Name: Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a derivar neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas en condiciones de cultivo sin alimentador. Este protocolo eficiente genera neuronas eléctricamente activas en 20 días para estudiar trastornos autonómicos.

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Nos gustaría dar las gracias a Heidi Ulrichs por la lectura crítica y la edición del manuscrito.

<ol><li>Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+dysautonomia%3A+History%2C+genotype%2C+phenotype+and+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research.</a> Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).</li>
<li>Stone, J. B., DeAngelis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-treatment-induced+neurotoxicity--focus+on+newer+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).</li>
<li>Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+denervation+predicts+PD+in+at-risk+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals.</a> Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).</li>
<li>Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+renal+sympathetic+denervation%3A+2013+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond.</a> Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).</li>
<li>Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Anatomy%2C+Physiology%2C+and+Pharmacology+of+the+Autonomic+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System.</a> Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLe+Douarin%2C+NM+%22The+Neural+Crest%22">The Neural Crest</a>. , Cambridge University Press. (1999).</li>
<li>Simões-Costa, M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+neural+crest+development+and+evolution+from+genomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis.</a> Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).</li>
<li>Labosky, P. A., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winged+helix+transcription+factor+Hfh2+is+expressed+in+neural+crest+and+spinal+cord+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development.</a> Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).</li>
<li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).</li>
<li>Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zic1+Promotes+the+Expansion+of+Dorsal+Neural+Progenitors+in+Spinal+Cord+by+Inhibiting+Neuronal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation.</a> Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).</li>
<li>Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP%2C+Wnt+and+FGF+signals+are+integrated+through+evolutionarily+conserved+enhancers+to+achieve+robust+expression+of+Pax3+and+Zic+genes+at+the+zebrafish+neural+plate+border%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border.</a> Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).</li>
<li>Kam, M. K., Lui, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hoxb5+in+the+development+of+vagal+and+trunk+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth%2C+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells.</a> Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).</li>
<li>Guillemot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+achaete-scute+homolog+1+is+required+for+the+early+development+of+olfactory+and+autonomic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons.</a> Cell. 75 (3), 463-476 (1993).</li>
<li>Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeobox+gene+Phox2b+is+essential+for+the+development+of+autonomic+neural+crest+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives.</a> Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).</li>
<li>Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insm1+%28IA-1%29+is+a+crucial+component+of+the+transcriptional+network+that+controls+differentiation+of+the+sympatho-adrenal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage.</a> Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).</li>
<li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrainor%2C+P+%22Neural+Crest+Cells%3A+Evolution%2C+Development+and+Disease%22">Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Howard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+perspectives+on+differentiation+of+autonomic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons.</a> Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).</li>
<li>Zeltner, N., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+disease+modeling%3A+current+hurdles+and+future+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise.</a> Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).</li>
<li>Oh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Coupling+with+Cardiac+Muscle+Promotes+Maturation+of+hPSC-Derived+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).</li>
<li>Frith, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+axial+progenitors+generate+trunk+neural+crest+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+sympathetic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells+with+a+defined+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).</li>
<li>Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+Methods+to+Differentiate+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).</li>
<li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).</li>
<li>Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomic+Neurons+with+Sympathetic+Character+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Tchieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Platform+for+Differentiation+of+Human+PSCs+into+All+Major+Ectodermal+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages.</a> Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).</li>
<li>Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+systems+in+stress%3A+structural+and+molecular+genetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Review%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches.</a> Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).</li>
<li>Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Trunk+Neural+Crest+and+Sympathetic+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Via+a+Neuromesodermal+Axial+Progenitor+Intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate.</a> Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).</li>
<li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling%2C+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Autonomic+Research%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li>
<li>Clements, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+multiwell+MEA+plates+for+neural+and+cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Neurophotonics%3B+Neural+Imaging+and+Sensing%3B+and+Optogenetics+and+Optical+Manipulation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications.</a> Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Recientemente publicamos dos reseñas, una discutiendo el uso de sínmNs derivados de hPSC para el modelado de enfermedades31, así como una comparación en profundidad de los protocolos de diferenciación disponibles22. Por lo tanto, aquí nos centramos en la solución de problemas del protocolo actual para ayudar al investigador interesado a tener éxito en la fabricación de symNs. Durante todo el proceso de diferenciación, con el fin de obtener datos consistentes, así como célul...

