Interrogatorio paralelo del reclutamiento de la serie 2 para la detección de ligandos a escala de GPCR a escala mediante el ensayo PRESTO-Tango

La plataforma Presto-Tango fue ideada para ejecutar el interrogatorio paralelo y simultáneo de todos los GPCR no olfativos en el genoma humano, incluyendo a los objetivos huérfanos para perfilar la beta-arresto inducida por ligandos en el reclutamiento 2. La plataforma Presto-Tango es el único recurso de código abierto para perfilar todo el genoma GPCR en un enfoque paralelo, utilizando un ensayo de reclutamiento de beta-arresto independiente de proteína G. Demostrando el procesador sería Genevieve Laroche un investigador asociado en mi laboratorio, y Manel Zighal, un candidato de doctorado en mi laboratorio.

Antes de comenzar el procedimiento añadir 20 microlitros de una solución de poli-L-lisina de 25 microgramos por mililitro a cada pocillo del número experimental adecuado de 384 placas inferiores ópticas e incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos a dos horas. Al final de la incubación, mover las placas sobre el fregadero para eliminar el exceso de poli-L-lisina y añadir 40 microlitros de solución antimicótica antibiótico a cada pocillo. Luego incubar las placas necesarias para la siembra celular a 37 grados Celsius y colocar el resto de las placas a cuatro grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo.

Para sembrar células HTLA para el cribado primario, enjuague suavemente cultivos celulares confluentes de 150 milímetros con 10 mililitros de PBS antes de tratar los cultivos con seis mililitros de 0.05%trypsin EDTA por plato. Cuando las células se han separado agrupan las suspensiones celulares en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene un volumen igual de DMEM. Y recoger las células por centrifugación.

Vuelva a suspender el pellet a una 2,2 veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración de DMEM y deslice las placas sobre el fregadero para eliminar la solución antimicótica antibiótica. Toque las placas para secar y sembrar 45 microlitros de células en cada pozo. A continuación, coloque las placas a 37 grados centígrados y un 45% de dióxido de carbono durante la noche.

Para preparar la placa de origen de ADN de 384 pozos para la transfección, distribuya 50 nanogramos por mililitro de cada plasmami adn complementario que codifica la construcción GPRC Tango de interés en 0.1X Tris-EDTA por pozo en cada pocero de una placa de 96 pozos. Utilice una pipeta multicanal para transferir manualmente 10 microlitros de solución de ADN de cada pozo de la placa de 96 pozos a pozos individuales de una placa de fuente de ADN de 384 pozos en cuadrúplica para cada condición como se ilustra. A continuación, transfiera 40 microlitros de una solución de cloruro de calcio molar 0,313 a cada pozo de la placa de origen del ADN y mezcle suavemente el contenido de cada pozo.

Agregue 50 microlitros de 2x tampón HEPES a cada pozo de la placa de fuente de ADN de 384 pozos con una mezcla suave. Después de un minuto transferir 10 microlitros de la mezcla de transfección de ADN de la placa de fuente de ADN de 384 pozos a cada pozo de células HTLA sembradas e incubar las células en la incubadora de cultivo celular durante la noche. Al día siguiente decantar el medio celular trans infectado y añadir lentamente 40 microlitros de medio hambriento a cada pozo teniendo cuidado de no tocar las células directamente.

A continuación, añada 20 microlitros del tampón del vehículo para las filas alternas sin compuesto en 20 microlitros del compuesto de interés a tres veces la concentración en las filas alternas, antes de devolver la placa a la incubadora de cultivo celular. 16 a 24 horas después de la decantación de la estimulación del medio celular trans infectado y añadir 20 microlitros de reactivo de brillo recién preparado a cada pozo durante una incubación de cinco a 20 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. A continuación, lea las placas en un contador de luminiscencia de microplacas con un tiempo de integración de un segundo por pozo.

Para un cribado secundario, la subcultura de las células HTLA en platos de 100 milímetros a cinco veces 10 a las seis células de densidad celular total en 11 milímetros de medio completo por plato durante 24 horas a 37 grados centígrados. Al día siguiente, se mezclaron 10 microgramos de ADN complementario GPCR con 500 microlitros de solución de cloruro de calcio Tris-EDTA con vórtice seguido de la adición de 500 microlitros de tampón HEPES. Después de un agitado vigoroso, incubar la solución durante un minuto a temperatura ambiente e inmediatamente añadir un mililitro de la solución caer sabiamente sobre las células.

Mece suavemente para distribuir uniformemente el precipitado y coloque la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, compruebe la eficiencia de la transfección bajo un imager de celda fluorescente. Las transacciones superiores al 50% de cobertura son ideales.

Enjuague suavemente las células trans infectadas con solución de verso antes de separar las células con tres mililitros de 0,05%trypsin EDTA. Recoger las células disociadas por centrifugación y volver a suspender el pellet en un cuatro veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración media hambrienta. A continuación, sembrar 45 microlitros de células en cada pozo de una placa de poli-L-lisina codificada 384 pozo y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante al menos cuatro horas.

Para preparar una placa de respuesta de media bola de dosis-curva de registro añadir 270 microlitros de HBSS complementados con HEPES y antibiótico antimicótico a todos excepto la última fila de una placa de 96 pozos y añadir 30 microlitros de cada solución de fármaco alto y bajo a los pozos de la fila H.Transferir la solución de cada pozo de fila H en la correspondiente fila de pozo G con la mezcla y continuar diluyendo en serie los medicamentos compuestos hasta la última fila de la placa de la placa se alcanza. Usando el esquema como referencia, mezcle 20 microlitros de las diluciones de columna baja de las filas A a G de la placa de 96 pozos y 20 microlitros de las diluciones de columna alta a los pozos B a H de la placa de 96 pozos a la placa de 384 pozos previamente asentada. Luego incubar la placa a 37 grados centígrados durante un mínimo de 16 horas.

16 a 24 horas después de la decantación de la estimulación del medio celular trans infectado y añadir 20 microlitros de reactivo de resplandor a cada pocillo durante una incubación de cinco a 20 minutos antes de leer las placas en un contador de luminiscencia de microplaca con un tiempo de integración de un segundo por pozo. En este experimento representativo, de los 168 GPCR que fueron interrogados en el cribado primario, sólo el receptor de dopamina D3 y opsin 5 eran contendientes como objetivos activos potenciales. Receptor de dopamina D3 produjo un cambio significativo de 4.7 mientras que opsin 5 produjo una respuesta ligeramente menor de 2.39.

En comparación, receptor de dopamina D2, el control positivo para la pantalla primaria produjo un cambio de plegado log2 de 4.58. Esas curvas de respuesta del cribado secundario demostraron que el extracto de gránulo de cromatina produce ventanas de señal similares en valores de concentración efectivos medio máximos a quinpirole confirmando su validez como un golpe activo en el receptor de dopamina D3. Una curva de dosis plana similar al control negativo fue producida para opsin 5 sin embargo descartar este receptor como un posible objetivo para el extracto de gránulo de cromatina. Presto-Tango requiere un cuidado especial, ya que las variabilidades en la distribución celular, la eficiencia de la transfección y las diluciones de fármacos en serie pueden dar lugar a errores compuestos, lo que puede afectar la precisión de los datos.

Los métodos ortogonales, como los enfoques de unión a Radioligand, la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia y los ensayos funcionales de calcio y internalización de AMP cíclico, se pueden utilizar para confirmar y caracterizar aún más las interacciones del receptor de ligando.