Name: Inducción de la muerte cerebral en ratones que utilizan la monitorización y ventilación de la presión arterial intraarterial a través de la traqueotomía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprende a inducir muerte cerebral en ratones mediante cateterismo arterial y traqueostomía para estudiar respuesta inflamatoria sistémica. Este modelo permite analizar cambios fisiopatológicos y viabilidad de órganos para trasplante.

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Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con los Principios de Cuidado Animal de Laboratorio formulados por la Sociedad Nacional de Investigación Médica y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio preparada por la Academia Nacional de Ciencias y publicada por los Institutos Nacionales de Salud (Publicación No 86-23 de la NIH, revisada 1985). Todos los experimentos fueron aprobados por el Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura de Austria (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1. Cateterismo arterial
<ol><li>Anestetizar el ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina10 y un analgésico según la práctica local (por ejemplo, buprenorfina).  Pellizque las extremidades posteriores con fórceps para confirmar la profundidad correcta de la anestesia. NOTA: Para este estudio, se utilizaron ratones machoSC57BL/6N a la edad de 8 a 12 semanas (peso de 20 a 25 g). Los autores han probado balón macho/c de la misma edad sin éxito, pero no han probado otras cepas (ver discusión).</li>
	<li>Retire el pelo en las regiones de interés (cabeza, cuello) usando una maquinilla de afeitar eléctrica. Asegúrese de que no quede pelo suelto para evitar la contaminación de las heridas. Posteriormente desinfecte el campo quirúrgico con 70% de etanol/clorhexidina/betadina y coloque el ratón supino con la cabeza mirando hacia el cirujano.</li>
	<li>Haga una incisión de la línea media cervical con tijeras dissección.</li>
	<li>Diseccionar las glándulas submandibulares y el tejido muscular del cuello y separarlos para exponer la arteria carótida común. Utilice principalmente disección contundente a través de fórceps.</li>
	<li>Colocar tres 8-0 ligaduras de seda debajo de la arteria carótida común derecha.</li>
	<li>Coloque una abrazadera en la ligadura proximal y traiga tensión en la arteria para que el flujo se suspenda.</li>
	<li>Cierre la ligadura más distal.</li>
	<li>Inserte el catéter arterial a través de un pequeño orificio de piel preformado en el aspecto craneal de la incisión. Apriete y deforme el lumen del catéter si parece demasiado grande para reducir el retroceso de la sangre. Fijado con las tres ligaduras.</li>
	<li>Fije el catéter a la piel para evitar la luxación. Haga esto utilizando una sutura (por ejemplo, monofilamento 5-0, no absorbible) que conecta el catéter con la piel en el área del agujero de la piel preformado.</li>
</ol>2. Traqueotomía
<ol><li>Disecciona la musculatura pre-traqueal sin rodeos usando fórceps.</li>
	<li>Coloque dos 8-0 ligaduras de seda debajo de la tráquea.</li>
	<li>Traqueotomiz utilizando microtijeras lo más proximalmente posible para evitar la ventilación unilateral. Utilice una línea de corte horizontal entre dos cartílagos traqueales.</li>
	<li>Inserte el tubo de ventilación y fije con ambas ligaduras preparadas. NOTA: No es necesario ligar el extremo proximal de la tráquea.</li>
	<li>Cierre la piel con una sutura de carrera (por ejemplo, monofilamento 6-0, no absorbible).</li>
	<li>Ventile el ratón con una frecuencia de 150/min y un volumen de marea de 200 l.</li>
</ol>3. Inducción de la muerte cerebral
<ol><li>Organice el ratón en la posición propensa.</li>
	<li>Retire la piel del cráneo con tijeras quirúrgicas y fórceps para sujetar la piel.</li>
	<li>Taladre un agujero de calibre de 1 mm paramedially por encima de la corteza parietal izquierda. Deje de taladrar antes de romper el hueso compacto interno y la dura mater.</li>
	<li>Penetra el puente de tejido final del cráneo usando fórceps contundentes, eliminando bordes afilados.</li>
	<li>Inserte el catéter de globo, de modo que esté completamente dentro de la cavidad craneal. Asegúrese de que el globo esté precargado con salina y que todo el aire sea evacuado.</li>
	<li>Comience la inflación a 0,1 ml/min durante un período de 10 a 15 min (volumen total de 0,8 x 1,2 ml) con la ayuda de una bomba de jeringa. NOTA: El ratón exhibirá mioclono, midriasis, más actividad convulsiva y jadeos agonales.</li>
	<li>Pronunciar el cerebro del ratón muerto una vez que la cola del ratón se ha vuelto rígida y erigida. NOTA: La BD se confirma mediante un pico de presión arterial inicial característico (reflejo de la hora), la ausencia de reflejos del tallo cerebral y la respiración espontánea. Se deben evitar las pruebas regulares de apnea durante los experimentos, ya que los ratones pueden volverse inestables circulatorios debido a la falta de oxígeno.</li>
	<li>Detenga la inflación del catéter de globo.</li>
	<li>Coloque una manta calefactora sobre el ratón para evitar la hipotermia.</li>
</ol>4. Durante el período BD
<ol><li>Supervise y documente la presión arterial regularmente. Excluya a los ratones con una fase hipotensora prolongada (presión arterial media [MAP] < 50 mmHg durante >30 min).</li>
	<li>Infundir 0,1 ml de salina cada 30 minutos para estabilizar la presión arterial del ratón. NOTA: En total se administraron 0,8 ml de salina a cada ratón en este estudio.</li>
	<li>Después de 4 h de duración BD, cosechar órganos/tejidos del ratón. Excluya el ratón del experimento si el corazón del ratón no late al final del experimento.</li>
</ol>5. Procedimiento Sham
<ol><li>Realice los pasos 1.1 a 3.3. NOTA: No abra el hueso compacto interno. No inserte ni infle un catéter de globo.</li>
	<li>Manténgase cerca del ratón y observe continuamente al animal. Pellizca repetidamente las extremidades traseras con fórceps para confirmar la profundidad correcta de la anestesia. Aplicar anestesia adicional por vía subcutánea (aproximadamente 1/2 de la dosis inicial) si el ratón muestra signos de despertar, que, según nuestra experiencia, ocurre aproximadamente después de 2 x 3 h después de la anestesia.</li>
	<li>Aplicar la misma cantidad de salina intravenosa que en los ratones BD. NOTA: El ratón falso recuperará la respiración espontánea después del cese de la ventilación. El ratón BD no lo hará. Las pruebas de apnea deben realizarse al establecer el modelo, pero durante los experimentos se debe evitar debido al estrés fisiológico innecesario.</li>
</ol>

