anticuerpos conjugados con fluoróforos, imágenes, temple los fluoróforos y repetición de este ciclo para detectar hasta 60 marcadores en una sola sección. Al igual que el método de tinción múltiple simultánea, mientras que se puede detectar una amplia gama de marcadores, el tiempo involucrado en la tinción, la adquisición de imágenes, el procesamiento y el análisis es extenso. El paso de desmontaje/enfriamiento implica calentar y/o blanquear la muestra de tejido y, por lo tanto, el enfoque secuencial de tinción multiplex a los tejidos FFPE que mantienen la integridad del tejido al calentarse o blanquear.
La fijación de formalina y la posterior incrustación de parafina se realiza fácilmente en un entorno clínico, los bloques de tejido son fáciles de almacenar y varios protocolos de tinción multiplex están disponibles. Sin embargo, el procesamiento, incrustación y desparafinación de los tejidos FFPE, así como la recuperación de antígeno15, un proceso por el cual los anticuerpos pueden acceder mejor a los epítopos, es lento. Además, el procesamiento implicado en los tejidos FFPE contribuye a la autofluorescencia16 y enmascara los epítopos diana, lo que resulta en la variabilidad y falta de clon de anticuerpos disponible para detectar antígenos en los tejidos FFPE17,,18,,19. Un ejemplo es el antígeno leucocito humano (HLA) clase I alelos20. Por el contrario, la congelación rápida de los tejidos no implica extensos pasos de procesamiento antes o después de la fijación, eludiendo la necesidad de recuperación de antígenos21,22, y lo que es beneficioso para detectar una gama más amplia de objetivos. Por lo tanto, el uso de tejidos congelados para la fluorescencia multiespectral puede ser valioso para detectar dianas para estudios preclínicos y clínicos.
Dadas las limitaciones mencionadas anteriormente al usar tejidos FFPE, preguntamos si se pueden realizar imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos congelados. Para abordar esta pregunta, probamos un método de tinción múltiple simultánea utilizando un panel de anticuerpos conjugados con fluoróforos para detectar múltiples antígenos y analizamos la tinción utilizando un sistema de imágenes multiespectrales semiautomáticos. Pudimos manchar simultáneamente hasta seis marcadores en una sola sección de tejido en un solo radio de 90 minutos.

<table><tbody><tr><td>Acetona (grado histológico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16F-1GAL</td><td>Tejidos de fijación</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-ratón CD3</td><td>BioLegend</td><td></td><td>100212 Clon - 17A2; anticuerpo primario conjugado</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, eBioscience anti-humano CD20</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>53-0202-82</td><td>Clon - L26; anticuerpo primario conjugado</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Ratón anti-Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>558617</td><td>Anticuerpo conjugado primario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-CD3</td> humano <td>BioLegend</td><td>300446</td><td>Clon - UCHT1; anticuerpo conjugado primario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-ratón CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100758</td><td>Clon - 53-6.7; anticuerpo conjugado primario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-CD8a</td><td>BioLegend</td><td>372906</td><td>Clon - C8/144B; anticuerpo</td></tr> <tr><td>primario conjugadoAlexa Fluor 647 anti-ratón CD206 (MMR)</td><td>BioLegend</td><td>141711</td><td>Clon - C068C2; anticuerpo conjugado primario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-ratón Anticuerpo CD4</td><td>BioLegend</td><td>100426</td><td>Clon - GK1.5; anticuerpo primario conjugado</td></tr><tr><td>C57BL/6 Ratón</td><td>Charles River Laboratories</td><td>27</td><td>Tejidos congelados de ratón utilizados para el entrenamiento multiespectral</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6016-6EA</td><td>Portaobjetos de rehidratación y lavado</td></tr><tr><td>Solución DAPI</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>564907 Tinción de ácido nucleico</td></tr><tr><td>Diapositivas cargadas de vidrio blanco diamante</td><td>DOT Scientific</td><td>DW7590W</td><td>Secciones de tejido adherentes</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x (sin Ca y Mg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21031CV</td><td>Lavado y diluyente</td></tr> Gold <tr><td>Seal Cover Slips ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>3306</td><td>Protección de los tejidos teñidos</td></tr><tr><td>Amígdala normal humana OCT bloque de tejido congelado</td><td>AMSBio</td><td>AMS6023</td><td>Tejido humano congelado utilizado para la tinción multiespectral Suero</td></tr><tr><td>humano 1x</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-512</td><td>Bloqueo y diluyente para tejidos humanos</td></tr><tr><td>inForm</td><td>Akoya Biosciences</td><td>Versión 2.4.1</td><td>Software de aprendizaje automático</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4</td><td></td><td></td><td>BioLegend 300529 Clon - RPA-T4; anticuerpo conjugado primario</td></tr><tr><td>PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clon - M1/70; anticuerpo primario conjugado</td></tr><tr><td>Fenográfico</td><td>Akoya Biosciences</td><td>Versión 1.0.8</td><td>Software de escaneo de portaobjetos</td></tr><tr><td>completo ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36965</td><td>Medio de montaje</td></tr><tr><td>Criostato de investigación</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Tejido de corte</td></tr><tr><td>Superblock 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37515</td><td>Bloqueo de tejidos de ratón</td></tr><tr><td>Solución O.C.T. Tissue-Tek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Tejidos de incrustación</td></tr><tr><td>Vectra 3.0 Sistema automatizado de imágenes de patología cuantitativa, 6 portaobjetos</td><td>Akoya Biosciences</td><td>CLS142568</td><td>Imágenes multiespectrales semiautomatizadas sistema</td></tr><tr><td>Vectra Software</td><td>Akoya Biosciences</td><td>Versión 3.0.5</td><td>Software para operar microscopio</td></tr></tbody></table>

