Name: Ajuste magnético de la carga posterior en los tejidos cardíacos diseñados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a ajustar la carga posterior en tejidos cardíacos diseñados mediante una plataforma magnética no invasiva. Este método permite estudiar el desarrollo de fuerza tisular y la remodelación cardiaca en condiciones controladas durante períodos prolongados de cultivo.

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Los autores agradecen a Jutta Starbatty por su apoyo en el trabajo de cultivo de tejidos, Axel Kirchhof por la fotografía, Alice Casagrande Cesconetto por el trabajo de edición, y un agradecimiento especial a Aksehirlioglu por el apoyo técnico en el desarrollo de este dispositivo. B.B. fue apoyado por una beca DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), M.L.R. por una beca de beca federal postdoctoral Whitaker y M.N.H. por fondos de la DZHK.

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TE y MNH son cofundadores de EHT Technologies GmbH. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito en este documento describe una nueva técnica para alterar magnéticamente la descarga posterior en tejidos cardíacos de ingeniería. Esta técnica se basa en el uso de una etapa piezoeléctrica para traducir una placa de imanes fuertes hacia y lejos de bastidores magnéticamente sensibles de postes de silicona. Cuanto más cerca estén los dos conjuntos de imanes, más fuerte será la carga posterior experimentada por los EHT cultivados en ellos.
Hay varios pasos que son críticos ...

Después de la carga es la carga sistólica en el ventrículo después de que ha comenzado a expulsar sangre1. Durante el desarrollo cardíaco, una carga posterior adecuada es de importancia crítica para la maduración de cardiomiocitos2. En la edad adulta, los niveles bajos de carga posterior ventricular (por ejemplo, en pacientes postrados en cama con lesión medular de alto nivel3 o en casos muy especiales como el vuelo espacial4) pueden dar lugar a la hipotrofia del corazón. Por el contrario, una alta carga posterior puede conducir a hipertrofia cardíaca5. Mientras que la hipertrofia cardíaca en atletas de resistencia o mujeres embarazadas se considera beneficiosa y fisiológica, la hipertrofia asociada con hipertensión arterial a largo plazo o estenosis de la válvula aórtica grave es perjudicial ya que predispone a una arritmias cardíacas e insuficiencia cardíaca6. Aunque la tasa de mortalidad a 5 años de los pacientes con insuficiencia cardíaca se ha reducido del 70% en la década de 19806 a 40–50%7 en la actualidad, todavía existe una gran necesidad de nuevas opciones de tratamiento terapéutico para esta condición altamente prevalente (actualmente 2,2% de la población en el mundo occidental)8.
Con el fin de investigar los mecanismos moleculares de la hipertrofia cardiaca patológica y probar estrategias preventivas o terapéuticas para el tratamiento de esta enfermedad, se han desarrollado modelos in vivo de poscarga99,10,,11,,12. Si bien estos modelos han ofrecido información beneficiosa sobre los efectos de la carga posterior en el rendimiento ventricular, no permiten un control fino sobre la magnitud de la carga posterior. Alternativamente, los estudios in vitro de la carga posterior realizados en corazones extirpados y preparaciones musculares permiten un control más preciso sobre la carga de tejidos, pero estos modelos no son propicios para estudios longitudinales13,,14,,15.
Para superar estos problemas, desarrollamos un modelo in vitro de postcarga elevada en tejidos cardíacos de ingeniería (EHT)16,,17. Este modelo es un formato de cultivo tridimensional para células de corazón de rata incrustadas en una matriz de fibrina suspendida entre postes de silicona huecos flexibles. Estos tejidos laten espontáneamente (contra la resistencia de los postes de silicona) y realizan trabajos auxiliares. Hemos aumentado la carga posterior aplicada a los EHT en un factor de 12 en experimentos anteriores mediante la inserción de llaves metálicas rígidas en los postes de silicona huecos durante una semana. Esto condujo a una multitud de cambios, característicos de la hipertrofia cardíaca patológica18,,19,20: hipertrofia de cardiomiocitos, necroptosis parcial, disminución de la fuerza contráctile, deterioro de la relajación tisular, reactivación del programa genético fetal, un desplazamiento metabólico de la oxidación de ácidos grasos a glucólisis anaeróbica, y un aumento de la fibrosis. Aunque este procedimiento se ha empleado con éxito en varios estudios17,21,22, tiene algunas desventajas. Sólo hay dos estados, bajo o muy alto (12 veces) después de la carga, y el procedimiento requiere el manejo manual de los EGT, lo que limita su flexibilidad temporal y plantea el riesgo de contaminación.
Recientemente, Leonard y otros utilizaron una técnica similar para modular la carga posterior en EHT cultivados en postes de silicona23. Se colocaron llaves de diferentes longitudes alrededor del exterior de los postes para restringir su movimiento de flexión. Los autores de este estudio informaron que un aumento singular de la carga de fuerza mejorada desarrollo de la fuerza y maduración de EHT derivados de iPS humanos, mientras que las cargas más altas resultaron en un estado patológico. Sin embargo, al igual que nuestro propio sistema, esta técnica sólo permite aumentos singulares en la carga posterior, cuya magnitud está dictada por la longitud de los frenos. Como tal, las alteraciones finas en la carga posterior, las modificaciones en la carga posterior a lo largo del tiempo, y los regímenes de carga precisos no son posibles con estas técnicas.
Aquí, proporcionamos el protocolo para un sistema que se puede utilizar para modular la post-resistencia, es decir, la carga posterior de EhTs magnéticamente24. Esta plataforma facilita el ajuste preciso de la carga posterior, permite los regímenes de postcarga definidos por el usuario y garantiza la esterilidad de EHT.

