Name: Entrega de ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprenda a entregar ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio. Este protocolo estandarizado permite la expresión transitoria de genes en el corazón con aplicaciones en investigación cardíaca.

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Los autores reconocen a Ann Anu Kurian por su ayuda con este manuscrito. Este trabajo fue financiado por una beca de puesta en marcha de cardiología otorgada al laboratorio Zangi y también por la subvención DE NIH R01 HL142768-01

Todos los procedimientos con animales descritos aquí han sido aprobados por la Escuela de Medicina de Icahn en el Comité de Cuidado y Uso Institucional del Monte Sinaí.
1. Síntesis de modRNA
NOTA: Los detalles de la síntesis de modRNA se pueden encontrar en Kondrat et al.13.
<ol><li>Pida las plantillas de plásmido(Tabla de materiales)y genere un producto PCR limpio para utilizarlo como plantilla de ARNm.</li>
	<li>Preparar los modRNAs por transcripción in vitro con una mezcla de ribonucleósido personalizada de la siguiente (Tabla de materiales): Kit de transcripción T7, 6 mM análogo de tapa anti-retroceso (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, trifosfato de guanosina de 75 mM, trifosfato de adenosina de 75 mM, trifosfato de citidina de 75 mM, pseudouridina-5-trifosfato de 100 mM y enzima T7 DNase.</li>
	<li>Purificar el modRNA realizado en el paso 1.2 con un kit de limpieza de transcripción(Tabla de materiales)y tratar con fosfatasa antártica. A continuación, vuelva a purificar el modRNA con el kit de limpieza de transcripción y cuantifique utilizando un espectrofotómetro.</li>
	<li>Precipite el modRNA con acetato de etanol y amonio y resuspend en 10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA.</li>
	<li>Concentrar el modRNA para la entrega in vivo mediante filtros centrífugos y medir la calidad utilizando una plataforma de electroforesis automatizada(Tabla de Materiales).</li>
</ol>2. Preparación de la inyección de modRNA para la entrega in vivo
<ol><li>Calcular el volumen necesario para 100 g de inyección de luciferasa (Luc)/Cre modRNA en función de la concentración de modRNA.</li>
	<li>Mezclar el volumen calculado de modRNA con partes iguales de solución de sacarosa preparadas en agua libre de nucleasa (0,3 g/ml) y solución de citrato de 0,1 M (pH a 7) (20 l cada una recomendada).</li>
	<li>Lleve el volumen final de la inyección a 60 l añadiendo solución salina.</li>
</ol>3. Cirugía de infarto de miocardio
<ol><li>Anestesia y preparación del animal NOTA: Este estudio utiliza ratones CFW masculinos y hembras de 8 a 12 semanas de edad.<ol>
<li>Anestesar el ratón con 2% de isoflurano utilizando una cámara de inducción y colocar el animal en su espalda en una posición dorsal con una máscara facial sobre su nariz y boca para mantener la anestesia. Mantener la anestesia mediante ventilación mecánica utilizando un respirador equipado con un tubo de vía respiratoria de 7 x 8 mm y un filtro.</li>
		<li>Para inmovilizar al ratón en la plataforma de la cirugía, asegure sus extremidades con cinta quirúrgica. afeitar la zona del cuello y el lado izquierdo de la caja torácica y desinfectar usando 70% etanol y yodo povidona. Repita el paso de desinfección dos veces. Compruebe sus reflejos, pellizcando la cola y los pies traseros para evaluar la profundidad de la anestesia.</li>
