Name: Uso de un analizador de flujo extracelular para medir los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende a usar un analizador de flujo extracelular para medir cambios metabólicos en esperma de ratón durante la capacitación. Este método permite comparar glucólisis y fosforilación oxidativa en tiempo real.

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Los autores desean reconocer el apoyo del Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu en el Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.

Los espermatozoides se recogen de ratones machos CD-1 de 8-16 semanas de edad. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) de Weill Cornell Medicine.
1. Día antes del ensayo
<ol><li>
Preparación del cartucho del sensor y calibrador del analizador de flujo extracelular
	<ol>
<li>Para hidratar el cartucho del sensor, retire el cartucho del sensor del kit de ensayo de flujo extracelular XFe96 y coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicios públicos.</li>
		<li>Llene un depósito de solución con 25 ml de Doble Destilado H2O utilizando una pipeta multicanal, agregue 200 ml de H2O a cada pocal de la placa de servicio. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de servicios públicos e incubar durante la noche en una incubadora de 37 oC que no seaCO2. NOTA: El cartucho debe hidratarse durante al menos 4 horas.</li>
		<li>Aliquot 25 ml del calibrador de flujo extracelular en un tubo cónico de 50 ml e incubarlo durante la noche en una incubadora no CO2 de 37oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de microplacas recubiertas con ConA
	<ol>
<li>Disolver 2,5 mg de ConA en 5 ml de Doble destilado H2O para preparar un stock de 0,5 mg/ml (p/v).</li>
		<li>Con una pipeta multicanal, llene cada pocal de una placa de 96 polos de flujo extracelular con 50 ml de la solución de 0,5 mg/ml con A. Deje la tapa abierta y deje que la placa se seque durante la noche a temperatura ambiente. NOTA: Se pueden recubrir varias placas de inmediato y almacenarse a 4 oC durante un máximo de cuatro semanas hasta que estén listas para su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación del tampón de esperma
	<ol>
<li>Preparar 250 mL de analizador de flujo extracelular TYH tampón con HEPES bajos que contienen 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 5,6 mM de glucosa y 1 mM HEPES. Caliente el tampón a 37 oC y ajuste el pH a 7,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Día del ensayo
<ol><li>Preparación para la calibración del cartucho
	<ol>
<li>Sustituya el H2O en la placa de servicios públicos por 200 ml de calibrador XF por pozo e incubar durante al menos 1 h en una incubadora no CO2 37 oC. NOTA: En lugar de calibrador, PBS filtrado estérilmente, pH 7.4 se puede utilizar.</li>
		<li>Calentar 50 mL de tampón TYH a 37oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Generación de una plantilla de onda para el analizador de flujo extracelular
	<ol>
<li>Encienda el analizador de flujo extracelular y permita que la temperatura se estabilice a 37 oC.</li>
		<li>Abra el software de oleada y diseñe una nueva plantilla abriendo una plantilla en blanco (consulte Archivo suplementario 1, plantilla de oleada).</li>
		<li>Abra la pestaña Definiciones de grupo. Definir medios de ensayo como TYH; pH 7.4 y el tipo de célula como espermatozoides de ratón, deje las estrategias de inyección y los pretratamientos en blanco. Crear grupos diferentes para cada condición de ensayo; en este ejemplo, hay 6 grupos diferentes (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) y 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) para inducir la capacitación, 2-desoxiglucosa (2-DG) como inhibidor de la glucólisis, antimicina A (antA) y rotenona (rotena) como inhibidor del complejo III y complejo I de la cadena de transporte de electrones. NOTA: Para tener en cuenta la variabilidad entre los pozos, se deben medir paralelamente al menos 7-8 pozos por condición.</li>
		<li>Abra la pestaña Mapa de placas y defina el mapa de placas asignando grupos a pozos específicos. NOTA: Los cuatro pozos de esquina (A1, A12, H1, H12) se llenarán con tampón TYH (sin espermatozoides) y más tarde se utilizarán para la resta de fondo.</li>
		<li>Abra la pestaña Protocolo, agregue 4 ciclos de medición diferentes, seleccione el puerto respectivo y edite los detalles de medición(Figura 2, Tabla 1). Resalte la medida después de la inyección y no resalte el equilibrio.</li>
		<li>Guarde la plantilla de ensayo, rellene el resumen del proyecto y defina la ubicación de guardado para el archivo de resultados.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de compuestos para cargar en el cartucho del sensor
	<ol>
<li>Preparar 2 mL de 50 mM db-cAMP disolviendo 9,8 mg de compuesto en el búfer TYH y añadir IBMX a una concentración final de 5 mM. NOTA: IBMX tiene la tendencia a precipitarse después de ser diluido en el búfer TYH. Los precipitados se pueden disolver vórtice e incubando la solución TYH/db-cAMP/IBMX en un bloque de calor de 37 oC durante 5 min.</li>
		<li>Preparar 1 mL de 500 mM 2-DG disolviendo 82,1 mg de compuesto en tampón TYH.</li>
		<li>Preparar 1 mL de 5 m de AntA/Rot diluyendo ambos fármacos en el tampón TYH. NOTA: Los compuestos se diluyen 10 veces por inyección en el cartucho analizador de flujo extracelular; por lo tanto, asegúrese de que las soluciones de inyección están 10 veces más concentradas.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de espermatozoides de ratón
	<ol>
<li>Anestesiar 3 ratones machos entre 8 y 16 semanas por isoflurano y sacrificar a los ratones por luxación cervical después de que no se detectó respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo. Retire las epididimides cauda y la deferentia vasa.</li>
		<li>Coloque cada cauda en 500 l de tampón TYH precalentado en un pozo de placa de 24 pocillos, inmovilice el cauda en la parte inferior de la placa usando un par de fórceps y abra el tejido haciendo 5-7 pequeñas incisiones con tijeras de plumas.</li>