<table><tbody><tr><td>Imanes de placa cilíndrica</td><td>HKCM</td><td>9962-55184</td><td>h = 14 mm, d = 13 mm</td></tr><tr><td>Postes magnéticos cilíndricos</td><td>HKCM</td><td>9962-63571</td><td>h = 2 mm, d = 0,5 mm</td></tr><tr><td>Alambre dental</td><td>Ormco</td><td>266-1316</td><td>d = 0,016 pulgadas (0,406 mm)</td></tr><tr><td>GraphPad GraphPad</td><td>Software, La Jolla, California, EE. UU</td>. <td>versión 6.00 para Windows</td><td></td></tr><tr><td>Software de control de movimiento para motor piezoeléctrico</td> Descarga gratuita de <td>Micronix USA</td><td></td><td>en la página de inicio del fabricante</td></tr><tr><td>Controlador de movimiento para motor piezoeléctrico</td><td>Micronix USA</td><td>MMC-100-01000</td>Optical plataforma de análisis de <td></td></tr><tr><td>contractilidad</td><td>EHT technologies</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>Motor lineal piezoeléctrico</td><td>Micronix USA</td><td>PPS-20-15206</td><td>equipado con codificador óptico lineal, incubadora-entorno </td></tr><tr><td>compatible Barra de estireno</td><td>Plastruct</td><td>MR-15</td><td>d = 0.015 pulgadas (0.381 mm)</td></tr><tr><td>Cámara USB</td><td>Reichelt Elektronik</td><td>REFLECTA 66142</td><td></td></tr></tbody></table>

ajuste magnético de la carga posterior en los tejidos cardíacos diseñados

Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues

Se sabe que la carga posterior impulsa el desarrollo de estados cardíacos fisiológicos y patológicos. Como tal, el estudio de los resultados de los estados alterados de la carga posterior podría proporcionar información importante sobre los mecanismos que controlan estos procesos críticos. Sin embargo, actualmente falta una técnica experimental para afinar con precisión la descarga posterior en el tejido cardíaco con el tiempo. Aquí, se describe una técnica basada en magnéticos recientemente desarrollada para lograr este control en tejidos cardíacos de ingeniería (EHT). Con el fin de producir EHT magnéticamente sensibles (MR-HIF), los tejidos se montan en postes de silicona huecos, algunos de los cuales contienen pequeños imanes permanentes. Un segundo conjunto de imanes permanentes se ajusta a presión en una placa de acrílico de tal manera que están orientados con la misma polaridad y están alineados axialmente con los imanes de poste. Para ajustar la carga posterior, esta placa de imanes se traduce hacia (mayor carga posterior) o lejos (carga posterior inferior) de los imanes de poste utilizando una etapa piezoeléctrica equipada con un codificador. El software de control de movimiento utilizado para ajustar el posicionamiento de la etapa permite el desarrollo de regímenes de postcarga definidos por el usuario, mientras que el codificador garantiza que la etapa corrige cualquier incoherencia en su ubicación. Este trabajo describe la fabricación, calibración e implementación de este sistema para permitir el desarrollo de plataformas similares en otros laboratorios de todo el mundo. Se incluyen resultados representativos de dos experimentos separados para ejemplificar la gama de diferentes estudios que se pueden realizar con este sistema.

