Name: Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprende un método de cocultura para estudiar el crecimiento de neuritas en respuesta a señales paracrinas de pulpa dental usando células DP y neuronas TG. Esta técnica permite investigar la interacción celular y molecular en la inervación dental.

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Este trabajo fue apoyado por a) la beca National Institutes of Health/NIAMS (números de subvención R01 AR062507 y R01 AR053860 a RS), b) la beca de formación académica dental de la Universidad de Alabama en Birmingham (DART) (número T90DE022736 (PI MacDougall)) al PAS del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (DART) c) una subvención piloto y de viabilidad del Centro Global de Trastornos Craneofaciales, Orales y Dentales (GC-CODED) de la UAB a la PAS y d) al Instituto Nacional de Trastornos Dentales y Craneofaciales Investigación/Institutos Nacionales de Salud K99 DE024406 a Pas pasión.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) por sus úDS.
1. Preparación de placas
NOTA: Coverslips se puede utilizar para crear imágenes de celdas DP al final del ensayo. Asegúrese de que la tapa de la placa esté encendida durante todos los pasos de incubación y ensanación fuera de la campana de cultivo de tejido estéril para evitar la contaminación durante el procesamiento de la muestra.
<ol><li>
Preparación de cubreobjetos
	<ol>
<li>Autoclave de cubiertas circulares.</li>
		<li>Filtrar agua ultrapura debajo de la campana.</li>
		<li>Transfiera los cubrecones a una placa de 24 pocillos y cubra cada uno con 400 ml de poli-D-lisina de 0,1 mg/ml.</li>
		<li>Deje que los cubreobjetos se empapan, sumergidos durante 5 minutos, en un balancín a 12 rpm o agitador orbital a 40-50 rpm. Asegúrese de que la tapa esté encendida para evitar la contaminación.</li>
		<li>Enjuague los cubreobjetos con agua ultrapura filtrada durante unos 5 minutos en un balancín a 12 rpm o agitador a 50 rpm. Repetir.</li>
		<li>Deje que los cubreobjetos se sequen durante al menos 2 horas debajo de la capucha con la tapa de la placa apagada para facilitar la evaporación. Estos cubreobjetos deben utilizarse en un plazo de 48 h.</li>
		<li>Las células DP de semillas cubren los labios y el proceso al final del ensayo para la inmunofluorescencia (sección 3.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Filtros de recubrimiento
	<ol>
<li>Diluir la minin a 10 g/ml. Filtrar el laminin diluido debajo del capó.</li>
		<li>Pipetear 450-500 l de laminin a cada pocal de una placa de 24 pocillos.</li>
		<li>Colocar el filtro transwell, porosidad de 3 m, en un pozo para que entre en contacto con la solución laminina y déjela en una incubadora de 37oC durante 2 horas o durante la noche. Los poros de filtro deben permitir que parte de la solución se difunda y recubra tanto la parte superior como la parte inferior del filtro. Estos filtros deben utilizarse en un plazo de 48 h o refrigerarse a 4 oC durante un máximo de 1 semana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Revestimiento celular con manipulación genética opcional
<ol><li>Ratones: Se puede realizar una alteración genética de las células DP (pero no es necesaria) para estudiar las interacciones mesenquimal-neuronal. Consulte las secciones 2.3 y 2.4 para conocer las variaciones genéticas sugeridas.</li>
	<li>Disección DP, dispersión y chapado (Figura 1) NOTA: Para la disección DP, utilice fórceps ultrafinos y rectos. Los bordes ultrafinos permitirán al usuario cuñar el borde de forrteo entre la estructura mineralizada y el tejido DP.<ol><li>Cosecha de ratones P5-P8. En esta etapa, los dientes deben ser mineralizantes, y la raíz está abierta.</li>
		<li>Anestetiza los neonatos a través de hipotermia colocándolos en un plato en el refrigerador de 4oC hasta que ya no se muevan o respondan al tacto. Eutanasia de los neonatos por decapitación y de acuerdo con los procedimientos de la IACUC en las instalaciones designadas.</li>
		<li>Preparar una alícuota de 3-5 ml de 0.25% trypsin-EDTA en un tubo cónico de 50 ml para recoger el DP de cada ratón. Esto facilitará la digestión de la pulpa dental de ratones postnatales. Utilice más de 3 ml si digiere tejido de más de 10 ratones postnatales.</li>
		<li>Coloque la cabeza en una almohadilla inferior desechable para que la boca esté hacia el techo y la base del cuello esté plana en la superficie de trabajo. Utilice una cuchilla de afeitar en un movimiento de aserrado para separar la mandíbula del maxilar.</li>
		<li>Opcionalmente, retire la lengua con tijeras o con fórceps para permitir un acceso más fácil a los molares.</li>
		<li>Coloque la cabeza abierta en un plato sobre una gasa estéril y colóquela bajo un microscopio de disección(Figura 1D).</li>
		<li>Retire el tejido óseo alveolar que rodea los primeros molares. Los dientes submandibulares no están completamente en erupción en este punto. Inserte fórceps en la abertura alveolar y se bílegue sobre el tejido lejos del diente hacia el lado bucal (mejilla) o lingual (lengua) de la boca. Los dientes maxilares requerirán la extracción completa de la hendidura alrededor del diente para la exposición y extracción.</li>
		<li>Transfiera suavemente los primeros molares submandibulares y maxilares (M1s) a un plato de cultivo celular separado con 1 salina con búfer de fosfato (PBS).</li>
		<li>Repita 2.2.4-2.2.8 hasta que se recojan todos los M1. Mantenga el plato que contiene los M1 en hielo durante la cosecha.</li>
		<li>Retire el órgano exterior del esmalte (EOE) que rodea el exterior de cada M1. Esto se puede hacer alternativamente después del paso 2.2.11.</li>
		<li>Con un conjunto de fórceps, gire el M1 para que las cúspides estén abajo y la raíz abierta se exponga. Habrá una abertura ovalada en la parte inferior del diente, y tejido DP opaco encapsulado por una fina capa de dentina y esmalte.</li>
		<li>Usando la punta de los fórceps, afloje suavemente el PD ejecutando un brazo de los fórceps alrededor de la circunferencia interna del tejido mineralizado. Retire el tejido DP de la estructura mineralizada y transfieralo a un tercer plato que contenga 1 x PBS. Quite el EOE si aún no estaba separado(Figura 1E).</li>
		<li>Transfiera todo el tejido DP al 0,25% de trippsina-EDTA en un tubo cónico de 50 ml. Vortex la mezcla y colocar en un baño de agua caliente de 37 oC durante 10 minutos. Esto se puede hacer con los mismos fórceps o con fórceps largos del vial. El tejido será difícil de dispersar y requerirá vórtice cada 3-4 minutos. NO exceda la trippsinización de 10 minutos ya que la tripsina puede dañar las membranas celulares.</li>