Las neuronas simpáticas postgangliónicas (simron) pertenecen al sistema nervioso autónomo (ANS) y tienen múltiples papeles importantes en la respuesta y regulación de la homeostasis del cuerpo independiente de la conciencia. Por ejemplo, el estrés estimula las sin, y evoca la respuesta de lucha o vuelo que conduce a un aumento de la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la sudoración. Los SymN se ven afectados en múltiples trastornos humanos debido a la genética, toxicidad/lesión, o como compañeros de otras enfermedades. Un ejemplo de neuropatía genética es el trastorno infantil Disautonomia Familiar (FD), donde una severa desregulación de las simadoras causa crisis disautonómica, evidente por sudoración, manchadeo de la piel, ataques de vómitos, hipertensión y ansiedad1. Un ejemplo de toxicidad es el tratamiento de quimioterapia, que se ha divulgado para tener efectos secundarios tóxicos en las neuronas autonómicas2. Se sabe que la denervación autonómica y la hiperinnervación pueden conducir o acompañar a enfermedades como la enfermedad de Parkinson o la enfermedad renal hipertensiva3,4. Por lo tanto, ser capaz de llevar a cabo investigaciones y comprender los mecanismos de la biología sinmN y defectos en el contexto de la enfermedad es beneficioso para la búsqueda de tratamientos novedosos y eficaces.
Anatomía El sistema nervioso periférico se ramifica en divisiones sensoriales y autonómicas. Los nervios aferentes del sistema nervioso sensorial son responsables de la sensación de dolor y tacto, mientras que el ANS es responsable de transmitir información de todos los órganos al cerebro. El ANS se divide en el sistema nervioso entérico, inervando el tracto gastrointestinal, el sistema nervioso parasimpático, que es importante para la relajación, y el sistema nervioso simpático (SNS), que es importante para la activación / regulación de los órganos. El SNS adapta un sistema de dos neuronas5. Los axones neurales simpáticos pregangliónicos en la médula espinal primero se proyectan a los ganglios simpáticos, donde se encuentran los cuerpos celulares simios posganglónicos. Estas neuronas entonces envían proyecciones largas para inervate los tejidos diana de cada órgano en el cuerpo. Las señales transmitidas por las neuronas pregangliónicas son colinérgicas, mientras que los símN postgangliónicos son adrenérgicos y por lo tanto expresan norepinefrina (NE) como su principal neurotransmisor. Hay pocas excepciones notables de las neuronas simpáticas postgangliónicas que son colinérgicas, incluyendo las que inervan los vasos sanguíneos. Las neuronas postgangliónicas adrenérenérgicas expresan las enzimas tirosina hidroxilasa (TH), la aromática L-aminoácido decarboxilasa (AAAD), la dopamina-hidroxilasa (DBH) y la monoaminooxidasa (MAO-A), todas responsables de generar y metabolizar NE. Además, expresan los transportadores de reciclaje NE y/o los receptores de receptores adrenérgicos (ADRA2), el receptor adrenérgico (ADR2B), el transportador de noradrenalina (NET1) y el transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).
Desarrollo Durante el desarrollo embrionario, los sinmos se derivan de la cresta neural (NC), que emerge entre el tubo neural y la superposición de ectodermos6,y pueden diferenciarse en múltiples linajes celulares, incluyendo melanocitos, osteoblastos, adipocitos, glia, neuronas entéricas, neuronas sensoriales y neuronas autonómicas7. Las células de la cresta neural (NCC) son células altamente migratorias que toman varias rutas a través del embrión. En esta etapa temprana del desarrollo de NC, las células expresan los marcadores SNAIL1/2, FOXD3 y SOX108,,9,10,11. La ruta de migración junto con la ubicación axial que adoptan determina el subtipo NC en el que se desarrollarán. Estos subtipos NC se pueden distinguir por su expresión génica HOX específica: los NCC craneales no expresan genes HOX, los NCC vagales expresan HOX 1–5, los NCC troncales expresan HOX 6–9 y los NCC sacros expresan HOX 10–1112. Entre ellos, los NCC troncales se reconocen como la fuente principal de symNs. Los precursores de SymN expresan el factor de transcripción MASH1/ASCL113, que promueve la expresión de PHOX2B14 e INSM115. La familia GATA de factores de transcripción se expresa durante el desarrollo simpático tardío. GATA2 y GATA3 se expresan en los sinmN, que a su vez activa DBH16. El factor de transcripción HAND2 también es importante para la expresión y el mantenimiento de DBH y TH17.
Los HpSC (por ejemplo, células madre embrionarias e pluripotentes inducidas) son una poderosa herramienta18 para recapitular paradigmas de desarrollo y generar sinmN que luego se pueden emplear para el modelado de enfermedades de diversos trastornos humanos. Por lo tanto, al generar sinmos a partir de hPSCs, es crucial seguir las pautas de desarrollo y evaluar la expresión de marcadores apropiados a lo largo del proceso de diferenciación.