		<li>Transfiera la placa inmediatamente a una incubadora no CO2 37 oC y deje que los espermatozoides se dispersen durante 15 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Carga del cartucho del sensor
	<ol>
<li>El kit Extracellular Flux proporciona dos guías de carga de puertos para los puertos A y D y los puertos B y C. Para cargar un puerto específico, retire la tapa del cartucho del sensor y alinee la letra de la guía de carga del puerto correspondiente con la esquina superior izquierda del cartucho. Durante la inyección, utilice las yemas de los dedos de la mano no inyectable para mantener la guía de carga del puerto en su lugar e inserte las puntas de la pipeta verticalmente en los orificios de la guía de carga del puerto.</li>
		<li>Puerto A: Con una pipeta multicanal, inyecte 20 l del búfer TYH en cada columna.</li>
		<li>Puerto B: Inyectar 22 sL de tampón TYH en la columna 1-4, inyectar 22 ml de 500 mM 2-DG en la columna 5-8, y 25 l de 5 m anta/Rot en la columna 9-12.</li>
		<li>Puerto C: Inyecte 25 sL de búfer TYH en cada columna con números impares, inyecte 25 sL de 10 mM db-cAMP/ 500 m IBMX en cada columna con números pares.</li>
		<li>Coloque el cartucho del sensor con la placa de calibración en el analizador de flujo extracelular e inicie el ensayo. La calibración tarda de 10 a 15 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de placas de esperma
	<ol>
<li>Disolver 45 mg de BSA en 15 ml de tampón TYH (3 mg/ml p/v) y preparar tres alícuotas de 3 ml de solución BSA/TYH cada una en tubos de centrífuga de 5 ml.</li>
		<li>Combine dos pozos de esperma cada uno en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, cuente los espermatozoides usando un hematitómetro y diluya el esperma a una concentración de 2 x 107 espermatozoides/ml. NOTA: Utilice puntas de pipeta cortadas para pipetear espermatozoides para evitar dañar las células.</li>
		<li>Centrifugar el esperma durante 3 min a 700 x g,eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de tampón TYH. Repita el paso de centrifugación, retire el sobrenadante y transfiera cada alícuota de suspensión de espermatozoides a un tubo centrífugo de 5 ml con 3 ml de BSA/TYH.</li>
		<li>Coloque 180 l de tampón TYH en cada pozo de esquina (A1, A12, H1, H12) de una placa recubierta de ConA. Coloque 180 l de suspensión de espermatozoides en cada pozo vacío de la placa recubierta con consa (1,2 x 106 espermatozoides/pozo).</li>
		<li>Centrifugar la placa de esperma a 250 x g durante 1 min, girar la placa 180o y volver a centrifugar a 250 x g durante 1 min (velocidad de frenado más baja 1).</li>
		<li>Retire la placa de calibración del analizador de flujo extracelular y agregue la placa de esperma. Continúe el ensayo.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción y análisis de datos
	<ol>
<li>Después de finalizar el ensayo, retire el cartucho, abra el archivo de resultados, haga clic en la pestaña Exportar y exporte la ejecución completada como un archivo GraphPad Prism (Archivo suplementario 2:Datos de ejemplo primarios utilizados para la Figura 3).</li>
		<li>Duplica el archivo ECAR y OCR haciendo clic en la pestaña Nuevo y luego en la pestaña Duplicar familia... (Figura 3A).</li>
		<li>Elimine las primeras 7 filas de datos(Figura 3B).</li>
		<li>Normalice el punto de datos antes de la inyección de cAMP/IBMX por línea base restando la fila 1. Haga clic en la pestaña Analizar y, a continuación, en la ficha Eliminar línea base y columna matemáticas. Haga Click en Ok (Figura 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li>
<li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li>
<li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12%2FE1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54(2009).</li>
<li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li>
<li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li>
<li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li>
<li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li>
<li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hyperactivation+in+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li>
<li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75(2012).</li>
<li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li>
<li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse%3A+the+influence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li>
<li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoglycerate+kinase+2+%28PGK2%29+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li>
<li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S%2C+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme%2C+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li>
<li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+%28mHk1-s%29+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li>
<li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li>
<li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li>
<li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li>
<li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li>
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<li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li>
<li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li>
<li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li>
<li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li>
<li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La pérdida de capacitación espermática en ausencia de ciertos sustratos metabólicos o enzimas metabólicas críticas reveló el metabolismo energético como un factor clave que apoya la fertilización exitosa. Un cambio metabólico durante la activación celular es un concepto bien establecido en otros tipos de células, sin embargo, estamos empezando a entender cómo los espermatozoides adaptan su metabolismo a la creciente demanda de energía durante la capacitación. Utilizando un analizador de flujo extracelular, desarrollamos ...