		<li>Bajo una capucha estéril, agregue los medios de cocultivo calentados (Tabla 1) a una proporción final de al menos 1:1 medio para que la triplina indesactive la enzima. Las relaciones más grandes son aceptables si se desea más dispersión de tejido.</li>
		<li>Pipetee los medios hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de 10 ml para dispersar aún más el DP en los medios. Tenga cuidado de evitar burbujas grandes. La dispersión completa es casi imposible debido a la naturaleza pegajosa del tejido. Sin embargo, tampoco es necesario ya que las células migrarán hacia afuera desde el tejido una vez chapadas.</li>
		<li>Transfiera 1 ml del DP disperso a cada pocal de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos(Figura 1F).</li>
		<li>Colocar la placa en una incubadora a 37 oC y permitir que las células se adhieran y migren del tejido no disperso durante 48 horas antes de cambiar el medio. Las células primarias necesitan ser chapadas a concentraciones relativamente altas con el fin de alcanzar 85-90% de confluencia dentro de 1 semana. Si esto no se logra después de 1 semana, deseche la placa.</li>
	</ol></li>
	<li>Manipulación genética opcional de células DP
	<ol>
<li>Para alterar las vías de señalización celular, coseche las células DP de ratones nocaut genéticos o de ratones en los que un gen de interés esté flanqueado por sitios loxP. En este último caso, el gen se puede eliminar utilizando la recombinación Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) para eliminar el gen flanqueado, como se describe a continuación. Utilice Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) como virus de control para asegurarse de que la infección viral no causa una respuesta celular. NOTA: Ad-eGFP es controlado por el potenciador promotor CMV, que es muy fuerte. Ad-Cre-GFP está regulado por un IRES, una región reguladora interna entre el Cre y el GFP, que no es muy fuerte. Esto resulta en una fluorescencia más brillante en las células Ad-eGFP que las células Ad-Cre-GFP. Confirmar niveles de infección equivalentes basados en el número total de células fluorescencia, no en los niveles de fluorescencia celular.</li>
		<li>Preparar 500 ml de medios que contengan virus y 10 g/ml de polibrino por poca. El polibreno ayuda con la infección viral en células cercanas a la confluencia10. Este protocolo se basa en una multiplicidad de infección (MOI) de 100 para Ad-eGFP y 200 Ad-Cre-GFP para una infección génica eficiente con poco o ningún efecto sobre la viabilidad celular. El número de celda estimado es 4 x 104 células/pozo de una placa de 24 pocillos: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60809/60809equ01.jpg">
</li>
		<li>Mezcle los medios con un breve vórtice o pipeteo y agregue 500 l a cada poca.</li>
		<li>Después de las 24 h, agregue 500 ml adicionales de medios de cocultura que no contengan polibrino o virus adicionales.</li>
		<li>Después de un total de 48 h, aspirar medios que contengan virus y reemplazarlos con nuevos medios de cocultura. En este punto, las neuronas TG se pueden agregar sobre filtros transwell.</li>
	</ol></li>
	<li>Disección, dispersión y chapado de neuronas trigéminos NOTA: En este protocolo, la toma de imágenes del crecimiento de neurita en el cocultivo con células DP se optimizó utilizando adolescentes (6 semanas de edad) B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J ratones. Los sistemas nerviosos centrales y periféricos de los ratones Thy1-YFP tienen una etiqueta de proteína fluorescente amarilla (YFP) cuya expresión comienza alrededor de P6-P10 en las neuronas y aumenta exponencialmente en todo el sistema nervioso durante la vida postnatal y adulta11,12. YFP y GFP han conservado secuencias que permiten que estos nervios se tiñen con anticuerpos anti-GFP, lo que resulta en una mancha panneuronal. En última instancia, estos ratones permiten una mejor visualización y cuantificación de las neuronas utilizadas y cultivadas en el cultivo celular.<ol><li>Eutanasia ratones adolescentes con dióxido de carbono seguido de luxación cervical.</li>
		<li>Decapita a los ratones y retira la piel del cráneo. Asegúrese de incluir números equivalentes de machos y hembras.</li>
		<li>Inserte la punta de un par de tijeras de micro-disección en la base del cráneo. Corte a lo largo de la sutura sagital del cráneo(Figura 1A).</li>
		<li>Hacer cuatro pequeños cortes horizontales: dos a lo largo de las suturas coronales por las orejas, y dos a lo largo de las suturas lambdoidas en la base del cráneo. Esto debería crear dos colgajos de hueso.</li>
		<li>Usa los fórceps para pelar los dos colgajos de hueso. Esto debería revelar el cerebro.</li>
		<li>Quita el cerebro. Transfiera la cabeza a un plato de cultivo de tejido con 1 x PBS y colóquela bajo el microscopio.</li>
		<li>Localizar el tanda del TG, que es fácilmente visible en los roedores13,alojados en la dura materia entre el cerebro y el hueso del proceso maxilar(Figura 1B).</li>
		<li>Corta las tres ramas que viajan a los ojos, el maxilar y la mandíbula y transfiere los ganglios a 1o PBS frío usando fórceps finos de borde recto. Mantenga el plato que contiene los ganglios TG en hielo durante la cosecha.</li>
		<li>Una vez cosechados todos los paquetes de TG, transfiera los ganglios a un tubo cónico de 50 ml que contenga 5 mg/ml de colagenasa filtrada estérilmente tipo II utilizando fórceps de vial.</li>
		<li>Vortex la colagenasa con el haz de TG y colocar el tubo en un baño de agua de 37 oC durante 25-30 min. Durante este tiempo, saque el tubo cónico del baño de agua, vórtice y vuelva al baño cada 5-10 minutos.</li>
		<li>Centrifugar la solución de neurona de colagenasa-TG durante 2 min a 643 x g.</li>
		<li>Bajo una capucha de cultivo de tejido, aspira suavemente la colagenasa con una micropipette.</li>
		<li>Añadir 5 ml de 1% de trippsina filtrada estérilmente tipo II y vórtice. Colocar el tubo cónico en un baño de agua de 37oC durante 5 min.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla trypsin-TG durante 5 min a 643 x g. Retire la parte superior de la trippsina con un micropipeta, de modo que no se eliminen las neuronas TG. Todavía habrá líquido en el tubo.</li>
		<li>Agregue suficientes medios para desactivar la trippsina restante (en una proporción 1:1 o inferior de trippsina a medios).</li>
		<li>Cuente el número de células y diluya la solución a 200.000 células/ml (250 ml de 50.000 células que contienen células).</li>
		<li>Coloque los filtros transwell recubiertos de la sección 1.2 en pozos con DP.</li>