		<li>Monitorizar y mantener continuamente la temperatura corporal del núcleo a la normotermia (37,5 x 38 oC).</li>
		<li>Mantener una vía aérea abierta realizando intubación intratraqueal. Para ello, coloque el ratón en una posición ventral con la boca hacia el experimentador y tire suavemente de la lengua. Ajuste el ángulo del cuello y enderece la trayectoria de intubación y empuje la cánula de intubación.</li>
		<li>En caso de que el animal no pueda respirar a través de él, se puede realizar traqueotomía. Realizar una incisión cervical a lo largo de la línea media aislando la piel, el músculo y el tejido que delinea la tráquea usando un microscopio. Cuando la tráquea sea claramente visible, inserte el tubo endotraqueal en el tejido entre dos anillos de cartucho por debajo de la glotis haciendo un pequeño agujero y sosteniendo la parte craneal de la tráquea usando fórceps microquirúrgicos.</li>
		<li>Observe el movimiento torácico del ratón para verificar que ambos pulmones están recibiendo oxígeno. La frecuencia respiratoria (RR) debe ser de aproximadamente 120 respiraciones por minuto, con una presión inspiratoria de 17-18 cm H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligadura de la arteria descendente anterior izquierda (LAD)<ol>
<li>Para realizar la ligadura LAD, gire el ratón con cuidado para que esté acostado en su lado derecho. Levante la piel y realice una toracotomía del lado izquierdo entre la 3a y la 4a costilla y disecciona el tejido y el músculo cuidadosamente. Use un cautey para prevenir el sangrado.</li>
		<li>Abra el tórax con cuidado y una vez abierto, encontrar el corazón, sin tocar el pulmón con ningún objeto afilado. Coloque los retractores en la incisión para mantener la cavidad torácica abierta y tener una visión clara del corazón. Ahora mueva los pulmones al borde de la incisión y retire la parte del saco pericárdico que está cubriendo el corazón para acceder a la superficie anterior del corazón.</li>
		<li>Identifique cuidadosamente el LAD, que puede ser visto como un vaso rojo luz profunda ubicado entre la arteria pulmonar y la aurícula izquierda. Ligar el LAD proximal con una sola sutura de una sutura de seda 7-0. Coloque un tubo torácico (28 G, catéter venal), entre la 4a y la 5a costilla.</li>
		<li>Cierre la incisión torácica en capas. Utilice las suturas de running de seda 6-0 para adaptar las costillas y utilice suturas de running de seda 5-0 para cerrar la piel. Asegúrese de dejar una ventana adecuada para la medición ecocardiográfica futura.</li>
		<li>Escurra cuidadosamente el tórax con solución isotónica caliente (9 g de cloruro de sodio en 1 L de agua) utilizando una jeringa de 2 ml. Coloque el ratón sobre su parte posterior. Si realiza la traqueotomía, saque el tubo endotraqueal y utilice suturas de seda 7-0 adaptando los anillos del cartucho traqueal con una sola puntada. Coloque la máscara facial sobre el ratón y cierre la piel con suturas de seda 5-0.</li>
		<li>Para la fase de recuperación, desconecte la cánula de intubación del respirador y permita la respiración espontánea. Coloque al animal debajo de una lámpara de calor hasta que alcance la conciencia. No deje al animal desatendido después de la cirugía hasta que esté completamente despierto.</li>
		<li>Gestione la terapia del dolor con buprenophine a 0,1 mg/kg de peso corporal, inyectada por vía subcutánea durante los próximos 3 días a intervalos de 12 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Entrega cardíaca de modRNA