La aplicación de la espectrometría de masas ha revolucionado el estudio del metabolismo. El perfilado metabólico dirigido y el rastreo metabolómico permiten un seguimiento preciso de los cambios en el metabolismo energético. Sin embargo, realizar metabolómicas requiere con éxito una amplia formación, personal experimentado y espectrómetros de masas caros y altamente sensibles que no están fácilmente disponibles para todos los laboratorios. En los últimos años, el uso de un analizador de flujo extracelular, como el Seahorse XFe96 se ha popularizando como método sustituto para medir los cambios en el metabolismo energético en varios tipos de células1,2,3,4,5.
Los espermatozoides son células móviles altamente especializadas; cuya tarea es entregar el genoma paterno al ovocitos. Los espermatozoides que salen del tracto reproductivo masculino después de la eyaculación siguen siendo funcionalmente inmaduros y no pueden fertilizar el ovocitos porque son incapaces de penetrar las vestiduras de los ovocitos. Los espermatozoides adquieren competencia de fertilización a medida que transitan por el tracto reproductivo femenino en un proceso de maduración conocido como capacitación6,7. Los espermatozoides o espermatozoides recién eyaculados diseccionados del epidídimo cauda pueden ser capacitados in vitro por incubación en medios de capacitación definidos que contengan Ca2+,bicarbonato (HCO3-) o un análogo de campo permeable a las células (por ejemplo, dibutiryl-cAMP), un aceptador de colesterol (por ejemplo, albúmina de suero de la bolina bovina, BSA) y una fuente de energía (por ejemplo, glucosa). Durante la capacitación, los espermatozoides modifican su patrón de motilidad en un latido flagelante asimétrico, representando un modo de natación llamado hiperactivación8,9, y se vuelven competentes para someterse a la reacción acrosomesa7, donde se liberan enzimas proteolíticas que digieren las vestiduras de los ovocitos. Estos procesos requieren energía, y similar a las células somáticas, espermatozoides generan ATP y otros compuestos de alta energía a través de la glucólisis, así como ciclo de TCA mitocondrial y fosforilación oxidativa (oxfos)10. Mientras que múltiples estudios demuestran que la glucólisis es necesaria y suficiente para apoyar la capacitación de espermatozoides11,12,13,14, la contribución de la oxfos es menos clara. A diferencia de otros tipos de células donde la glucólisis está físicamente acoplada al ciclo TCA, los espermatozoides están altamente compartimentados y se cree que mantienen estos procesos en compartimentos flagelantes separados: la pieza media concentra la maquinaria mitocondrial, mientras que las enzimas clave de la glucólisis parecen limitarse a la pieza principal15,16. Esta compartimentación da lugar a un debate en curso sobre si el piruvato producido en la pieza principal por glicólisis puede soportar oxfos mitocondriales en la pieza media, y si la ATP producida por los buperos en la pieza media sería capaz de difundirse lo suficientemente rápidamente a lo largo de la longitud del flagelo para apoyar los requisitos energéticos en partes distales de la pieza principal17,18,19. También hay apoyo de un papel para el oxfos en la capacitación de espermatozoides. El oxfos no sólo es más favorable energéticamente que la glucólisis, generando 16 veces más ATP que la glucólisis, sino que el volumen de la pieza media y el contenido mitocondrial están directamente relacionados con la aptitud reproductiva en las especies de mamíferos que presentan mayores grados de competencia entre los machos por las parejas20. Abordar estas preguntas requiere métodos para examinar las contribuciones relativas de la glucólisis y el oxfos durante la capacitación de los espermatozoides.
Tourmente et al. aplicaron un analizador de flujo extracelular de 24 polos para comparar el metabolismo energético de especies de ratones estrechamente relacionadas con parámetros de rendimiento de espermatozoides significativamente diferentes21. En lugar de reportar los valores basales de ECAR y OCR de espermatozoides no capacitados, aquí, adaptamos su método usando un analizador de flujo extracelular de 96 polos para monitorear los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación de espermatozoides de ratón en tiempo real. Desarrollamos un método que permite monitorear simultáneamente la glucólisis y el oxfos en tiempo real en esperma con la batida flagelos en hasta doce condiciones experimentales diferentes midiendo el flujo de oxígeno (O2)y protones (H+) (Figura 1A). Debido a la descomposición del piruvato para lactato durante la glucólisis y la producción de CO2 a través del ciclo TCA, los espermatozoides no capacitados y capacitados extruyen H+ en los medios de ensayo que son detectados por el analizador de flujo extracelular a través de fluoróforos sensibles A+-inmovilizados a la punta de la sonda de un cartucho de sensor. Paralelamente, el consumo de O2 por fosforilación oxidativa se detecta a través de fluoróforos sensibles a O2inmovilizados a la misma punta de sonda(Figura 1B). La detección efectiva del H+ liberado y o2 consumido requiere un búfer de espermatozoides modificado con baja capacidad de amortiguación sin bicarbonato o fenol rojo. Por lo tanto, para inducir la capacitación en ausencia de bicarbonato, adoptamos el uso de un campo analógico permeable a la célula inyectado junto con el inhibidor de PDE de amplio rango IBMX22. Tres puertos de inyección independientes adicionales permiten la inyección de activadores farmacológicos y/o inhibidores, lo que facilita la detección en tiempo real de los cambios en la respiración celular y la tasa de glucólisis debido a la manipulación experimental.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-desoxi-D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>2-DG</td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>IBMX; prepare una solución madre de 500 mM en DMSO (111,1 mg/ml) y almacene en pequeñas alícuotas</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Anta; preparar una solución madre de 5 mM en DMSO (2,7 mg/ml) y almacenar en pequeñas alícuotas</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1470</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Concanacalina A, lectina de Arachis hypogaea (cacahuete)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>ConA Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Salud Animal</td><td>1169567761</td><td>Isoflurano</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>N6,2'-O-Dibutiriladenosina 3',5'-sal sal sódica monofosfato cíclico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>db-cAMP</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13995</td><td>Rot; prepare una solución madre de 5 mM en DMSO (2 mg / ml) y almacene en alícuotas pequeñas</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3-Cloruro</td></tr> <tr><td>de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo y materiales</fuerte></td>pipeta de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 canales 10-100 &mu; L</td><td>eppendorf</td><td>ES-12-100</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 12 canales 50-300 &mu; L</td><td>vwr</td><td>613-5257</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C, no CO2 incubadora</td><td>VWR</td><td>1545</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cetrífugo de 5 mL Tubos de centrífuga</td> cónicos <td>Eppendorf</td><td>30119380</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>vwr</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga con adaptador de placa</td><td>Thermo Scientific</td><td>IEC FL40R</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disección</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase invertida con objetivo 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divididos</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X93</td><td></td></tr><tr><td>OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divididos</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X95</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analizador</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>También se vende como XFe96 FluxPak mini (102601-100) con 6 cartuchos en lugar de 18.</td></tr></tbody></table>