		<li>Diluir la solución que contiene células de modo que haya 200.000 células/ml. Pipetear 250 l sobre el filtro transwell y cultivar las células a 37 oC durante la noche(Figura 1F).</li>
		<li>Al día siguiente, sustituya los medios por 1 ml de medios de cocultivo por 1 m de uridina y 15 M 5'-fluor-2'desoxiuridina para detener la sobreproliferación de células mesenquimales que pueden prevenir el crecimiento de neurita. Opcional: Agregue factores de crecimiento o inhibidores en este medio si intenta una manipulación adicional.</li>
		<li>Comate las celdas para obtener puntos de tiempo deseados adicionales. Este protocolo fue optimizado para 5 días totales de cultivo con los medios cambiados sólo el día 2 para agregar inhibidores mitóticos. Los períodos de tiempo más largos requerirán cambios adicionales en los medios.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Recolección y procesamiento de muestras
<ol><li>Tinción del trigémino
	<ol>
<li>Pipetear 1 ml de alícuotas de 1x PBS estéril en una placa de 24 pocillos bajo una campana de cultivo de tejido para cada filtro transwell a procesar.</li>
		<li>Retire el líquido encima del filtro con una pipeta de 200-1.000 l, teniendo cuidado de dejar intactas las capas celulares. Las células conectadas deben permanecer unidas y las células no conectadas se soltarán durante este suave pipeteo. Un filtro de vacío puede dañar la capa celular y no se recomienda para la aspiración.</li>
		<li>Transfiera el filtro a la placa 1x PBS, asegurándose de eliminar la capa superior de medios como se mencionó en el paso anterior.</li>
		<li>Coloque la placa con todos los filtros y tapas transwell en un balancín a 12 rpm o 40-50 rpm en un agitador orbital durante 10 minutos.</li>
		<li>Aspirar el PBS, incluyendo la capa superior como se describió anteriormente, añadir 500 s de 1xPBS y colocar en el balancín o agitador orbital para un enjuague adicional de 5-10 minutos.</li>
		<li>Aspirar el 1x PBS una vez más y reemplazar con 4% de paraformaldehído (PFA). Utilice al menos 500 ml para que toda la superficie del filtro esté sumergida. Coloque la placa en un balancín a 12 rpm o agitador orbital a 40-50 rpm a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
		<li>Retire el PFA y enjuague las placas dos veces durante 5-10 min cada una en un balancín con 500 s de 1x PBS.</li>
		<li>Bloquear con albúmina sérica 10% bovina (BSA) + 5% de suero de cabra/donkey, dependiendo del animal huésped de anticuerpos secundarios, en 0.05% Tween-1xPBS (PBST). Utilice 450-500 ml de solución para que el filtro se sumerja en el líquido. NOTA: En esta etapa, estas placas se pueden almacenar a 4 oC durante varios meses para procesarlas más adelante. Utilice el parafilm para sellar la placa para asegurarse de que la evaporación no se produzca y compruebe regularmente la evaporación para que las superficies del filtro permanezcan sumergidas.</li>
		<li>Retire el bloque y agregue 450-500 s de anticuerpo primario en 1% BSA-PBST sin un enjuague adicional. Incubar a 4oC durante la noche, balanceándose suavemente.</li>
		<li>Retire la solución primaria de anticuerpos y enjuague con 500 ml de 1xPBST en un balancín, 3 veces, a temperatura ambiente</li>
		<li>Retire el PBST, agregue el anticuerpo secundario e incubar en un balancín durante la noche a 4 oC envuelto en papel de aluminio para proteger a los fluoróforos de la degradación de la luz. Enjuague de nuevo, 3 veces, con 1pbST en un balancín a temperatura ambiente. Reemplace por 1pbS. NOTA: En este punto, la placa se puede almacenar durante varios meses a 4 oC si se envuelve en papel de aluminio para evitar la degradación del fluoróforo. Utilice el parafilm para sellar la placa para asegurarse de que la evaporación no se produzca y compruebe regularmente la evaporación para que las superficies del filtro permanezcan sumergidas. Lo mejor es crear una imagen en el plazo de un mes.</li>
		<li>Para obtener imágenes óptimas, utilice las neuronas de ratón Thy1-YFP con un anticuerpo anti-GFP para manchar específicamente los aferentes neuronales muy por encima de los niveles de fondo. Utilice Anti-Neurofilamento 200 para manchar con precisión las estructuras axonales si los ratones Thy1-YFP no están disponibles.</li>
		<li>Imagen como se desee. Los filtros no necesitan ser chapados y en su lugar se pueden colocar sobre un cubreobjetos o deslizarse para obtener imágenes con un microscopio invertido. NOTA: Las áreas del filtro no contendrán estructuras aferentes. Tome varias imágenes con una profundidad de pila z que capture todas las estructuras aferentes. Utilice el software de costura para visualizar el crecimiento de neurita en áreas grandes, o (preferiblemente) regiones de filtro enteras.</li>
	</ol></li>
	<li>Recolección de ARN, proteínas y medios
	<ol>
<li>Mientras se procesan los filtros transwell, recoja los medios en tubos libres de ARNi/DNAse y se congele para ensayos posteriores (ELISA, proteómica, etc.).</li>
		<li>Inmediatamente después de la recolección de medios, tampón de lisis alícuota o ensayo de precipitación de radio inmuno (RIPA) tampón con inhibidores de la proteinasa y la fosfatasa en los pozos. Este protocolo fue optimizado para 100 l/bien en una placa de 24 pocillos.</li>
		<li>Permita que los tampones a las células de la durante 5 minutos, luego raspe cada filtro con una nueva punta de pipeta y recoja las muestras de células en tubos libres de ARNI/ADN. Congele la lisis para futuros ensayos (PCR semicuantitativo y/o cuantitativo, Western blot, etc.).</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunofluorescencia opcional de células de pulpa dental:
	<ol>
<li>Levante suavemente los cubreobjetos de la Sección 1.1 con fórceps y transfieralos a diferentes pozos con un 4% de PFA durante 1 h con balanceo.</li>
		<li>Aspirar PFA y enjuagar los labios de las cubiertas dos veces con 1x PBS. Siga esto con permeabilización, bloqueo e inmunofluorescencia para marcadores de interés con técnicas de inmunofluorescencia estándar.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las actividades diarias de la cavidad oral requieren que los dientes sienten los estímulos externos y la inflamación interna con el fin de permitir el uso adecuado y el mantenimiento. Sin embargo, sólo se dispone de información limitada con respecto a las señales que impulsan los procesos de desarrollo de la inervación dental. Este protocolo proporciona un método para aislar y co-cultivar células DP primarias y neuronas TG con el fin de estudiar la comunicación cruzada entre las dos poblaciones. Se optimizaron varias var...