<ol><li>Hart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN%2FSRTR+2017+Annual+Data+Report%3A+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney.</a> American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).</li>
<li>The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameters+for+determining+brain+death+in+adults+%28summary+statement%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement).</a> Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).</li>
<li>Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+rates+of+kidney+transplants+from+spousal+and+living+unrelated+donors%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+Medicine%22%5BJournal%5D)">High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors.</a> New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).</li>
<li>Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+be+learned+from+brain-death+models%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">What can be learned from brain-death models?</a> Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).</li>
<li>Wilhelm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+heart+by+donor+brain+death+accelerates+acute+rejection+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation.</a> Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).</li>
<li>Pomper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+a+mouse+model+of+brain+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Introducing a mouse model of brain death.</a> Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).</li>
<li>Ritschl, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+brain+death+leads+to+differential+immune+activation+in+solid+organs+but+does+not+accelerate+ischaemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury.</a> Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).</li>
<li>Atkinson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+brain+death+exacerbates+complement-dependent+ischemia%2Freperfusion+injury+in+transplanted+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts.</a> Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).</li>
<li>Oberhuber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+tetrahydrobiopterin+overcomes+brain+death-associated+injury+in+a+murine+model+of+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).</li>
<li>Floerchinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+immune+responses+in+a+reproducible+mouse+brain+death+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model.</a> Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).</li>
<li>Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+barbiturate+protection+in+a+dog+model+of+complete+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia.</a> Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).</li>
<li>Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiological+effects+of+brain+death+on+potential+donor+organs%2C+with+particular+reference+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Royal+College+of+Surgeons+of+England%22%5BJournal%5D)">The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart.</a> Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).</li>
<li>Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+organ+perfusion+after+brain+death+in+the+rat+and+its+relation+to+circulating+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines.</a> Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La BD, un factor de riesgo para la calidad del aloinjerto en donantes multiorgánicos, implica una plétora de cambios fisiopatológicos, que sólo pueden evaluarse suficientemente utilizando modelos in vivo. Los cambios hemodinámicos, la tormenta de citoquinas, los cambios hormonales y su impacto final en la calidad y supervivencia del injerto de órganos no se pueden analizar in vitro4. La mayoría del trasplante básico, así como la investigación inmunológica depende de herramientas de diagnóstico sof...