<ol><li>Entregar un total de 60 l del modRNA preparado en el paso 2.3 por vía intramuscular (IM) utilizando una jeringa de insulina (31 G) después de un MI.<ol>
<li>Inyectar 20 l del modRNA en tres sitios diferentes del músculo cardíaco que rodean el área del infarto (dos a cada lado de la ligadura y uno en el ápice). Realice las inyecciones inmediatamente después del LAD, antes de cerrar el tórax. NOTA: Las imágenes representativas de los sitios de inyección de modRNA se pueden ver en la Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Validación de la expresión de proteínas en el corazón después de MI
<ol><li>Expresión de modRNA luciferasa utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia NOTA: Un total de 100 g de ArNm De Luc preparado en 60 ml del tampón de citrato de sacarosa se inyecta directamente en el corazón de los ratones CFW después de la MI.<ol>
<li>A las 24 h después de la inyección de MI y modRNA, anestesiar a los ratones con 2% de isoflurano utilizando una cámara de inducción e inyectar intraperitonealmente luciferina (150 mg/g de peso corporal) para validar la señal Luc in vivo.</li>
		<li>Ijelucia a los ratones utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia cada 2 minutos hasta que la señal Luc alcance la saturación.</li>
		<li>Cuantifique los datos de imágenes recopilados con un software de análisis de imágenes. Utilice los ratones inyectados con solución salina sólo como lectura de línea base para la expresión de Luc y reste la señal de fondo recogida de los ratones inyectados en solución salina. NOTA: La señal Luc se expresa en p/s/cm2/sr x 106.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inmunostaining for Cre transfection validation<ol>
<li>Para validar la transfección con Cre, sacrificar los animales 24 h postinyección utilizando una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina seguida de dislocación cervical. Antes de hacer una incisión, desinfecte el pecho y el abdomen con un hisopo de alcohol al 70%.</li>
		<li>Abra la cavidad torácica haciendo una incisión transversal 1 cm más baja que el esternón y mueva las tijeras hacia la cabeza, cortando a través de la caja torácica.</li>
		<li>Abra el tórax e inyecte 1 ml de PBS estéril en la cámara ventricular derecha para eliminar el exceso de sangre. Exéme el corazón inmediatamente y colóquelo en el PBS estéril para lavar la sangre restante.</li>
		<li>Fijar el corazón en 4% de paraformaldehído (PFA) durante 24 h, seguido de la incubación durante la noche en 30% de solución de sacarosa a 4 oC. Al día siguiente incrustar los corazones en un medio de temperatura de corte óptimo y secciones de ellos a un espesor de 10 m utilizando un criostato.</li>
		<li>Manche las secciones con anticuerpo primario contra la troponina cardiaca I (cTNI) y etiquete con un anticuerpo secundario fluorescente. Para identificar el núcleo, mancha con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 5 min. Imagen de las diapositivas usando un microscopio fluorescente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Análisis estadístico
<ol><li>Trazar un gráfico de barras basado en la expresión Luc en ratones con solución salina e inyectados en Luc e informar de los valores como medio de SEM. Compare los dos grupos utilizando una prueba t no asalada (****p < 0.0001).</li>
</ol>