Protocolo SymN anterior Pocos grupos de investigación han informado previamente de la generación de sinmN sde hPSCs19,20,21. La comparación directa de estos protocolos entre sí y el nuestro fue revisada recientemente22. En 201623,publicamos un protocolo de diferenciación para la generación de neuronas autonómicas con carácter symN(Figura 1A). Este protocolo utilizaba un medio basado en KSR, que se utilizaba tanto en el mantenimiento de hPSC indiferenciados como en la diferenciación celular. Además, se mantuvieron los hPSC en fibroblastos embrionarios de ratón (células alimentadoras de MEF). Empleamos este protocolo y PSCs de pacientes con FD para modelar el trastorno23. En 2019, describimos una versión más detallada de este protocolo anterior24. En resumen, el destino neural fue inducido por la inhibición SMAD dual25 para bloquear la señalización de TGF y BMP en los primeros 2 días. La activación de WNT mediante CHIR99021 promovió progenitores neuronales para convertirse en células NC. En el día 11, las células fueron ordenadas por FACS para CD49D+ o SOX10+ poblaciones26,23, que produjo aproximadamente 40% de eficiencia de generación NC. Por lo tanto, la clasificación era necesaria para garantizar la eficiencia y pureza para los próximos pasos de diferenciación. Los NCC se mantuvieron y se amplificaron como esferoides con el tratamiento combinado de FGF2 y CHIR. Después de 4 días, los esferoides NC de mantenimiento fueron chapados y recibieron BDNF, GDNF y NGF para terminar la maduración de la simN. Aunque estos sinmN expresaron marcadores sinmN fuertes como ASCL1, TH, DBH y PHOX2A, los marcadores para sinmNs más maduros, incluida la expresión del receptor de acetilcolina nicotínico (CHRNA3/CHRNB4) y el transportador de vesículas (VMAT1-2), eran bajos incluso después de 70 días de diferenciación. Los genes HOX en este protocolo no fueron probados formalmente, y las propiedades neuronales maduras, incluyendo la actividad electrofisiológica de las células, no fueron verificadas.
Aquí, presentamos un protocolo optimizado para generar symNs(Figura 1B). Los HPSC se mantienen en condiciones libres de alimentación, en platos recubiertos con vitronectina (VTN), utilizando los medios Essential 8 (E8)27. La fórmula de los medios de diferenciación se ha modificado en cada etapa, aumentando así el porcentaje de la población NC28. La maduración de la sinmN se puede hacer en CD49D+/SOX10+ poblaciones de NCC a granel ordenadas o no ordenadas. Ambos muestran altos niveles de expresión de marcador symN para el día 30. Además, los sinmN generados con este protocolo responden a la grabación electrofisiológica y a los tratamientos con activador de SIMn y compuestos inhibidores.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultivo celular de 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>tubos de cultivo de tejidos cónicos de 15 ml</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos Falcon</td><td></td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fijación ultrabaja de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>07 200 601 y 07 200 602</td><td></td></tr><tr><td>5% CO2/20% O2 incubadora de cultivo de tejidos</td><td>Thermo Fisher/Life Tecnologías</td><td>Heracell VIOS 160i</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de tejidos cónicos de 50 ml</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovación Cell Technologies</td><td>AT104500</td><td>Solución de disociación celular</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-AP2a Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab108311</td><td>Huésped: Conejo; dilución</td></tr> <tr><td>1:400Anticuerpo anti-Ascl1</td><td>BD Pharmingen</td><td>556604</td><td>Huésped: IgG1 de ratón; Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD49D</td><td>BioLegend</td><td>304313</td><td>Huésped: IgG1 de ratón; 5 &mu; l/millón de células en 100 &mu; l volumen</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD49D (isotipo)</td><td>BioLegend</td><td>400125</td><td>Huésped: IgG1 de ratón; 5 &mu; l/millón de células en 100 &mu; l volumen</td></tr><tr><td>Colorante DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-DBH</td><td>Immunostar</td><td>22806</td><td>Huésped: Conejo; Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>Huésped: Pollo; Dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-HOXC9</td><td>Abcam</td><td>ab50839</td><td>Huésped: Ratón; dilución 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-NET1</td><td>Mab</td><td>NET17-1</td><td>Huésped: Ratón; dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PRPH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-377093/H0112</td><td>Huésped: Ratón IgG2a; dilución 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-SOX10</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365692</td><td>Huésped: Ratón