Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

Este protocolo permite la derivación de neuronas simpáticas a partir de células madre pluripotentes humanas. Estas células permitirán a un científico estudiar trastornos humanos que afectan el sistema nervioso simpático. Esta técnica permite la derivación de neuronas simpáticas en condiciones de reunión sin alimentador divididas con una alta eficiencia escalable.

Resulta en neuronas eléctricamente activas en 20 días. Esta técnica se puede aplicar a enfermedades causadas por un sistema nervioso simpático disfuncional, también se puede utilizar para el modelado de enfermedades, medicina regenerativa, y la detección de drogas. Estas células podrían utilizarse in vitro para innovar cualquier tejido dentro de un sistema de co-cultivo, por ejemplo, para el estudio de la regulación del tejido cardíaco.

Cuando el cultivo de células madre pluripotentes humanas alcanza entre el 80 y el 90% de confluencia, se deben observar grandes colonias con bordes brillantes lisos. Para la división, lave el cultivo con PBS antes de tratar las células con cuatro mililitros de EDTA molar a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Después de dos minutos, enjuague la placa con 10 mililitros de medio E8 y transfiera la suspensión de la célula separada a un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego transfiera 500 microlitros de células a una alícuota de 9,5 mililitros de medio E8 fresco. Y placar las células madre en nueva vitronectina recubierta de 100 milímetros platos. Un día antes de la inducción de diferenciación, recubrir el número adecuado de seis placas de pozo con dos mililitros de matriz de membrana sótano por pozo.

Y guarde los platos a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, calienta los platos a temperatura ambiente y lava el cultivo de células madre pluripotentes humanas listas para dividir dos veces con PBS fresco por lavado. Después del segundo lavado, tratar las células con siete mililitros de 0,5 mililitros de EDTA durante 15 minutos en la incubadora de cultivo celular antes de aspirar las células madre pluripotentes humanas flotantes y transferir las células cosechadas a un tubo de 50 mililitros.

Añadir un volumen igual de PBS al tubo para diluir el EDTA y recoger las células por centrifugación. Resuspender el pellet en un mililitro del medio de diferenciación del día 01 antes de añadir un volumen adecuado de medio para la contabilidad. Diluir las células a un 1,25 veces 10 a las quintas células por centímetro cuadrado de concentración en mililitros de medio de diferenciación por pozo.

Aspirar toda la solución de matriz de membrana del sótano de cada pozo del pozo previamente preparado a seis placas de pozo. Luego siembra dos mililitros de células en cada pozo y coloca la placa en la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, alimentar las células con tres mililitros del día 01 medio de diferenciación por pozo.

En el segundo día de diferenciación, alimentar las células con tres mililitros del día dos a 10 medio de diferenciación por pozo, luego alimentar las células cada dos días hasta el día 10. Para agregar las células de la cresta neural en esferoides, el día 10, lave las células con PBS. Y añadir dos mililitros de medio de disociación a cada pozo.

Después de 20 minutos en la incubadora de cultivo celular, transfiera las células flotantes a un tubo cónico de 50 mililitros y lleve el volumen de suspensión en el tubo a 50 mililitros con PBS fresco. Recoger las células por centrifugación. Y resuspender el pellet en un volumen suficiente del día 10 a 14 medio esferoide para el conteo.

Después de contar, diluir las células a cinco veces 10 a la quinta célula por 500 microlitros de concentración usando el medio esferoide del día 10 a 14. Y placa 500 microlitros de células en cada pozo de una placa de 24 pozos de fijación ultra baja. A continuación, devuelva las células a la incubadora de cultivo celular.

Para inducir un cultivo esferoide mínimo, en el día 11 del cultivo, alimentar los esferoides de cresta neural con 500 microlitros adicionales del día 10 a 14 medios esferoides por pozo. En el día 12, incline la placa para acumular los esferoides en un lado de la placa. Y aspirar cuidadosamente tanto medio como sea posible de cada pozo sin aspirar esferoides.

A continuación, alimentar los esferoides con un mililitro del día 10 a 14 medio esferoide por pozo. Para inducir un cultivo de esferoide expandido, en el día 15, alimentar los esferoides con 1,5 mililitros del día 10 a 14 medio esferoide complementado con 0,5 ácido retinoico micromolar por pozo. A continuación, devuelva los esferoides a la incubadora de cultivo celular.

Para la diferenciación de neuronas simpáticas, en el día 14 o 28, incline la placa para acumular los esferoides en un lado de la placa y aspirar cuidadosamente tanto medio como sea posible. Alimentar las células con un mililitro de medio de neurona simpática. Para dividir los agregados esferoides grandes en esferoides más pequeños, agregue no más de un mililitro de medio por pozo y pipetee los esferoides de cinco a 10 veces antes de dividirse.

Y retire el exceso de fibronectina laminin de las placas de 24 pozos previamente preparadas. Divida la placa un mililitro de esferoides de cada pozo en la placa de cultivo de esferoides de 24 pozos entre cuatro pozos separados de la nueva placa recubierta de 24 pozos. Añadir 250 microlitros de nuevo medio de neurona simpática a cada pozo.

Y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, reemplace el medio de cada pozo por un mililitro de neuron medio simpático complementado con 0,125 micromolares de ácido retinoico y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Después del día 35, alimentar a las neuronas reemplazando cuidadosamente sólo la mitad del medio existente en cada pozo con medio fresco.

Antes de la diferenciación, las colonias de células madre pluripotentes humanas deben ser redondas con bordes brillantes y lisos y poca o ninguna diferenciación. Las células expresan el marcador de cresta neural Sox10 de los días cuatro a 10. Las células de la cresta neural emergen en crestas oscuras densas que son visibles desde el sexto día.

Estas crestas también expresan Los Sox10. En la etapa de las células de la cresta neural, Sox10 se correlaciona con el marcador de superficie celular CD49D, que se puede utilizar para ordenar las células de la cresta neural. Las poblaciones positivas ordenadas y no ordenadas produjeron esferoides de cresta neural de una manera similar.

Mientras que las células ordenadas negativas no se agregan correctamente, no producen esferoides redondos y de aspecto saludable y mueren dentro de tres a cuatro días. Además, cuando se comparan los esferoides de la cresta neural en el día 14, no se pueden detectar la PCR cuantitativa de la transcriptasa inversa para la cresta neural y los marcadores de progenitor nervioso simpático, no se pueden detectar diferencias significativas entre las células ordenadas y no ordenadas. En el día 20 o 35, los protocolos mínimos o extendidos respectivos, los neuroides se pueden observar creciendo en un patrón radial de los esferoides unidos.

Marcadores relacionados con la síntesis de norepinefrina y el transporte se expresan en esta etapa, así como Hox6 a través de nueve genes de cresta neural del tronco. El registro electrofisiológico también detecta la actividad neuronal a partir del día 20. Tal actividad puede ser mejorada o suprimida por fármacos que apuntan a los autorreceptores de las neuronas simpáticas ajustando la funcionalidad de las neuronas diferenciadas.

El propio defensor humano debe estar sano a partir del día cero de diferenciación, de lo contrario, el experimento probablemente fallará. Se pueden añadir inhibidores farmacológicos o activadores a las neuronas para comprender su comportamiento normal o patológico. Este método abre una nueva vía para estudiar la biología y la patología simpáticas, ya que ahora es posible obtener biopsias de neuronas simpáticas de los seres humanos fácilmente.