<ol><li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li>
<li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+Immune+Response+to+AAV%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341(2013).</li>
<li>Diebold, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+agonists+for+Toll-like+receptor+7+are+defined+by+the+presence+of+uridine+ribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides.</a> European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).</li>
<li>Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Based+Protein+Replacement+Therapy+for+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li>
<li>Hadas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Modified+mRNA+In+Vitro+Synthesis+Protocol+for+Heart+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy.</a> Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Cardiac+Delivery+of+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).</li>
<li>Zangi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Carlsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+VEGF-A+mRNA+Improves+Cardiac+Function+after+Intracardiac+Injection+1+Week+Post-myocardial+Infarction+in+Swine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine.</a> Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).</li>
<li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li>
<li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li>
<li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li>
<li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La terapia génica ha demostrado un enorme potencial para avanzar significativamente en el tratamiento de la enfermedad cardíaca. Sin embargo, herramientas tradicionales empleadas en los ensayos clínicos iniciales para el tratamiento de la IC han demostrado un éxito limitado y están asociadas con efectos secundarios graves. El ARN modificado presenta un suministro de genes no virales que está ganando popularidad continuamente como herramienta de transferencia de genes en el corazón. ModRNA no requiere localización nuclear...

La terapia génica es una poderosa herramienta que implica la administración de ácidos nucleicos para el tratamiento, cura o prevención de enfermedades humanas. A pesar de los avances en los enfoques diagnósticos y terapéuticos para las enfermedades cardíacas, ha habido un éxito limitado en la administración de genes en el infarto de miocardio (MI) y la insuficiencia cardíaca (HF). Tan sencillo como parece el proceso de la terapia génica, es un enfoque marcadamente complejo teniendo en cuenta los muchos factores que deben optimizarse antes de emplear un vehículo de entrega en particular. El vector de administración correcto debe ser no inmunogénico, eficiente y estable dentro del cuerpo humano. Los esfuerzos en este campo han generado dos tipos de sistemas de administración: viral o no viral. Los sistemas virales ampliamente utilizados, incluida la transferencia de genes por adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus asociados al adeno, han demostrado una capacidad de transducción excepcional. Sin embargo, su uso en clínicas es limitado debido a la fuerte respuesta inmune inducida1, riesgo de tumorigenesis2, o la presencia de anticuerpos neutralizantes3, todos los cuales siguen siendo un obstáculo importante para la aplicación amplia y eficaz de vectores virales en la terapia génica humana. Por otro lado, a pesar de su impresionante patrón de expresión, la entrega de ADN plásmido desnudo muestra una baja eficiencia de transfección, mientras que la transferencia de ARNm presenta una alta inmunogenicidad y susceptibilidad a la degradación por RNase4.
Con la extensa investigación en el campo del ARNm, modRNA se ha convertido en una herramienta atractiva para la entrega de genes al corazón y varios otros órganos debido a sus numerosas ventajas sobre los vectores tradicionales5. La sustitución completa de la uridina por pseudouridina de origen natural da como resultado una expresión proteica más robusta y transitoria, con una inducción mínima de la respuesta inmunitaria innata y el riesgo de integración genómica6. Los protocolos recientemente establecidos utilizan una cantidad optimizada de análogo de tapa antirrevertida (ARCA) que mejora aún más la traducción de proteínas al aumentar la estabilidad y transabilidad del ARNm sintético7.
Informes anteriores han mostrado la expresión de varios genes reporteros o funcionales entregados por modRNA en el miocardio de roedores después de MI. Con las aplicaciones de modRNA, áreas significativas del miocardio, incluyendo tanto cardiomiocitos como nocardiomiocitos, han sido trans infectadas con éxito lesión post-cardiaca8 para inducir la angiogénesis9,10, supervivencia de células cardíacas11, y la proliferación de cardiomiocitos12. Una sola administración de modRNA codificado para la follistatina humana mutada-como 1 induce la proliferación de CM adultos de ratón y aumenta significativamente la función cardíaca, disminuye el tamaño de la cicatriz, y aumenta la densidad capilar 4 semanas después de MI12. Un estudio más reciente reportó mejor función cardíaca después de MI con la aplicación de VEGFA modRNA en un modelo de cerdo10.
Por lo tanto, con la mayor popularidad del modRNA en el campo cardíaco, es esencial desarrollar y optimizar un protocolo para la entrega de modRNA al corazón post-MI. Aquí es un protocolo que describe la preparación y entrega de modRNA purificado y optimizado en una formulación biocompatible citrato-salina que proporciona una expresión de proteína robusta y estable sin estimular ninguna respuesta inmune. El método mostrado en este protocolo y vídeo demuestra el procedimiento quirúrgico estándar de un MI de ratón por ligación permanente de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), seguido de tres inyecciones intracardiacas del sitio de modRNA. El objetivo de este artículo es definir claramente un método altamente preciso y reproducible de administración de modRNA al miocardio murino para hacer que la aplicación modRNA sea ampliamente accesible para la terapia génica cardíaca.