uso de un analizador de flujo extracelular para medir los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Los espermatozoides mamíferos adquieren capacidad de fertilización en el tracto reproductivo femenino en un proceso conocido como capacitación. Los procesos asociados a la capacitación requieren energía. Sigue habiendo un debate en curso sobre las fuentes que generan el ATP que alimenta la motilidad progresiva de los espermatozoides, la capacitación, la hiperactivación y la reacción acrosoma. Aquí, describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular como una herramienta para analizar los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación del esperma del ratón. Usando fluoróforos sensibles H+- y O2,este método permite monitorear la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real en espermatozoides no capacitados frente a capacitantes. El uso de este ensayo en presencia de diferentes sustratos energéticos y/o activadores farmacológicos y/o inhibidores puede proporcionar información importante sobre la contribución de diferentes vías metabólicas y la intersección entre las cascadas de señalización y el metabolismo durante la capacitación de espermatozoides.

Este método utiliza un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la tasa de glucólisis y oxfos durante la capacitación del esperma del ratón. La Figura 4 muestra un experimento ejemplar donde los espermatozoides fueron capacitados en presencia de glucosa como el único sustrato de energía y 2-DG y antimicina y rotenona como moduladores farmacológicos. El sustrato de energía en el tampón de flujo extracelular TYH y los modul...

Describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón.