La inervación dental permite que los dientes perciban la presión, la temperatura y la inflamación, todos los cuales son cruciales para el uso y mantenimiento del órgano dental. La falta de detección del dolor dental asociado con la caries dental y el trauma tensias conduce a la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, la inervación adecuada es un requisito para el crecimiento normal de los dientes, la función y el cuidado.
Mientras que la mayoría de los órganos son completamente funcionales e inervados en el momento del nacimiento, el desarrollo dental se extiende a la vida adulta, con la inervación dental y la mineralización que se produce en concierto durante las etapas postnatales1,2. Curiosamente, el mesenquimo de pulpa dental (DP) inicialmente secreta señales repelentes durante la embriogénesis para evitar la entrada de axón en el órgano dental en desarrollo, que más tarde se desplaza a la secreción de factores de atracción a medida que el diente se acerca a la erupción3,4. Durante las etapas posnatales, los axones aferentes del nervio trigémino (TG) penetran en y a lo largo del diente alrededor del momento en que comienza la deposición de la dentina (revisado en Pagella, P. et al.5). Varios estudios in vivo han demostrado que las interacciones neuronales-mesenquimales guían la inervación dental en ratones (revisado en Luukko, K. et al.6), pero pocos detalles de los mecanismos moleculares están disponibles.
Los cocultivos celulares proporcionan entornos controlados en los que los investigadores pueden manipular las interacciones entre las poblaciones neuronal y mesenquimales. Los experimentos de cocultivo permiten profundizar en las vías de señalización que guían la inervación y el desarrollo de los dientes. Sin embargo, varios de los métodos convencionales utilizados para estudiar células en cocultivo presentan desafíos técnicos. Por ejemplo, la tinción violeta cristalina del crecimiento de neurita puede manchar no específicamente las células Schwann incluidas en las dispersiones del haz tG, y puede haber picos de intensidad de color con respuestas relativamente pequeñas7. Las cámaras microfluídicas ofrecen una opción atractiva, pero son considerablemente más caras que los filtros transwell8,9 y solo permiten la investigación de las respuestas neuronales a las secreciones del PD. Para abordar estos problemas, hemos desarrollado un protocolo que permite: a) la tinción precisa y la toma de imágenes del crecimiento de neurita TG en respuesta a las secreciones de DP, b) la modificación genética de las células DP y / o neuronas TG para investigar vías de señalización específicas, y c) la investigación de las respuestas celulares DP a los factores secretados por las neuronas TG. Este protocolo proporciona la capacidad de investigar con precisión varias características de la inervación dental en el entorno controlado de un ensayo de cocultivo in vitro.

