Síntesis de nanopartículas magnéticas funcionalizadas, su conjugación con el Siderophore Feroxamine y su Evaluación para la Detección de Bacterias

Las nanopartículas magnéticas son herramientas ideales para la ciencia analítica y la nano medicinea debido a sus fuertes propiedades magnéticas y la fácil funcionalización de su superficie. Aquí informamos de la primera instancia de un conjugado entre las partículas magnéticas de sílice funcionalizadas amino y la feroxamina siderofore junto con la evaluación para la captura de material fotogénico. Los sideróforos son moléculas pequeñas y orgánicas que desempeñan un papel clave en el mecanismo de participación de hierro, y son reconocidas por receptores específicos de membrana externa de bacterias.

Este vídeo muestra, paso a paso, un protocolo eficiente para preparar nanopartículas magnéticas de hierro. Luego, fueron recubiertos con sílice para proteger la dispersión y proteger el núcleo magnético. La superficie resultante del reactor fue funcionalizada con grupos de aminas.

Síntesis de nanopartículas magnéticas conjugadas con feroxamina. Añadir 0,5 gramos de Fe(acac)3 en un vial de vidrio de 20 ml. Luego, mezcle con 10 ml de alcohol bencílico.

Sonicar esta mezcla durante 2 minutos. A continuación, transfiera a un bloque de calefacción y caliente a 180 grados Centigrados durante 72 horas. Enjuague las nanopartículas con 96%etanol.

Y centrifugar durante 30 minutos. Separe las nanopartículas del sobrenadante por atracción magnética, utilizando un imán de neodimio. Deseche el disolvente residual.

Deseche el sobrenadante, alternando con la sonicación, hasta que el disolvente se vea claro. Preparar una suspensión de 2 gramos de MNP en 80 mililitros de isopropanol, añadir 4 mililitros de 21%amoníaco, 7,5 mililitros de agua destilada y 0,56 mililitros de TEOS. Calentar la mezcla a 40 grados Centigrados durante 2 horas, con agitación continua.

Luego, sonicar durante 1 hora. Separe el MNP con un imán, deseche el sobrenadante, disperse en 30 mililitros de isopropanol, agregue amoníaco, agua destilada y TEOS, en el mismo orden descrito anteriormente. Calentar la mezcla a 40 grados Centigrados durante dos horas con agitación continua.

Luego, sonicar durante una hora. Retire y lave convenientemente la barra de agitación magnética, para recuperar todo el material. Deseche el sobrenadante y enjuague las nanopartículas con 96%etanol tres veces, alternando con sonicación.

Seque las nanopartículas al vacío a temperatura ambiente durante 12 horas. Enjuagar 500 miligramos del MNP@SIO2 obtenidos del paso anterior con dimetilformamida. Sonicarlos y descartarlos.

Vuelva a suspender las partículas en un matraz de fondo redondo, revuelva con una barra magnética y añada 9 mililitros de APTES. Revuelva la mezcla a 60 grados Centígrados durante 12 horas. Deseche el sobrenadante y enjuague las nanopartículas con 96%etanol tres veces, alternando con sonicación.

Disolver 100 mg de deferoxamina, sal de mesilato y 53,0 miligramos de acetiladacetonato de hierro en 5 mililitros de agua destilada. Revuelva la mezcla durante la noche a temperatura ambiente. Lave el producto resultante tres veces con 20 mililitros de acetato de etilo en un embudo de separación.

Retire el disolvente orgánico al vacío. Seque la fase acuosa para permitir la feroxamina y un sólido rojo. Añadir 350 miligramos de anhídrido succínico a una solución de 100 mg de feroxamina en 5 mililitros de piridina en un matraz de fondo redondo de 50 mililitros.

Revuelva la mezcla resultante, a temperatura ambiente, durante 16 horas. Retire el exceso de piridina bajo presión reducida. Disolver el crudo de reacción en 3 mililitros de metanol.

Transfiera la solución metanólica a una columna LH-20 y elula a 0,5 ml/minuto. Recoger la fracción roja y retirar el metanol bajo vacío. Enjuague 30 mg de nanopartículas funcionalizadas de amina seca dos veces con DMF y sonice las nanopartículas en un matraz Erlenmeyer de 100 mililitros durante 30 minutos.