Uso de un analizador de flujo extracelular para medir los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Este protocolo se puede utilizar para aplicar un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación de espermatozoides. Desarrollamos este protocolo para comparar los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real entre espermatozoides de ratón no capacitados y capacitados. El día antes del ensayo, retire el cartucho del sensor de un kit de ensayo de flujo extracelular y coloque el cartucho boca abajo junto a la placa de utilidad.Llene un depósito de solución con 25 mililitros de agua destilada doble y agregue 200 microlitros de agua a cada pozo de la placa de servicio, luego coloque el cartucho del sensor de nuevo en la placa de servicio. Coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius. A continuación, aliquot 25 mililitros de calibrador de flujo extracelular en un tubo cónico de 50 mililitros y coloque el tubo en la incubadora de dióxido de carbono no carbono de 37 grados Celsius.Para preparar microplacas recubiertas con ConA, disolver 2,5 miligramos de ConA en cinco mililitros de agua doble destilada y utilizar una pipeta multicanal para llenar cada pozo de un analizador de flujo extracelular de placa de 96 pozos con 50 microlitros de la solución ConA, luego dejar la tapa abierta para dejar la placa seca durante la noche. Para preparar el tampón de espermatozoides, calienta 250 mililitros del analizador de flujo extracelular TYH buffer a 37 grados Celsius y ajusta el pH a 7.4. El día del ensayo, sustituya el agua de cada pozo de la placa de servicios públicos por 200 microlitros de calibrador XF por pozo y vuelva a colocar la placa en la incubadora de dióxido de carbono no carbono durante al menos una hora.Para generar una plantilla de onda, active el analizador de flujo extracelular. Mientras la temperatura se está estabilizando a 37 grados Celsius, abra el software de onda y abra una plantilla en blanco. En la pestaña de definiciones de grupo, defina el medio de ensayo como TYH y el tipo de celda como esperma de ratón, dejando las estrategias de inyección y los pretratamientos en blanco.Cree diferentes grupos para cada condición de ensayo y abra el mapa de placas para asignar cada grupo a pozos específicos. En la pestaña protocolo, unhighlight equilibrate, agregue cada uno de los cuatro ciclos de medición diferentes, seleccione el puerto respectivo y edite los detalles de medición para que se resalte la medida después de la inyección, luego guarde la plantilla de ensayo, rellene el resumen del proyecto y guarde los resultados. Antes de cosechar el esperma, precalienta 50 mililitros de tampón TYH a 37 grados Celsius.Después de cosechar caudas de ratones machos adultos, coloque cada cauda en 500 microlitros del tampón TYH precalentó en pozos individuales de un plato de 24 pozos. Utilice fórceps para inmovilizar cada cauda individualmente en la parte inferior de cada pozo y rápidamente haga de cinco a siete pequeñas incisiones en cada tejido usando tijeras de plumas. Cuando todas las caudas hayan sido incedidas, coloque inmediatamente la placa en la incubadora de dióxido de carbono no carbono para permitir que los espermatozoides se dispersen durante 15 minutos.Para cargar el cartucho del sensor, retire la tapa del cartucho del sensor y alinee la letra de la guía de carga del puerto correspondiente con la esquina superior izquierda del cartucho. Manteniendo la guía de carga del puerto en su lugar, inserte las puntas de la pipeta verticalmente en los orificios de la guía de carga del puerto A e inyecte 20 microlitros de búfer TYH en cada columna. Para el puerto B, inyecte 22 microlitros de tyH buffer en las columnas uno a cuatro, 22 microlitros de 500 mililitros de 2-desoxiglucosa en columnas de cinco a ocho, y 25 microlitros de cinco antimicina micromolar A rotenona en columnas nueve a 12.Para el puerto C, inyecte 25 microlitros de tyH buffer en cada columna con números impares y 25 microlitros de 10 mililitros de DIbutyryl-cyclic AMP 500 micromolar IBMX en cada columna con números pares, luego coloque