Cuantificación de rigidez del poste del imán Un poste de silicona con respuesta magnética horizontal se montó en una posición fija, y se colocó un imán de calibración alineado axialmente a varias distancias definidas ("espaciados de imán") de este poste. Las cargas de prueba de peso conocido se suspendieron del extremo del poste de silicona, haciendo que el poste se doblara. Esta desviación se cuantificó ópticamente. Se observó una relación lineal entre la fuerza gravitacional de la carga de prueba y ...

Este protocolo proporciona métodos detallados que describen la fabricación e implementación de una plataforma de ajuste de la carga posterior basada en magnéticos para tejidos cardíacos diseñados.

Ajuste magnético de la carga posterior en los tejidos cardíacos diseñados

Afterload is known to drive the development of both physiological and pathological cardiac states. As such, studying the outcomes of altered afterload ...

Este sistema se puede utilizar para exponer los tejidos cardíacos diseñados a diferentes regímenes de poscarga, con el fin de estudiar los efectos de estos estímulos en el desarrollo de la fuerza tisular, la remodelación y la maduración. Nuestra técnica permite sujetar con precisión los tejidos batidos a una amplia gama de rutinas de carga posterior personalizables durante períodos prolongados de cultivo sin necesidad de abrir la placa de cultivo celular. Nuestro método podría ser modificado para controlar la carga posterior en otro sistema de cultivo de tejido muscular, como el músculo esquelético, el músculo liso o el músculo papilar extirpado.Dado que nuestro enfoque de sistemas es bastante único y cuenta con aspectos técnicos con los que muchos científicos no están familiarizados, la demostración visual puede ayudar a recrear nuestra configuración. Para fabricar los bastidores de silicona con capacidad magnética, adquiera los bastidores de 24 cajas de lata de pozo de los postes de silicona descritos en el protocolo de texto. Usando una polaridad fija, lubricar los imanes con agua e insertarlos uno a la vez en los postes más exteriores de los bastidores de silicona.Utilice una pieza mezclada de alambre dental de acero inoxidable para empujarlos cuidadosamente a la parte inferior de la cavidad del poste hueco. Se pueden apilar hasta cinco imanes en cada poste. Utilice alicates de punta redonda para doblar el alambre dental de acero inoxidable en aparatos de 11,25 milímetros de ancho y 15 milímetros de largo.Para asegurarse de que se alcanzan las dimensiones correctas, se puede utilizar una plantilla hecha a sí mismo para ayudar en la flexión del alambre, a continuación, utilizar cortadores de alambre para cortar las llaves y el archivo para suavizar la superficie de corte. Lubricar los frenos o postes con agua e insertarlos en el estante de silicona que fija el segundo y el tercero al poste más exterior del proceso. Comience a preparar la carga posterior del dispositivo de afinación como se describe en el protocolo de texto, se adhiere al soporte del imán a la etapa piezoeléctrica utilizando un material no magnético, esto se puede lograr utilizando una pieza en forma de L de aluminio.Para habilitar el análisis visual de los tejidos, instale una fuente de luz dentro del dispositivo de ajuste de carga posterior. Aquí se empleó una serie de LEDs para iluminar al ingeniero a los tejidos cardíacos desde abajo. Para calibrar el sistema de ajuste de carga posterior, monte uno de los bastidores de silicona y verticalmente utilizando materiales no magnéticos, de modo que los postes de silicona con capacidad magnética estén orientados horizontalmente.Ahora monte uno de los imanes de la placa en una etapa lineal que viaja horizontalmente de tal manera que esté alineado axialmente con el poste sensible magnéticamente. Coloque el imán de calibración a una distancia definida desde el poste de silicona con capacidad magnética utilizando la etapa horizontal. Coloque una cámara a un lado de esta configuración para poder grabar ópticamente los postes de desviación bajo la influencia de las cargas de prueba.Asegúrese de que hay suficiente espacio debajo del poste para que las cargas conectadas cuelguen libremente. Tome una foto del poste en ausencia de cualquier peso para utilizar como referencia para la posición neutral de los postes. Sin cambiar la perspectiva de la cámara, conecte una de las cargas al final del poste de silicona y, a continuación, tome una foto del poste doblando bajo la influencia del peso.Ahora graficar la desviación del poste de silicona en el eje X contra la fuerza gravitacional de cada peso de prueba en el eje Y. Esto debería producir una relación lineal entre la fuerza y la desviación. Trazar una función de regresión lineal que pasa a través de 00 y los datos de adquisición.La pendiente de esta función es la rigidez, k del poste de silicona con capacidad magnética en el espaciado del imán probado. Repita estos pasos en varios espaciados entre dmax y un dmin. Aquí se analizaron deflexiones en ocho posiciones de imán diferentes, que van desde unos 31 milímetros hasta unos cinco milímetros.Una gran cantidad de función de regresión a través de estos