El trasplante es actualmente el único tratamiento curativo para la insuficiencia orgánica terminal. Hasta ahora, los pacientes de muerte cerebral (BD) han sido la principal fuente de donaciones de órganos, aunque la donación y la donación vivas después de la muerte circulatoria son valiosas alternativas1. La BD se define por un coma irreversible (con una causa conocida), la ausencia de reflejos del tallo cerebral y la apnea2. Desafortunadamente, los órganos BD demuestran resultados inferiores en la supervivencia del injerto a largo plazo independientemente del antígeno leucocito humano (HLA)-desajuste y tiempo isquémico frío3. Mientras tanto, se ha realizado una investigación intensiva sobre este factor de riesgo independiente del antígeno, lo que resulta en tres aspectos principales de los cambios fisiopatológicos mediados como consecuencia de BD: hemodinámico, hormonal e inflamatorio4.
Hasta la fecha, los modelos experimentales de BD en roedores se han realizado principalmente utilizando ratas. Con el fin de obtener una mayor comprensión de las consecuencias inmunológicas en los órganos sólidos que siguen a bd, nuestro objetivo era establecer un modelo murino de BD, ya que actualmente sólo los modelos de ratón permiten investigaciones exhaustivas sobre factores genéticos o inmunológicos. En este contexto, el sistema de ratón proporciona una mayor variedad de herramientas analíticas.
El principio de inducción de BD como se describe aquí se basa en un aumento de la presión intracraneal inducido por la inflación de un catéter de globo insertado debajo del cráneo. El aumento de la presión intracraneal imita el mecanismo fisiológico de BD bloqueando la perfusión del cerebro, el ceretulo y el tronco cerebral5,,6. Para garantizar una perfusión suficiente de los órganos periféricos, la medición de la presión arterial es obligatoria durante el procedimiento. El catéter utilizado para este propósito al mismo tiempo sirve para la administración salina con el fin de estabilizar la presión arterial mediante la sustitución de líquidos. Dado que la BD va acompañada de el cese de la respiración espontánea, se debe garantizar una ventilación suficiente. Una manta eléctrica mantiene la temperatura corporal del núcleo fisiológico.
En resumen, este modelo permitirá estudios en profundidad sobre la influencia de la lesión inducida por BD, en la migración de leucocitos7, la activación de los cumplidos8,la lesión por reperfusión isquémica9y otros factores.