<table><tbody><tr><td>5-fluoro-2'-desoxiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>utilizado como inhibidor mitótico a 15 &mu; Concentración de M en medios de cocultivo, Día 2</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Placa de cocultivo</td></tr><tr><td>Alexa-546 Anti-pollo</td><td>Invitrogen</td><td>A-11040</td><td>Secundario a la tinción de crecimiento de neuritas marcado por anticuerpo anti-GFP, dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP</td><td>Aves Lab, Inc</td><td>GFP-1010</td><td>Anticuerpo primario para marcar neuronas Thy1-YFP, dilución 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Neurofilamento 200 anticuerpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NO142</td><td>Anticuerpo primario monoclonal para marcar neuronas, dilución 1:1000, alternativa si no se dispone de ratones YFP</td></tr><tr><td>B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>12603</td><td>Tgfbr2f/f modelo de ratón utilizado para células de pulpa dental en el protocolo optimizado</td></tr><tr><td>B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3709</td><td>Thy1-YFP Genotipo modelo de ratón utilizado para las neuronas del trigémino</td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo II</td><td>Millipore</td><td>234155-100MG</td><td>Utilizado para dispersar las neuronas del trigémino</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10437</td><td>Aditivo para medios de cocultivo</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11413-11</td><td>Pinzas finas para la disección de TG</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Recubre los insertos transwell a una concentración final de 10 &mu; g/ml, se supone que la solución madre es de 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Tampón de lisis (tampón RLT)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Extractos de ARN de células de pulpa dental post-cocultivo</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td></td><td>25030081 Aditivo a medios de cocultivo Tijeras</td>de</tr><tr><td>microdisección</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>Tijeras de disección para abrir el cráneo</td></tr><tr><td>Microscopio Cubreobjetos</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-81</td><td>Cubreobjetos circulantes para el cultivo celular opcional y el procesamiento de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo A</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>Base de medios de cocultivo</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>Aditivo antibiótico para medios de cocultivo</td></tr><tr><td>Inhibidor de la fosfatasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04 906 837 001</td><td>Aditivo para el tampón RIPA para la extracción de proteínas de las células de la pulpa dental co-cultivo</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>Se utiliza para ayudar en la transfección de células de la pulpa dental</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>Recubrimiento de cubreobjetos para ayudar a la adhesión celular de la pulpa dental</td></tr><tr><td>Inhibidores de la proteasa</td><td>Millipore</td><td>05 892 791 001</td><td>Aditivo para el tampón RIPA para extraer proteínas de las células de la pulpa dental post-cocultivo</td></tr><tr><td>Tubos de Eppendorf sin ARNasa/ADNasa</td><td>Denville</td><td>C-2172</td><td>Tubos preesterilizados de 1,7 ml para la recogida de ARN, ADN o proteínas al final del ensayo</td></tr><tr><td>Inserto de cultivo celular ThinCert</td><td>Bio-One</td><td>662631</td><td>Transwell insertos para neuronas del trigémino en ensayos de cocultivo</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Utilizado para dispersar células de pulpa dental</td></tr><tr><td>Tripsina Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-7409</td><td>Se utiliza para dispersar neuronas del trigémino</td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>Pinzas ultrafinas para disección</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>Utilizado como inhibidor mitótico a 1 &mu; Concentración de M en medios de cocultivo, Día 2</td></tr><tr><td>Sistema de filtración al vacío</td><td>Millipore</td><td>SCNY00060</td><td>filtro desechable Steriflip, 50 &mu; m filtro de red de nailon</td></tr><tr><td>Pinzas para viales</td><td>Fine Science Tools</td><td>110006-15</td><td>Pinzas largas para la transferencia de tejidos a cónicas</td></tr></tbody></table>