el cartucho del sensor con una placa de calibración en el analizador de flujo extracelular e inicie el ensayo. La calibración tardará de 10 a 15 minutos. Para preparar las placas de esperma, agregue tres mililitros de tres miligramos por mililitro de albúmina sérica bovina en tampón TYH a cada uno de los tres tubos centrífugos de cinco mililitros.A continuación, a la continuación, la piscina de dos pozos de espermatozoides en cada uno de los tres tubos de centrífuga de 1,5 mililitros. Después de contar, diluir el esperma a un dos veces 10 a la concentración de siete espermatozoides por mililitro por muestra en TYH fresco complementado con albúmina sérica bovina. Sedimentar el esperma por centrifugación y resuspender los gránulos de espermatozoides en un mililitro de tampón TYH.Centrifugar el esperma de nuevo y eliminar los sobrenadantes teniendo cuidado de no molestar los gránulos. Transfiera cada suspensión de espermatozoides a uno de los tubos de centrífuga de cinco mililitros preparados y agregue 180 microlitros de tampón TYH en cada pozo de esquina de una placa recubierta con ConA. Añadir 180 microlitros de esperma en cada pozo vacío de la placa recubierta de ConA y centrifugar la placa dos veces girando la placa 180 grados entre centrifugaciones, luego coloque la placa de calibración con la placa de esperma y continúe el ensayo.En este experimento representativo, los espermatozoides se capacitaron en presencia de glucosa como el único sustrato de energía y 2-desoxiglucosa y antimicina y rotenona como moduladores farmacológicos. La flecha indica la inducción de la capacitación. En presencia de glucosa, la capacitación fue acompañada por un aumento de siete veces en la tasa de acidificación extracelular que se inhibe por el bloqueo de la glucólisis con 2-desoxiglucosa.Los espermatozoides capacitados demostraron un aumento de 20 veces en la tasa de consumo de oxígeno en comparación con los espermatozoides no capacitados que demuestran que los espermatozoides del ratón mejoran tanto la glucólisis como la fosforilación oxidativa para apoyar la creciente demanda de energía durante la capacitación. El aumento de la tasa de acidificación extracelular durante la capacitación de espermatozoides no se ve afectado por los inhibidores de la fosforilación oxidativa antimicina A y la rotenona, lo que indica que el cambio en esta tasa es impulsado principalmente por la liberación de hidrógeno de la glucólisis. El aumento en la tasa de consumo de oxígeno, sin embargo, está bloqueado por la antimicina A y la rotenona, así como por la 2-desoxiglucosa revelando que el aumento de OXPHOS durante la capacitación de espermatozoides depende de la actividad glucolítica.La fuente de energía y los activadores e inhibidores farmacológicos pueden variar dependiendo del objetivo del experimento y hasta 12 condiciones diferentes se pueden medir en paralelo. El protocolo se puede adaptar fácilmente a otras especies como la humana o la bovina donde los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación son igualmente enigmáticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Ensayo de flujo extracelular: un método para medir el perfil metabólico de las células

Medición de Ca intracelular<sup&gt; 2 +</sup&gt; Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

El análisis proteómico de cualquier tipo de célula depende en gran medida tanto de la pureza como del prefraccionamiento del material de partida para descomplejizar la muestra antes de la cromatografía líquida, espectrometría de masas (MS). Mediante el uso de técnicas de retrolavado, se pueden obtener espermatozoides puros de roedores. Después de la digestión, los fosfopéptidos se pueden enriquecer con TiO2.

Análisis Phosphopeptide de roedores epidídimo Espermatozoides

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El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

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Uso de un analizador de flujo extracelular para medir los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón

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