IgG1; dilución 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-TH</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101- 150</td><td>Huésped: Conejo; dilución 1:500</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td>Concentración de existencias: 100 mM</td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>12587-010 Concentración de</td><td>existencias: 50x</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R& D Systems</td><td>248-BD</td><td>Concentración de existencias: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td>Concentración de existencias: 6 mM</td></tr><tr><td>Contador de celdas</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>Countess II</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de la cámara de recuento de celdas</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>57021& 5424R</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R& D Systems</td><td>4423</td><td>Concentración de existencias: 6 mM</td></tr><tr><td>Cryo-vial</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>dbcAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Concentración de existencias: 100 mM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>10829-018 Concentración de</td><td>existencias: 1x</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>11330-057 Concentración de</td><td>existencias: 1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>E6</td><td>gibco</td> medio <td>A15165-01</td><td></td></tr><tr><td>E8</td><td>gibco</td> medio <td>A15169-01</td><td>Concentración de stock: 1x</td></tr><tr><td>E8 suplemento</td><td>gibco</td><td>A15171-01</td><td>Concentración de stock: 50x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td>Concentración de stock: 0,5 M</td></tr><tr><td>Placas de electrofisiología (AXION cytoview MEA96)</td>Máquina FACS <td>Axion BioSystems</td><td>M768-tMEA-96W</td><td></td></tr><tr><td>Beckman</td><td>Coulter</td><td>CytoFLEX (para FACS)</td><td></td></tr><tr><td>Máquina FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios EQ (para clasificación)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS (tapón de filtro azul)</td><td>Tubos Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS (tapón blanco)</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450</td><td>Concentración de stock: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td>Matriz de membrana basal; Concentración de existencias: 100x</td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Thomson et al., (1998)</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Oh et al. (2016)</td><td>H9-PHOX2B::eGFP</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina humana (FN)</td><td>VWR/Corning</td><td>47743-654 Concentración de</td><td>existencias: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo Fisher/Gibco</td><td>25030-081 Concentración de</td><td>existencias: 200 mM</td></tr><tr><td>Tanque de LN</td><td>Sistemas Biogénicos Personalizados</td><td>V-1500AB</td><td></td></tr><tr><td>Lector MEA</td><td>Axion BioSystems</td><td>Maestro Pro</td><td></td></tr><tr><td>Mouse laminin I (LM)</td><td>R& D Systems</td><td>3400-010-01 Concentración de</td><td>existencias: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>suplemento de N2</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>17502-048 Concentración de</td><td>existencias: 100x</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>gibco</td><td>21103-049 Concentración de</td><td>existencias: 1x</td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>450-01 Concentración de</td><td>existencias: 25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>Concentración de existencias: 1x</td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-ornitina (PO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>Concentración de existencias: 15 mg/mL</td></tr><tr><td>Primocina (antibióticos)</td><td>InvivoGen</td><td>ANTPM1</td><td>Concentración de existencias: 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Máquina de qPCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch</td><td></td></tr><tr><td>Placas de qPCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB/CF Concentración de</td><td>existencias: 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Concentración de stock: 1 mM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris/R& D Systems</td><td>1614</td><td>Concentración de existencias: 10 mM</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Corning</td><td>MT-25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina (VTN)</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>A14700</td><td>Concentración de existencias: 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>VWR/Corning</td><td>706308</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 R</td><td>& D Systems</td><td>1254</td><td>Concentración de existencias: 10 mM</td></tr></tbody></table>

diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) se han convertido en una poderosa herramienta para el modelado de enfermedades y el estudio del desarrollo embrionario humano in vitro. Anteriormente presentamos un protocolo de diferenciación para la derivación de neuronas autonómicas con carácter simpático que se ha aplicado a pacientes con neuropatía autonómica. Sin embargo, el protocolo se construyó sobre el reemplazo de suero Knock Out (KSR) y las condiciones de cultivo basadas en el alimentador, y para garantizar una alta eficiencia de diferenciación, la clasificación celular era necesaria. Estos factores causan alta variabilidad, alto costo y baja reproducibilidad. Además, no se han verificado las propiedades simpáticas maduras, incluida la actividad eléctrica. Aquí, presentamos un protocolo optimizado donde el cultivo y la diferenciación de PSC se realizan en condiciones de cultivo libres de alimentación y definidas químicamente. Se identifican marcadores genéticos que identifican la cresta neural del tronco. Una mayor diferenciación en las neuronas simpáticas postgangliónicas se logra después de 20 días sin la necesidad de clasificación celular. El registro electrofisiológico muestra aún más la identidad funcional de la neurona. El disparo detectado por nuestras neuronas diferenciadas puede ser mejorado por la nicotina y suprimido por el antagonista del receptor adrenérgico propranolol. Los progenitores neuronales simpáticos intermedios en este protocolo se pueden mantener como esferoides neuronales durante un máximo de 2 semanas, lo que permite la expansión de los cultivos. En resumen, nuestro protocolo actualizado de diferenciación de neuronas simpáticas muestra una alta eficiencia de diferenciación, mejor reproducibilidad, más flexibilidad y mejor maduración neuronal en comparación con la versión anterior. Este protocolo proporcionará a los investigadores las células necesarias para estudiar los trastornos humanos que afectan al sistema nervioso autónomo.