un método de cocultura para estudiar el crecimiento de neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

La inervación dental permite que los dientes perciban la presión, la temperatura y la inflamación, todos los cuales son cruciales para el uso y mantenimiento del órgano dental. Sin la inervación sensorial, las actividades orales diarias causarían daños irreparables. A pesar de su importancia, los papeles de la inervación en el desarrollo y mantenimiento de los dientes se han pasado por alto en gran medida. Varios estudios han demostrado que las células DP secretan proteínas de matriz extracelular y señales paracrinas para atraer y guiar los axones TG dentro y a lo largo del diente. Sin embargo, pocos estudios han proporcionado información detallada sobre la conversación cruzada entre el mesenquime DP y los afferents neuronales. Para abordar esta brecha en el conocimiento, los investigadores han comenzado a utilizar cocultivos y una variedad de técnicas para investigar estas interacciones. Aquí, demostramos los múltiples pasos involucrados en el co-cultivo de células DP primarias con neuronas TG dispersas en un filtro transwell overlying con poros de gran diámetro para permitir el crecimiento axonal a través de los poros. Las células primarias de DP con el gen de interés flanqueado por sitios loxP se utilizaron para facilitar la eliminación de genes utilizando un sistema de recombinación Adenovirus-Cre-GFP. El uso de neuronas TG del ratón Thy1-YFP permitió imágenes precisas aferentes, con una expresión muy por encima de los niveles de fondo mediante microscopía confocal. Las respuestas DP se pueden investigar a través de la recolección y análisis de proteínas o ARN, o alternativamente, a través de la tinción inmunofluorescente de células DP chapadas en tapas de vidrio extraíbles. Los medios se pueden analizar utilizando técnicas como los análisis proteómicos, aunque esto requerirá agotamiento de la albúmina debido a la presencia de suero bovino fetal en los medios. Este protocolo proporciona un método simple que se puede manipular para estudiar las respuestas morfológicas, genéticas y citoesqueléticas de las neuronas TG y células DP en respuesta al entorno controlado de un ensayo de cocultivo.