<table><tbody><tr><td>Trifosfato de adenosina</td><td>Invitrogen AMB13345</td><td></td><td>Incluido en el kit Megascript</td></tr><tr><td>Fosfatasa antártica</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>Analógico de tapa anti-retroceso, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-7003</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imágenes bioluminiscentes</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>IVIS100 sistema de imágenes de dispositivo de carga acoplada</td></tr><tr><td>Retractores romos</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Tropnina cardíaca I</td><td>Abcam</td><td>47003</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de citidina</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Incluido en el kit Megascript</td></tr><tr><td>Sistema de Anestesia Dual</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas- Adson</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas- Dumont #7</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de guanosina</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Incluido en el kit Megascript</td></tr><tr><td>Kit de transcripción in vitro</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>5X MEGAscript T7 Kit</td></tr><tr><td>cánula de intubación Aparato</td><td>Harvard</td> Kit <td></td><td></td></tr><tr><td>Megaclear</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ventilador de ratón</td><td>Aparato Harvard</td><td>73-4279</td><td></td></tr><tr><td>N1-metilpseudouridina-5-trifosfato</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-1081</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olsen hegar portaagujas con tijeras de sutura</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Plantillas de plásmidos</td><td>GeneArt, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección de punta afilada</td><td>FST</td><td>14200-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Ethicon</td><td>Y433H</td><td>5.00</td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6.00</td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Ethicon</td><td>7733G</td><td>7.00</td></tr><tr><td>T7 Enzima DNasa</td><td>Invitrogen AMB13345</td><td></td><td>Incluido en el kit Megascript</td></tr><tr><td>Estación</td> <td>de cintaAligent</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Kit de limpieza de transcripción</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908</td><td>Megaclear</td></tr><tr><td>Ultra-4 filtros centrífugos 10k</td><td>Amicon</td><td>UFC801096</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega de arnm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

El infarto de miocardio (MI) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo occidental. En la última década, la terapia génica se ha convertido en una opción de tratamiento prometedor para las enfermedades cardíacas, debido a su eficiencia y efectos terapéuticos excepcionales. En un esfuerzo por reparar el tejido dañado después de la MI, varios estudios han empleado terapia génica viral o basada en el ADN, pero han enfrentado obstáculos considerables debido a la expresión pobre e incontrolada de los genes entregados, edema, arritmia e hipertrofia cardíaca. El ARNm modificado sintético (MODRNA) presenta un novedoso enfoque de terapia génica que ofrece un suministro de ARNm alto, transitorio, seguro, no nommunogénico y controlado al tejido cardíaco sin ningún riesgo de integración genómica. Debido a estas características notables combinadas con su farmacocinética en forma de campana en el corazón, modRNA se ha convertido en un enfoque atractivo para el tratamiento de enfermedades del corazón. Sin embargo, para aumentar su eficacia in vivo, es necesario seguir un método de entrega coherente y fiable. Por lo tanto, para maximizar la eficiencia de la entrega de modRNA y la consistencia del rendimiento en el uso de modRNA para aplicaciones in vivo, se presenta un método optimizado de preparación y entrega de la inyección intracardiaca modRNA en un modelo MI de ratón. Este protocolo hará que la entrega de modRNA sea más accesible para la investigación básica y traslacional.

Ratones de ocho a diez semanas de edad fueron anestesiados con isoflurano e intubados. Después de que el animal estaba bajo anestesia, la región torácica izquierda fue afeitada y esterilizada con etanol, y el corazón fue expuesto para la ligadura de LAD. La arteria coronaria izquierda se ocluyó anudando firmemente la sutura debajo de la arteria (representación del diagrama Figura 1A). Después de un infarto exitoso (indicado por el paling de la pared libre ventricular izquierda), se entregó d...

Este protocolo presenta una manera simple y coherente de regular transitoriamente un gen de interés utilizando modRNA después del infarto de miocardio en ratones.

Entrega de ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

El ARN modificado es un método novedoso para la transferencia de genes al corazón y a otros órganos. Este protocolo proporcionará un enfoque preciso de la entrega de genes deseados transitoriamente al corazón, después del infarto de miocardio. Este método no se limita al infarto de miocardio, sino que también se puede aplicar a la reperfusión de isquemia y a los modelos de constricción aórtica transversal.El ARN modificado se utiliza en varios ensayos clínicos en humanos. Sin embargo, no existe un protocolo estandarizado para el gen transferido al corazón utilizando este método. La demostración visual permitirá a los investigadores inyectar correctamente ARN modificado en los sitios apropiados del corazón.Demostrando el procedule estarán Ajit Magadum, un tipo postdoctoral, y Elena Chepurko, supervisora animal de nuestro laboratorio. Sobre la base de la concentración de la previamente preparada en modRNA, calcular el volumen de modRNA necesario para una inyección de 100 microgramos. Hace volúmenes iguales de soluciones de sacarosa y citrato.A continuación, agregue el volumen calculado de modRNA, y suficiente solución salina para llevar el volumen de inyección a 60 microlitros. Despu