En este protocolo, damos instrucciones sobre cómo generar symNs a partir de hPSCs. Las condiciones de cultivo que se han demostrado aquí se mejoraron de un protocolo publicado anteriormente23,24 (Figura 1A) a condiciones libres de alimentación y definidas químicamente(Figura 1B). Se proporcionan dos opciones, una en la que se realizan symN en un plazo de 20 días y otra en la que los CNC se pueden ampliar...

En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

Este protocolo permite la derivación de neuronas simpáticas a partir de células madre pluripotentes humanas. Estas células permitirán a un científico estudiar trastornos humanos que afectan el sistema nervioso simpático. Esta técnica permite la derivación de neuronas simpáticas en condiciones de reunión sin alimentador divididas con una alta eficiencia escalable.Resulta en neuronas eléctricamente activas en 20 días. Esta técnica se puede aplicar a enfermedades causadas por un sistema nervioso simpático disfuncional, también se puede utilizar para el modelado de enfermedades, medicina regenerativa, y la detección de drogas. Estas células podrían utilizarse in vitro para innovar cualquier tejido dentro de un sistema de co-cultivo, por ejemplo, para el estudio de la regulación del tejido cardíaco.Cuando el cultivo de células madre pluripotentes humanas alcanza entre el 80 y el 90% de confluencia, se deben observar grandes colonias con bordes brillantes lisos. Para la división, lave el cultivo con PBS antes de tratar las células con cuatro mililitros de EDTA molar a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Después de dos minutos, enjuague la placa con 10 mililitros de medio E8 y transfiera la suspensión de la célula separada a un tubo cónico de 15 mililitros.Luego transfiera 500 microlitros de células a una alícuota de 9,5 mililitros de medio E8 fresco. Y placar las células madre en nueva vitronectina recubierta de 100 milímetros platos. Un día antes de la inducción de diferenciación, recubrir el número adecuado de seis placas de pozo con dos mililitros de matriz de membrana sótano por pozo.Y guarde los platos a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, calienta los platos a temperatura ambiente y lava el cultivo de células madre pluripotentes humanas listas para dividir dos veces con PBS fresco por lavado. Después del segundo lavado, tratar las células con siete mililitros de 0,5 mililitros de EDTA durante 15 minutos en la incubadora de cultivo celular antes de aspirar las células madre pluripotentes humanas flotantes y transferir las células cosechadas a un tubo de 50 mililitros.Añadir un volumen igual de PBS al tubo para diluir el EDTA y recoger las células por centrifugación. Resuspender el pellet en un mililitro del medio de diferenciación del día 01 antes de añadir un volumen adecuado de medio para la contabilidad. Diluir las células a un 1,25 veces 10 a las quintas células por centímetro cuadrado de concentración en mililitros de medio de diferenciación por pozo.Aspirar toda la solución de matriz de membrana del sótano de cada pozo del pozo previamente preparado a seis placas de pozo. Luego siembra dos mililitros de células en cada pozo y coloca la placa en la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, alimentar las células con tres mililitros del día 01 medio de diferenciación por pozo.En el segundo día de diferenciación, alimentar las células con tres mililitros del día dos a 10 medio de diferenciación por pozo, luego alimentar las células cada dos días hasta el día 10. Para agregar las células de la cresta neural en esferoides, el día 10, lave las células con PBS. Y añadir dos mililitros de medio de disociación a cada pozo.Después de 20 minutos en la incubadora de cultivo celular, transfiera las células flotantes a un tubo cónico de 50 mililitros y lleve el volumen de suspensión en el tubo a 50 mililitros con PBS fresco. Recoger las células por centrifugación. Y resuspender el pellet en un volumen suficiente del día 10 a 14 medio esferoide para el conteo.Después de contar, diluir las células a cinco veces 10 a la quinta célula por 500 microlitros de concentración usando el medio esferoide del día 10 a 14. Y placa 500 microlitros de células en cada pozo de una placa de 24 pozos de fijación ultra baja. A continuación, devuelva las células a la incubadora de cultivo celular.Para inducir un cultivo esferoide mínimo, en el día 11 del cultivo, alimentar los esferoides de cresta neural con 500 microlitros adicionales del día 10 a 14 medios esferoides por pozo. En el día 12, incline la placa para acumular los esferoides en un lado de la placa. Y aspirar cuidadosamente tanto medio como sea posible de cada pozo sin aspirar esferoides.A continuación, alimentar los esferoides con un mililitro del día 10 a 14 medio esferoide por pozo. Para inducir un cultivo de esferoide expandido, en el día 15, alimentar los esferoides con 1,5 mililitros del día 10 a 14 medio esferoide complementado con 0,5 ácido retinoico micromolar por pozo. A continuación, devuelva los esferoides a la incubadora de cultivo celular.Para la diferenciación de neuronas simpáticas, en el día 14 o 28, incline la placa para acumular los esferoides en un lado de la placa y aspirar cuidadosamente tanto medio como sea posible. Alimentar las células con un mililitro de medio de neurona simpática. Para dividir los agregados esferoides grandes en esferoides más pequeños, agregue no más de un mililitro de medio por pozo y pipetee los esferoides de cinco a 10 veces antes de dividirse.Y retire el exceso de fibronectina laminin de las placas de 24 pozos previamente preparadas. Divida la placa un mililitro de esferoides de cada pozo en la placa de cultivo de esferoides de 24 pozos entre cuatro pozos separados de la nueva placa recubierta de 24 pozos. Añadir 250 microlitros de nuevo medio de neurona simpática a cada pozo.Y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, reemplace el medio de cada pozo por un mililitro de neuron medio simpático complementado con 0,125 micromolares de ácido retinoico y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Después del día 35, alimentar a las neuronas reemplazando cuidadosamente sólo la mitad del medio existente en cada pozo con medio fresco.Antes de la diferenciación, las colonias de células madre pluripotentes humanas deben ser redondas con bordes brillantes y lisos y poca o ninguna diferenciación. Las células expresan el marcador de cresta neural Sox10 de los días cuatro a 10. Las células de la cresta neural emergen en crestas oscuras densas que son visibles desde el sexto día.Estas crestas también expresan Los Sox10. En la etapa de las células de la cresta neural, Sox10 se correlaciona con el marcador de superficie celular CD49D, que se puede utilizar para ordenar las células de la cresta neural. Las poblaciones positivas ordenadas y no ordenadas produjeron esferoides de cresta neural de una manera similar.Mientras que las células ordenadas negativas no se agregan correctamente, no producen esferoides redondos y de aspecto saludable y mueren dentro de tres a cuatro días. Además, cuando se comparan los esferoides de la cresta neural en el día 14, no se pueden detectar la PCR cuantitativa de la transcriptasa inversa para la cresta neural y los marcadores de progenitor nervioso simpático, no se pueden detectar diferencias significativas entre las células ordenadas y no ordenadas. En el día 20 o 35, los protocolos mínimos o extendidos respectivos, los neuroides se pueden observar creciendo en un patrón radial de los esferoides unidos.Marcadores relacionados con la síntesis de norepinefrina y el transporte se expresan en esta etapa, así como Hox6 a través de nueve genes de cresta neural del tronco. El registro electrofisiológico también detecta la actividad neuronal a partir del día 20. Tal actividad puede ser mejorada o suprimida por fármacos que apuntan a los autorreceptores de las neuronas simpáticas ajustando la funcionalidad de las neuronas diferenciadas.El propio defensor humano debe estar sano a partir del día cero de diferenciación, de lo contrario, el experimento probablemente fallará. Se pueden añadir inhibidores farmacológicos o activadores a las neuronas para comprender su comportamiento normal o patológico. Este método abre una nueva vía para estudiar la biología y la patología simpáticas, ya que ahora es posible obtener biopsias de neuronas simpáticas de los seres humanos fácilmente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Protocolos para la diferenciación neuronal de las células madre humanas pluripotentes (hPSCs) son a menudo mucho tiempo y requieren considerables conocimientos de cultivo de células. Aquí, hemos adaptado una molécula pequeña de un procedimiento basado en una diferenciación a un formato de placa de multititre, que permite la generación sencilla, rápida, y eficiente de las neuronas humanas de una manera controlada.

Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Este video muestra un método in vitro para generar neuronas simpáticas postganglionares a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Las hPSCs se diferencian en células de cresta neural (NCCs) en un soporte de matriz de membrana basal utilizando un medio de diferenciación. A continuación, las NCC se disocian y se forman en esferoides utilizando otro medio de diferenciación. Finalmente, los esferoides se transforman en neuronas simpáticas postganglionares utilizando un medio de...

Generación de neuronas simpáticas postganglionares a partir de células madre pluripotentes humanas

Este video muestra la generación de células progenitoras neurales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) transgénicas y no transgénicas. Las hPSCs se diferencian en células progenitoras neurales utilizando un medio de diferenciación neuronal. Mientras que en las células no transgénicas se induce la diferenciación utilizando moléculas pequeñas, las hPSC transgénicas se diferencian mediante la adición de un antibiótico que induce el promotor de un factor de transcripción...

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas transgénicas y no transgénicas en células progenitoras neurales

Este video muestra el proceso de diferenciación de las iPSCs humanas en neuronas motoras. La justificación implica la utilización de iPSC que han sido modificadas genéticamente para expresar factores de transcripción específicos. Cuando se cultiva en un medio que contiene doxiciclina, este antibiótico desencadena la expresión de factores de transcripción, promoviendo así la diferenciación de iPSC en progenitores de neuronas motoras. En última instancia, los progenitores se cultivan en un medio...

Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en neuronas motoras funcionales

Nosotros, basándonos en el conocimiento de la biología del desarrollo y la investigación publicada, desarrollamos un protocolo optimizado para generar de manera eficiente neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo A9 a partir de células madre embrionarias humanas y células madre pluripotentes inducidas humanas, que serían útiles para el modelado de enfermedades y la terapia de reemplazo celular para la enfermedad de Parkinson.

Dirigida dopaminérgica Neurona La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas

Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Este protocolo describe un procedimiento detallado para recuperar y cultivar neuronas derivadas de células madre humanas que previamente se diferenciaron de los progenitores neuronales in vitro durante varias semanas. El procedimiento facilita ensayos basados en imágenes de neurótesis, sinapsis y marcadores neuronales de expresión tardía en un formato compatible con microscopía ligera y cribado de alto contenido.

Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis

Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.

Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región

La derivación de linajes del sistema nervioso entérico (SNE) a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) proporciona una fuente escalable de células para estudiar el desarrollo y la enfermedad del SNE, y para su uso en medicina regenerativa. Aquí, se presenta un protocolo detallado in vitro para derivar neuronas entéricas a partir de hPSCs utilizando condiciones de cultivo químicamente definidas.

Diferenciación de linajes del sistema nervioso entérico a partir de células madre pluripotentes humanas

Aprende a derivar neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas en condiciones de cultivo sin alimentador. Este protocolo eficiente genera neuronas eléctricamente activas en 20 días para estudiar trastornos autonómicos.

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente (Video) | JoVE Journal

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

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