valores. Por ejemplo, utilice el ajuste no lineal, una función de decaimiento de fase en el software de análisis. Esta función de regresión describe la relación entre el espaciado del imán y la carga posterior.Para preparar el dispositivo de afinación de carga posterior para experimentos, conecte el motor de etapa piezoeléctrica al controlador de movimiento y conecte el controlador de movimiento al ordenador. Asegúrese de que el controlador de movimiento también esté conectado a una fuente de alimentación. A continuación, inicie el software de la plataforma del controlador de movimiento, conecte el software al motor piezo stage seleccionando el puerto designado como la placa de escenario durante la instalación del software de control de movimiento y, a continuación, haga clic en el botón de puerto abierto.Vaya al panel del sistema, seleccione el bucle abierto, en el menú desplegable del bucle. Mueva manualmente la placa del imán a su posición más alta, el dmin de espaciado de imán más cercano posible. La placa de imán debe hacer contacto con el soporte de la placa de cultivo.Ahora ve al Panel de Movimiento, como el botón cero para restablecer la posición actual de la etapa piezoeléctrica a cero milímetros. Mueva manualmente la hoja del imán a su posición más baja posible, anote la posición del codificador para determinar el rango de movimiento para el motor de etapa piezoeléctrico. Establezca los límites de viaje en el panel del sistema en valores dentro del rango de movimiento determinado en el paso anterior.Esto evita que la hoja del imán se tope con la hoja de cultivo o en la parte inferior del dispositivo de afinación de la carga posterior. Una vez más, mueva la hoja del imán a su posición más alta y haga clic en el botón cero. Vaya al panel del sistema y cambie el modo de bucle de retroalimentación a bucle cerrado, lo que garantiza que la etapa corregirá cualquier error en su posicionamiento.Haga clic en el botón Guardar en el cuadro De parámetros de tienda para almacenar estos ajustes en el sistema. Ahora coloque la placa de cultivo de 24 pozos que contiene tejidos cardíacos de ingeniería en bastidores de silicona con respuesta magnética en el soporte de la placa de cultivo. Para calcular el espaciado del imán necesario para lograr una carga posterior deseada, resuelva la función de regresión no lineal determinada anteriormente para d.Restar dmin del espaciado del imán calculado, d. El resultado es la distancia que la placa de imán tiene que viajar desde su posición cero para lograr la carga posterior deseada. Escriba este valor en el campo de entrada Posición de destino y una entrada en el panel Movimiento y haga clic en Ir para ajustar la carga posterior del tejido cardíaco de ingeniería al valor calculado.El control de los MREHT producidos a partir de corazones de ratas se cultivaba en ausencia de carga magnética hasta que se alcanzó una meseta en fuerza contráctil. En este día, los MREHT y los EHT controlados tenían fuerzas medias similares. Durante la semana siguiente, la carga posterior ejercida sobre los MREHT se incrementó progresivamente del punto nueve al seis punto ocho cinco mililitros por milímetro, mientras que la carga posterior para controlar los EHT se mantuvo constante.La fuerza contráctil media aumentó con el aumento de la carga posterior hasta el punto nueve cinco mililitros, lo que marca más de un aumento de tres veces en vigor en comparación con el valor medio medido para los EHT controlados. La desviación posterior, por otro lado, disminuyó en comparación con los tejidos de control. En el último día de cultivo, la desviación principal medida para los MREHTs era sólo el punto uno milímetros, en comparación con el punto cuatro ocho milímetros para el control de EHT.Los EHT rad en postes de silicona con respuesta magnética se cultivaron a un volumen mínimo de punto nueve un milinewton por milímetro hasta que se alcanzó una meseta y una fuerza contráctil. A partir de este día, los MREHTs se sometieron a un régimen de siete días después de la carga que expone a los EHT a ciclos de carga posterior alternando entre el punto nueve uno y seis puntos ocho cinco mililitros por milímetro. La carga posterior de EHT de control se mantuvo constante en el punto seis milinewton cero por milímetro durante toda la duración del cultivo.Las diferencias observadas no fueron estadísticamente significativas. Combinado con el análisis de contractilidad óptica, este método permite la medición en tiempo real de la respuesta contráctil a corto plazo a magnitudes fluctuantes de la carga posterior, que podrían ser útiles para investigar las propiedades fisiológicas musculares. Los imanes fuertes pueden aferrarse repentinamente entre sí, potencialmente causando lesiones al usuario y dañando los propios imanes, para evitar esto, mantener el imán separado a una distancia segura.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se describe los procedimientos para la implantación de un nuevo hidrogel en su defecto corazones y cuantificar su efecto en la tensión de la pared ventricular izquierda y función. Estos procedimientos se han aplicado con éxito en perros y seres humanos.