delivery-of-modified-mrna-in-a-myocardial-infarction-mouse-model

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Numerosas manipulaciones genéticas y / o inyecciones intramiocárdica de genes, proteínas, células, y / o los biomateriales se superponen a la dimensión del tiempo en los estudios de agudos de isquemia / reperfusión y la remodelación crónica en ratones. Este video ilustra los procedimientos de microcirugía de la isquemia / reperfusión, la ligadura permanente de la arteria coronaria, y los estudios de inyección intramiocárdica.

Ligadura de las arterias coronarias y la inyección intramiocárdica en un modelo murino de infarto

El procedimiento quirúrgico utilizado para inducir el infarto de miocardio experimental en ratones comienza con toracotomía izquierda entre la tercera y las costillas cuarta con el fin de visualizar la superficie anterior del corazón y el pulmón izquierdo. La arteria coronaria izquierda se ligó, el pecho se cierra y el ratón se le permite recuperarse de manera espontánea.

Técnica modificada para la ligadura de la arteria coronaria en ratones

Se introduce un método quirúrgico para inducir experimental de isquemia / reperfusión (I / R) lesión para simular el infarto de miocardio (MI) en modelos de ratón que permite una mayor claridad en el posicionamiento de la ligadura en la arteria descendente anterior izquierda (LAD) para aumentar la reproducibilidad de experimentos en ratones MI.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

Inyección intramiocárdica percutánea guiada por ecocardiografía representa una modalidad eficiente, fiable, y objeto de orientación para la entrega de agentes de transferencia de genes o células en el corazón murino. Siguiendo los pasos descritos en este protocolo, el operador puede convertirse rápidamente competente en esta técnica versátil, mínimamente invasivo.

Guiada por ecografía transtorácica intramiocárdica inyección en ratones

Se describe un modelo altamente reproducible para el infarto de miocardio en ratones con manipulaciones mínimamente invasivas. El modelo se puede realizar fácilmente, lo que resulta en una alta reproducibilidad y tasa de supervivencia. Por lo tanto, el modelo descrito reducirá el número de animales requeridos según lo solicitado por el principio de las 3R (Reemplazo, Refinamiento y Reducción).

Mínimo procedimiento quirúrgico invasivo de inducir infarto de miocardio en ratones

Aquí se describe un procedimiento quirúrgico que muestra cómo lograr la ligadura permanente de la arteria coronaria descendente izquierda-anterior en ratones. Este modelo es de gran relevancia para investigar la fisiopatología del infarto de miocardio y los procesos biológicos concomitantes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Este artículo demuestra un modelo para estudiar la remodelación cardíaca después de la criolesión miocárdica en ratones.

Un modelo de criolesiones para estudiar el infarto de miocardio en el ratón

Bajo la anestesia adecuada, el corazón del ratón se exteriorizó a través del espacio intercostal, y el infarto de miocardio se indujo con éxito mediante la ligadura de la arteria descendente anterior (DA) izquierda utilizando materiales fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios.

Un método simple modificado para la inducción de infarto de miocardio en ratones

En este trabajo describimos un método sencillo y reproducible que puede inducir infarto de miocardio o lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones mediante ligadura de precisión de la arteria coronaria descendente anterior izquierda mediante micromanipulación.

Inducción de infarto de miocardio y lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones

Aquí se presenta un procedimiento quirúrgico para la ligadura permanente de la arteria coronaria izquierda en ratones. Este modelo se puede utilizar para investigar la fisiopatología y la respuesta inflamatoria asociada después del infarto de miocardio.

Ligadura de la arteria coronaria izquierda: un modelo murino quirúrgico de infarto de miocardio

Aprenda a entregar ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio. Este protocolo estandarizado permite la expresión transitoria de genes en el corazón con aplicaciones en investigación cardíaca.

Entrega de ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio

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