un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Las imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos de parafina incrustada en formalina (FFPE) permiten la detección de múltiples marcadores en una sola muestra de tejido que pueden proporcionar información sobre la coexpresión de antígenos y la distribución espacial de los marcadores. Sin embargo, la falta de anticuerpos adecuados para los tejidos fijados con formalina puede restringir la naturaleza de los marcadores que se pueden detectar. Además, el método de tinción consume mucho tiempo. Aquí describimos un método rápido para realizar imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos congelados. El método incluye las combinaciones de fluoróforos utilizadas, pasos detallados para la tinción de tejidos congelados de ratón y humanos, y los procedimientos de escaneo, adquisición y análisis. Para el análisis de tinción, se utiliza un sistema de imágenes de fluorescencia multiespectral semiautomática disponible en el comercio. A través de este método, se teñen y detectaron hasta seis marcadores diferentes en una sola sección de tejido congelado. El software de análisis de aprendizaje automático puede fenotipo células que se pueden utilizar para el análisis cuantitativo. El método descrito aquí para los tejidos congelados es útil para la detección de marcadores que no se pueden detectar en tejidos FFPE o para los que los anticuerpos no están disponibles para los tejidos FFPE.

Detección de marcadores de un solo mancha en secciones de bazo congelado Como el sistema de imágenes semiautomatizadautiliza un sistema de filtro ajustable de cristal líquido (LCTF) que permite una gama más amplia de detección de longitud de onda25,y debido a que no se realizaron pasos de amplificación de señal aquí, primero optimizamos la detección de nuestros anticuerpos conjugados primarios para cada marcador en el microscopio. Un ejemplo se muestra en l...

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Este método es útil para detectar y co-localizar varios biomarcadores en una sola criosecta, incluidos marcadores que normalmente no se pueden detectar en secciones de parafina. Utilizando este método de tinción experimental, el tiempo de tinción se reduce significativamente y el método se puede realizar en cualquier laboratorio. Demostrar este método será Dinesh Jaishankar.Es un experto postdoctorado del laboratorio, y también el Núcleo de Evaluación de Inmunoterapia, Gerente de Instalaciones. Al seleccionar anticuerpos para el análisis, tenga en cuenta los conjuntos de filtros de excitación y emisión disponibles en el sistema de imágenes semiautomático. Y después de probar varias combinaciones de anticuerpos primarios conjugados con fluoróforo, prepare los fluoróforos para que se utilicen de modo que tenga una superposición espectral mínima como se sugiere en la tabla.Para la tinción multiplex, preparar un cóctel de anticuerpos con fluoróforos compatibles en delirios óptimos predeterminados, y añadir el cóctel a las secciones de tejido de interés. Para la tinción de un solo marcador, agregue el anticuerpo conjugado primario solo a la diapositiva. Para todas las tinciones, incluya

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Investigación

JoVE Journal

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Hemos desarrollado una técnica de procesamiento tisular que utiliza un vibratomo y tejido pulmonar incluido en agarosa para generar secciones pulmonares, lo que permite la adquisición de imágenes de alta resolución de la arquitectura pulmonar. Empleamos la tinción de inmunofluorescencia para observar la expresión espacial de proteínas utilizando marcadores estructurales pulmonares específicos.

Seccionamiento automatizado de vibratomo de tejido pulmonar incluido en agarosa para obtener imágenes de fluorescencia multiplex

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

El blanqueo iterativo espectral extiende la multiplexidad (IBEX) se basa en la técnica IBEX base al agregar bloqueo de heparina para minimizar la unión inespecífica y aprovechar la detección espectral con desmezcla computacional para suprimir la autofluorescencia. Este enfoque acelera la adquisición de imágenes al tiempo que reduce las fuentes de fondo, lo que permite análisis proteómicos espaciales robustos de múltiples rondas y altos parámetros.

Imágenes de alta plexación mediante microscopía confocal espectral para minimizar la fluorescencia tisular inespecífica

Aprende un método rápido de tinción para imágenes multiespectrales en tejidos congelados que permite detectar y co-localizar múltiples biomarcadores simultáneamente. Esta técnica reduce significativamente el tiempo de análisis y puede realizarse en cualquier laboratorio.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

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