Estos resultados muestran que el crecimiento de la neurita TG se incrementó en presencia de células DP primarias en el pozo subyacente en comparación con el control del monocultivo de neurita TG(Figura 2A,C). Hay cierta variabilidad de ensayo a ensayo en el crecimiento de neurita. Por lo tanto, un monocultivo de neurona TG debe incluirse en todos los ensayos como un control para detectar los niveles basales de crecimiento de neurita. Las células primarias del ratón Tgfbr2<su...

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Este protocolo proporciona un esquema detallado de cómo co-cultivar células madre de pulpa dental con neuronas trigéminas. Con él, podemos investigar múltiples respuestas impulsadas por su interferencia. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de estudiar y manipular cualquiera o ambas poblaciones celulares y medir con precisión los resultados.Este método tiene relevancia directa para la investigación neuronal y podría proporcionar información sobre la investigación sobre cómo las células madre de pulpa dental reparan el tejido neural dañado por eventos traumáticos o enfermedades neurodegenerativas. Hay varias etapas de esta técnica para aprender y puede ser difícil mantener el tracto de todos ellos. Este protocolo detalla cada etapa para ayudar con eso.La pulpa dental y los ganglios son difíciles de dispersar y requieren varios vórtices y pipeteos. Incluso entonces no obtendrá una dispersión completa, por lo que se requerirá optimización y réplicas. Después de la eutanasia del ratón, coloque la cabeza en el panel inferior desechable para que la boca esté hacia el techo y la base del cuello sea plana en la superficie de trabajo.Utilice una cuchilla de afeitar y un movi

a-co-culture-method-to-study-neurite-outgrowth-response-to-dental

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Demostramos cómo diseccionar y la cultura de pollo ganglio statoacoustic E4 y E6 explantes de la médula espinal. Los explantes se cultivaron en condiciones libres de suero en geles de colágeno en 3D durante 24 horas. La capacidad de respuesta neuritas se prueba con el factor de crecimiento medio suplementado y con recubrimiento de proteínas cuentas.