Preparar una solución de 200 miligramos de N-succinilferoxamina, 173 miligramos de Benzotriazol 1-yl-oxy-tris-phosphonium hexafluorophosphate BOP, 46 mg 1-hydroxybenzotriazol HOBt y 128,8 miligramos N, N-diisopropylethylamine DIPEA, en 10 ml de DMF, en un matraz de fondo redondo de 50 mililitros. Suspenda el MNP@SiO2@NH2 previamente enjuagado en un 3 mililitros de DMF, bajo sonicación en condiciones secas y libres de oxígeno. Usa la atmósfera de argón.

Añadir, gota a gota, mezclar A para mezclar B.Shake la mezcla final, usando un agitador orbital, a temperatura ambiente durante la noche. Separe el conjugado resultante de la suspensión utilizando un imán. Ensayo bacteriano con cepas de Y.enterocolitica para cuantificar el aislamiento y la captura de bacterias patógenas con nanopartículas.

Preparar una suspensión de todas las nanopartículas intermedias y el conjugado final en PBS a 1 mg/ml en tubos estériles. Preparar una cultura de Y.entorocolitica en 5 ml de Luria Bertani, LB, caldo durante la noche. Preparar un caldo de soja de tripa de 5 ml de hierro deficiente, TSB, mediante la adición de 50 microlitros de 10 mM 2, 2-bipirutilo solución.

Inocular el 5 mililitro de caldo TSB deficiente de hierro con 50 microlitros del cultivo nocturno de Y.enterocolitica. Incubar a 37 grados Centígrados con agitación hasta que se alcance una OD600 de 0.5 a 0.8. Tomar unas 100 microlitros del cultivo nocturno y diluirlo en un tubo que contenga 900 microlitros de PBS para obtener la primera dilución 1/10.

Luego, preparar una dilución 1/100 de la primera dilución usando el mismo procedimiento para obtener una concentración de células bacterianas a 10 a la potencia de 6 Unidades Formadoras de Colonias por mililitro aproximadamente. Añadir 100 microlitros de suspensión de nanopartículas y 1 mg/ml a 1 mililitro de dilución de bacterias 1/100. Separe los agregados de la bacteria MNP, utilizando un imán, deseche, cuidadosamente, el sobrenadante.

Enjuague las nanopartículas separadas dos veces con PBS de 1 milímetro utilizando un vórtice. Preparar cuatro diluciones sucesivas 1/10 desde la suspensión anterior, hasta un 10 a la potencia de menos 4 dilución. Placa 10 microlitros de cada dilución en placas de agar TS.

Fotografía la placa con un digitalizador de gel en modo epi blanco. Procesar la imagen, utilizando el software conveniente, para amplificar un lugar para contar el número de colonias individuales. Para confirmar la formación del vínculo covalente entre las nanopartículas y el sideróforo, empleamos espectroscopia FT-IR Raman para monitorear la síntesis, observando cómo las nuevas bandas aparecen de acuerdo con un nuevo grupo funcional en cada paso.

La microscopía TEM y SEM se utilizaron para observar la morfología y el tamaño de las partículas. Análisis termogravimétrico para medir la pérdida de peso debido a la adición de material orgánico. Y XPS nos permite analizar los diferentes estados de oxidación de los átomos en la superficie y confirmar la formación de enlaces covalentes.

Finalmente, utilizamos todos los intermedios en el conjugado final para probar su capacidad de capturar bacterias, con el fin de establecer sus propiedades como biosensor. Este protocolo fue diseñado para aprovechar la alta biocompatibilidad de las nanopartículas de magnetita. El recubrimiento con sílice mejora la dispersión y protege el núcleo magnético de la degradación en medios acuosos.

Y también dar una superficie reactiva para funcionalizar con grupos de aminas que son necesarios para unir covalentemente un ácido modificado sideróforo por la química de carbodiamida. En este caso, N-succynilferoxamine. La capacidad de captura de bacterias conjugadas fue probada y como resultado, se encontró un bajo número de colonias, sin diferencia significativa con los intermedios debido a una interacción específica sobre los efectos voluminosos presentados en la suspensión bacteriana PBS.