Aislamiento y expansión de las neuroesferas de los nichos neurogénicos de ratón (P1-3)

El ensayo de neuroesfera es una técnica in vitro útil para estudiar las propiedades inherentes de las células madre/progenitoras neuronales, incluida la proliferación, la auto-renovación y la multipotencia en el contexto fisiológico y patológico. Debido a su estructura tridimensional, esta técnica es una poderosa herramienta para estudiar la neurogénesis adulta. También es útil para el cultivo y la obtención de mayores rendimientos de células madre/progenitoras neurales.

Este ensayo de neuroesfera se puede aplicar al estudio de trastornos cerebrales como enfermedades de Alzheimer y Parkinson o esclerosis múltiple. Las neuroesferas también se pueden obtener de otras regiones o sistemas cerebrales, como el tejido adiposo o el intestino. Demostrando el procedimiento con Filipa Ribeiro estará Rita Soares, estudiante de doctorado en mi grupo.

Para cosechar el día posnatal uno a tres cerebros de ratón, sostenga la parte ventral del cuerpo en la base de la cabeza y use pequeñas tijeras puntiagudas para hacer una incisión de línea media en la piel sobre toda la longitud de la cabeza para exponer el cráneo. Haga una incisión longitudinal en la base del cráneo y continúe cortando a lo largo de la sutura sagital en un ángulo superficial como sea posible para evitar dañar las estructuras cerebrales. Usa fórceps curvos para pelar el cráneo hacia los lados para exponer el cerebro y deslizar una pequeña espátula debajo del cerebro para cortar los nervios craneales y los vasos sanguíneos que están conectados a la base del cerebro.

Coloque el cerebro en un plato Petri de HBSS frío complementado con antibióticos y coloque el plato bajo un microscopio diseccionado con bajo aumento. Coloque el cerebro sobre su superficie dorsal. Mientras sostiene el cerebro por el cerebelo, utilice fórceps finos para eliminar las meninges del lado ventral del cerebro y los bulbos olfativos.

Gire el cerebro sobre el aspecto ventral y despegue el resto de las meninges. Luego usa los fórceps para quitar el cerebelo y usa fórceps puntiagudos curvados para transferir el cerebro a un pedazo de papel de filtro con un poro de 11 micrómetros encima de un helicóptero de tejido. Para la microdisección SVZ y DG, comience cortando el cerebro en secciones coronales de 450 micrómetros.

Utilice una lámina húmeda para recoger el cerebro seccionado en un nuevo plato de Petri lleno de antibióticos fríos suplementados HBSS bajo un microscopio diseccionado y use fórceps para separar las rodajas coronales de una manera anterior a posterior hasta que se alcancen rodajas con los ventrículos laterales. Utilice fórceps finos para cortar la capa delgada de los tejidos que rodean la pared lateral de los ventrículos, excluyendo el parénquima estriado y el cuerpo calloso y coloque una punta de los fórceps inmediatamente debajo del cuerpo calloso y la otra en el tejido inmediatamente adyacente al área ventral del ventrículo lateral para aislar el SVZ. Cortar una pequeña línea de tejidos que rodean el ventrículo lateral y recoger el tejido diseccionado en un tubo de muestra que contiene solución hbSS suplementada.

Cuando todas las rebanadas hayan sido microdiseccionadas con fórceps y se haya alcanzado la formación del hipocampo, deseche la primera rebanada con hipocampo en la que la DG todavía es irreconocible. Para eliminar la DG, primero aísle el hipocampo de las rodajas y vuelva a enfocar el microscopio para visualizar los bordes alrededor de la DG. Para cosechar la DG, utilice fórceps para realizar un corte entre la DG y la región CA1 seguido de un corte vertical entre la DG y la región CA3. A continuación, retire la fimbria y cualquier tejido adyacente y coloque el tejido cosechado en un tubo separado de solución HBSS suplementada con antibióticos.

Para disociar las muestras SVZ y DG, añada Trypsin-EDTA 0,05% a una concentración final de 5-10% de Trypsin-EDTA 0,05% en HBSS a cada tubo para una incubación de aproximadamente 50 minutos a 37 grados centígrados. Todo el uso de trippsina o tiempo de incubación demasiado largo puede conducir a un aumento de la muerte celular, afectando negativamente el crecimiento celular. Cuando el tejido se haya agrupado, reemplace la solución enzimática durante cuatro lavados consecutivos con un mililitro de HBSS fresco suplementado por lavado.