La disección del ganglio y Cultura polluelo Statoacoustic y explantes médula espinal en geles de colágeno para ensayos neurite

El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los...

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Este video muestra una técnica para establecer un cocultivo de neuronas trigémino y células primarias de pulpa dental utilizando un filtro transwell. En esta condición físicamente separada, las células mesenquimales obtenidas del tejido de la pulpa dental secretan moléculas de señalización paracrina que atraviesan los poros, promoviendo la diferenciación y migración de las neuronas hacia las células mesenquimales estableciendo un sistema de cocultivo.

Establecimiento de un cocultivo de células de pulpa dental y neuronas del trigémino para la comunicación cruzada

Este video muestra la utilización de un dispositivo microfluídico para estudiar las interacciones entre la pulpa germinal dental y los ganglios del trigémino. Muestra la ubicación de los tejidos dentro del dispositivo microfluídico y proporciona una visualización detallada del crecimiento de la neurita trigémino hacia el germen dental a través de las microranuras del dispositivo. Además, destaca el papel de los factores moleculares derivados del diente en la promoción o inhibición de la...

Análisis de las interacciones entre el germen dental y los ganglios del trigémino mediante un sistema de cocultivo microfluídico

Ganglios de la raíz dorsal (DRG) son estructuras que contienen las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. Cuando disociado, pueden ser co-cultivadas con células madre-SC como derivadas de tejido adiposo (ASC), que proporciona un valioso modelo para estudiar la regeneración in vitro en los nervios y la mielinización, imitando el entorno en vivo en el sitio de la lesión.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Los cocultivos representan un método valioso para estudiar las interacciones entre los nervios y los tejidos y órganos diana. Los sistemas microfluídicos permiten el cocultivo de ganglios y órganos o tejidos enteros en desarrollo en diferentes medios de cultivo, lo que representa una valiosa herramienta para el estudio in vitro de la diafonía entre las neuronas y sus dianas.

Análisis de Desarrollo del diente Germ Inervación Uso de dispositivos de microfluidos Co-cultura

Ofrecemos protocolos para la evaluación de las células madre mesenquimales aisladas de la pulpa dental e interacciones de la célula de cáncer de próstata basadas en métodos directos e indirectos de la cultura Co. Condición media y trans-bien membranas son adecuadas analizar actividad paracrina indirecta. Siembra diferencialmente teñidas células juntos es un modelo apropiado para la interacción directa de la célula.

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido de la pulpa y cocultivo con células de cáncer para estudiar sus interacciones

Aquí presentamos un protocolo para aislamiento de células de la pulpa Dental humana y propagación con el fin de evaluar la expresión de la proteína del prión durante el proceso de diferenciación neuronal.

Aislamiento, propagación y expresión de la proteína del prión durante la diferenciación Neuronal de células madre de pulpa Dental humana

Aquí, proporcionamos un método para analizar el comportamiento del crecimiento de axons en matrices 3D, imitando su desarrollo natural.

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

Este artículo proporciona una guía paso a paso para establecer un cultivo primario de células madre de pulpas dentales utilizando el método de cultivo de explantes y la caracterización de estas células basada en las directrices del ICSCRT. Las células aisladas por este protocolo pueden considerarse como células madre mesenquimales para aplicaciones posteriores.

Cultivo primario de células madre de pulpa dental

Este protocolo describe los métodos para establecer cultivos de montaje completo y disociados de ganglios de raíz dorsal de ratón (DRG) y su uso para evaluar las interacciones tumor-nervio.

Establecimiento de modelos in vitro del cultivo de ganglios de la raíz dorsal: enfoques complementarios para investigar la diafonía entre el cáncer y los nervios

Aprende un método de cocultura para estudiar el crecimiento de neuritas en respuesta a señales paracrinas de pulpa dental usando células DP y neuronas TG. Esta técnica permite investigar la interacción celular y molecular en la inervación dental.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

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