Reducción del estrés de la pared del ventrículo izquierdo y la mejoría de la función en su defecto corazones con Algisyl LVR-

La insuficiencia cardíaca es la principal causa de hospitalización y una de las principales causas de mortalidad. Se aplica un modelo de ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda en ratones para investigar el remodelado ventricular y la disfunción cardíaca después del infarto de miocardio. Se presenta la técnica de mediciones hemodinámicas invasivas en ratones.

La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior en ratones: un modelo de remodelación post infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca

Este artículo describe la medición de la función ventricular izquierda murina mediante el análisis de presión/volumen a diferentes frecuencias cardíacas.

Cateterismo cardíaco en ratones para medir la relación de volumen Presión: Investigar el efecto Bowditch

Aquí, se muestra la generación de tejido del corazón ingeniería humana a partir de células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) derivada de los cardiomiocitos. Se presenta un método para analizar la fuerza de contracción y la alteración ejemplar de patrón de contracción por el hERG inhibidor del canal E-4031. Este método muestra alto nivel de robustez y la idoneidad para la detección de drogas cardíaco.

Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

Aquí se describe un protocolo paso a paso de la desbanding aorta quirúrgica en el modelo bien establecido de ratones de constricción aórtica. Este procedimiento no sólo permite estudiar los mecanismos que son la base del remodelado inverso del ventrículo izquierdo y la regresión de la hipertrofia, sino también probar nuevas opciones terapéuticas que podrían acelerar la recuperación miocárdica.

Estudio de la remodelación inversa del ventrículo izquierdo por desbanding aórtico en roedores

Aquí describimos un análisis de asa presión-volumen cardíaco bajo dosis crecientes de isoproterenol infundido por vía intravenosa para determinar la función cardíaca intrínseca y la reserva β-adrenérgica en ratones. Utilizamos un enfoque de pecho abierto modificado para las mediciones de bucle presión-volumen, en el que incluimos ventilación con presión positiva al final de la espiración.

Respuesta cardíaca a la estimulación β-adrenérgica determinada por análisis de asa presión-volumen

Los tejidos cardíacos tridimensionales biodiseñados con cardiomiocitos derivados de células madre han surgido como modelos prometedores para estudiar el miocardio humano sano y enfermo in vitro , al tiempo que recapitulan aspectos clave del nicho cardíaco nativo. Este manuscrito describe un protocolo para la fabricación y el análisis de tejidos cardíacos de ingeniería de alto contenido generados a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.

Diseño de un biorreactor para mejorar la adquisición de datos y el rendimiento del modelo de tejidos cardíacos diseñados

El protocolo describe un sistema de perfusión cardíaca ex vivo porcino en el que la carga directa del ventrículo izquierdo puede servir como técnica de evaluación de la salud del injerto y, al mismo tiempo, proporcionar una evaluación holística de la función del injerto. También se proporciona una discusión sobre el diseño del sistema y las posibles métricas de evaluación.

Carga cardíaca mediante presurización pasiva de la aurícula izquierda y poscarga pasiva para la evaluación del injerto

Este protocolo describe un método para injertar una perla magnética en el corazón del pez cebra en desarrollo a través de la microcirugía, lo que permite la manipulación de fuerzas mecánicas in vivo y desencadena la afluencia de calcio dependiente del estímulo mecánico en las células endocárdicas.

Manipulación de fuerzas mecánicas en el corazón de pez cebra en desarrollo utilizando perlas magnéticas

Presentamos una plataforma de ensayo de rigidez dinámica y reversible fabricada con un elastómero de silicona ultrasuave (polidimetilsiloxano, PDMS) con partículas de hierro incrustadas. Este nuevo ensayo es adecuado para estudiar los cambios físicos emergentes dependientes del tiempo en los fenotipos celulares, incluida la guía de contacto. Aquí, medimos la alineación de cardiomiocitos de ratas neonatales sobre el endurecimiento de la matriz utilizando magnetismo.

Elastómeros magnetorreológicos micromodelados para impulsar cambios en la alineación de los cardiomiocitos

Aprende a ajustar la carga posterior en tejidos cardíacos diseñados mediante una plataforma magnética no invasiva. Este método permite estudiar el desarrollo de fuerza tisular y la remodelación cardiaca en condiciones controladas durante períodos prolongados de cultivo.

Ajuste magnético de la carga posterior en los tejidos cardíacos diseñados

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