Después del último lavado, resuspender los tejidos digeridos en un mililitro de medio libre de suero complementado con 10 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento epidérmico y cinco nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básico por tubo. A continuación, disocia mecánicamente los tejidos con pipeteo suave de siete a 10 veces con una pipeta P1000 hasta que se haya obtenido una solución celular homogénea. Para determinar la densidad de la célula DG o SVG disociada, cuente las células de cada suspensión en un hematocitociómetro.

Para expandir las células en neuroesferas, diluya las poblaciones celulares individuales a dos veces diez a las cuartas células por mililitro de densidad en medio libre de suero complementado con factores de crecimiento y semilla cinco mililitros de la suspensión celular en platos Petri de 60 milímetros de diámetro sin recubrimiento. Luego incubar las células SVZ durante seis a ocho días y las células DG durante 10 a 12 días a 37 grados Celsius para la formación de neuroesfera primaria. Cuando la mayoría de las neuroesferas tienen 150 a 200 micrómetros de diámetro, cosechar la suspensión celular de los cultivos y recoger las neuroesferas por centrifugación.

Resuspender el palet neuroesfera con un kit de disociación química del ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de recoger las células con otra centrifugación. Sustituya el sobrenadante por un mililitro de medio libre de suero complementado con factores de crecimiento y trate suavemente de calificar el pellet unas 10 veces. Contar las células neurociémicas disociadas como se ha demostrado y resembrar las células en un dos veces 10 a la cuarta densidad de células por mililitro en medio libre de suero complementado con factores de crecimiento en nuevos platos petri de 60 mililitros.

Luego devuelva la célula a la incubadora de cultivo celular durante seis a ocho o 10 a 12 días adicionales según corresponda para obtener neuroesferas secundarias. Las neuroesferas SVG y DG obtenidas mediante el uso del ensayo de neuroesfera se componen de células positivas de Sox2 indiferenciadas, nestin positivas. En particular, las neuroesferas derivadas de SVG tienen dimensiones más grandes que sus contrapartes DG.

Es importante destacar que, en condiciones de diferenciación, las células madre/progenitoras neurales derivadas de SVG y DG migran fuera de las neuroesferas, formando una pseudomonocapa de células. En ambas regiones neurogénicas, es posible observar la presencia de Sox2 doble positivo, nestin doble positivo, doblecortina doble negativo pares de células correspondientes a divisiones simétricas indicativas de auto-renovación. Pares celulares en los que una célula de Sox2 positiva, nestin positiva y doublecortin negativa, y la otra célula Sox2 negativa, nestin negativa y doublecortin positiva demostrando divisiones asimétricas.

Y los pares de células doblemente negativas, dobles negativas y doble cortina de la Sox2 corresponden a divisiones simétricas indicativas de diferenciación. En general, la pasión cambia la tasa de mortalidad celular en el segundo día in vitro. La neuritogénesis se puede evaluar en las neuronas obtenidas a partir de la diferenciación de SVG y de las células madre/progenitoras neurales DE LA DG al comienzo de la diferenciación.

Como se observó, la longitud y la ramificación de las neuritas aumenta con la diferenciación. Se observa un alto porcentaje de células proliferativas en SVG en comparación con la DG. Aunque el porcentaje de progenitores proliferantes que se diferencian en neuronas maduras es similar en ambos nichos neurogénicos. Ambos tipos celulares también son capaces de diferenciarse en neuronas inmaduras, neutrones maduros, células precursoras de oligodendrocitos, oligodendrocitos maduros y astrocitos.

Después de obtener las neuroesferas, se pueden realizar varios métodos, incluyendo inmunocitoquímica, imágenes de calcio, manchas occidentales y RT-PCR para estudiar el tallo y la multipotencia del tallo neural/células progenitoras. El ensayo de neuroesfera se puede aplicar a modelos genéticos y de enfermedad para evaluar aún más los procesos moleculares y celulares que implican tanto en la proliferación como en la diferenciación de las células madre/progenitoras neuronales.