<table><tbody><tr><td>Catéter arterial (BD Neoflon 26G)</td><td></td><td></td>Transductores de presión arterial BD 391349 <td></td></tr><tr><td>(APT300)</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>Catéter de embolectomía arterial Fogarty N&deg; 3</td><td>Edwards Lifesciences Corporation</td><td>120403F</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de mantas homeotérmicas con sonda flexible</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>Ketansol</td><td>Graeub 6680110</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro tijera</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>FST</td><td>12060-02</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>8698H</td><td></td></tr><tr><td>Bomba 11 Elite Infusion Solo un aparato</td><td>Harvard Inc.</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Tijera</td><td>FST</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereotáctico</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Transpore Tape</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas</td><td>Molinea.A</td><td>274301</td><td></td></tr><tr><td>Ventilador para ratones (MiniVent Modelo 845)</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Xylasol</td><td>Graeub</td><td>7630109</td><td></td></tr></tbody></table>

inducción de la muerte cerebral en ratones que utilizan la monitorización y ventilación de la presión arterial intraarterial a través de la traqueotomía

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

Si bien tanto la donación viva como la donación después de la muerte circulatoria proporcionan oportunidades alternativas para el trasplante de órganos, la donación después de la muerte cerebral del donante (BD) sigue representando la principal fuente de trasplantes sólidos. Desafortunadamente, la pérdida irreversible de la función cerebral es conocida por inducir múltiples cambios fisiopatológicos, incluyendo hemodinámicas, así como modificaciones hormonales, finalmente conduce a una respuesta inflamatoria sistémica. Los modelos que permiten una investigación sistemática de estos efectos in vivo son escasos. Presentamos un modelo murino de inducción bd, que podría ayudar a las investigaciones sobre los efectos devastadores de BD en la calidad del aloinjerto. Después de implementar la medición de la presión arterial intraarterial a través de la arteria carótida común y la ventilación confiable a través de una traqueotomía, BD es inducida por el aumento constante de la presión intracraneal utilizando un catéter globo. Cuatro horas después de la inducción de BD, los órganos pueden ser cosechados para análisis o para procedimientos de trasplante posteriores. Nuestra estrategia permite el análisis integral de BD de donantes en un modelo murino, permitiendo así una comprensión profunda de los efectos relacionados con la BD en el trasplante de órganos sólidos y potencialmente allanar el camino para optimizar el preacondicionamiento de órganos.

El modelo murine BD se realizó con éxito más de 100 veces con una tasa de éxito de más del 90%. Además, el trasplante de órganos post-intervenicional esel7.
BD induce una variedad de cambios fisiopatológicos que pueden ser investigados más a fondo usando este modelo. Como se muestra en la Figura 1, la presión arterial muestra un pico hipertensivo inicial seguido de una fase h...

Presentamos un modelo murino de inducción de la muerte cerebral con el fin de evaluar la influencia de sus efectos fisiopatológicos en los órganos, así como en injertos consecutivos en el contexto del trasplante de órganos sólidos.

Inducción de la muerte cerebral en ratones que utilizan la monitorización y ventilación de la presión arterial intraarterial a través de la traqueotomía

While both living donation and donation after circulatory death provide alternative opportunities for organ transplantation, donation after donor brain ...

Aunque la donación después de la muerte cerebral del donante es la principal fuente de trasplante de órganos sólidos, la pérdida irreversible de la función cerebral induce cambios fisiopatológicos que conducen a una respuesta inflamatoria sistémica. Este modelo murino de inducción de la muerte cerebral permite el uso de una gran variedad de herramientas analíticas y modelos de knockout para estudiar las vías de regulación de la muerte cerebral. Para el cateterismo arterial después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal y quitar el vello abdominal superior, desinfectar la piel expuesta con 70% de etanol y utilizar tijeras diseccionantes para hacer una incisión de línea media en la piel.Usando fórceps, disecciona la glándula submandibular y el tejido muscular del cuello y separa los tejidos para exponer la arteria carótida común. Colocar tres 8-0 ligaduras de seda debajo de la arteria carótida común derecha y colocar una abrazadera en la ligadura proximal. Traiga tensión en la arteria para que el flujo se suspenda y cierre la ligadura más distal.Inserte un catéter arterial de calibre 26 a través de un pequeño orificio de piel preformado en el aspecto craneal de la in

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