Name: Eliminación de genes sin marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis en Chlamydia trachomatis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a eliminar genes sin marcadores en Chlamydia trachomatis mediante mutagénesis FLAEM. Este método permite deleciones precisas sin efectos polares en genes adyacentes para estudios funcionales.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Servicio de Salud Pública del Instituto Nacional de Salud, NIAID (becas A1065530 y Al124649), a K.A. Fields.

1. Diseño y montaje de pSUmC-4.0 con armas de homología específicas para el gen de interés
<ol><li>Identificar las regiones de 3 kb directamente aguas arriba y aguas abajo del gen destinado a la eliminación para servir como los brazos homtológicos de 5' y 3' para la recombinación homóloga(Figura 1).</li>
	<li>Diseñar imprimaciones PCR a 1) amplificar el brazo homológico de 3 kb 5' a partir del ADN genómico clamímico y 2) contienen un voladizo de 15 a 30 bp específico de pSUmC-4.0 cuando se digiere en el sitio de la enzima restricción Sall. Asegúrese de que las regiones de imprimación superpuestas con pSUmC-4.0 tengan temperaturas de fusión de 55 oC y de que las temperaturas de fusión de la horquilla para toda la imprimación sean <35 oC.</li>
	<li>Diseñar imprimaciones PCR a 1) amplificar el brazo homológico de 3 kb 3' a partir del ADN genómico clamidia y 2) contienen un voladizo de 15 a 30 bp específico de pSUmC-4.0 cuando se digiere en el sitio de la enzima de restricción SbfI. Asegúrese de que las regiones de imprimación superpuestas con pSUmC-4.0 tengan temperaturas de fusión de 55 oC y de que las temperaturas de fusión de la horquilla para toda la imprimación sean <35 oC.</li>
	<li>Diseñar imprimadores de cribado PCR que amplificarán la inserción de cada brazo de homología en el vector pSUmC-4.0 después de una reacción de ensamblaje de ADN16. Diseñe estas imprimaciones para recocido s 500 bp fuera de los sitios de restricción para permitir una fácil visualización de un producto PCR incluso si la inserción no tuvo éxito(Figura 1).</li>
	<li>Amplificar los brazos de homología de 3 kb 5' y 3' del ADN genómico clamídial recién extraído por PCR en una o dos reacciones para producir suficiente fragmento para el ensamblaje posterior del ADN. Siga el protocolo del fabricante de la polimerasa de ADN para una configuración de reacción específica y condiciones de ciclismo.</li>
	<li>Verifique que ambos productos PCR tengan el tamaño correcto y que las reacciones no contengan bandas contaminantes. Ejecutar 5 l de cada reacción de PCR en un gel de agarosa de ADN al 1%.</li>
	<li>Purificar y concentrar los fragmentos de PCR mediante la extracción de fenol/cloroformo y la precipitación de etanol.<ol>
<li>Agrupa todas las reacciones de PCR de 3' en un tubo de 1,5 ml y lleva a un volumen final de 200 l con H2O sin nucleasas. Repita este proceso para las reacciones de PCR de 5'.</li>
		<li>Añadir 200 l de fenol a cada tubo y vórtice durante 30–60 s. Girar cada tubo en una microcentrífuga a >21.000 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Transfiera la capa superior de fase acuosa de cada tubo a un nuevo tubo de 1,5 ml, agregue una décima parte del volumen de acetato de sodio de 3 M a cada tubo y, a continuación, deslice para mezclar.</li>
		<li>Añadir 3 volúmenes de 100% etanol a cada tubo y flick para mezclar. Incubar ambos tubos a -80oC durante 20 min.</li>
		<li>Peletele el ADN girando cada tubo a >21,000 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar el pellet de ADN con 100 ml de etanol al 70 %. Gire cada tubo a >21.000 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Lave el pellet de ADN de nuevo con 100 ml de etanol al 100%. Gire cada tubo a >21.000 durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Deje que el pellet se seque completamente al aire, luego resuspenda suavemente el ADN en 12 sl de H2O sin nucleasas moviendo para mezclar.</li>
	</ol></li>
	<li>Digerir 500 ng del vector pSUmC-4.0 en una reacción de 20 l con 1 unidad de Sall y 1 unidad de SbfI según el protocolo de fabricación. Incubar la reacción durante aproximadamente 3 h o durante la noche para asegurar la digestión completa del vector.</li>
	<li>Purificar y concentrar la columna vertebral digerida por extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol como se describió anteriormente (paso 1.7.1–1.7.9).</li>
	<li>Combine el vector pSUmC-4.0 digerido y los productos de PCR del brazo homtológico de 5' y 3' en una proporción de 0,01 pmol pSUmC-4.0 a 0,09 pmol cada brazo homtológico. Montar los fragmentos en una reacción de ensamblaje de ADN de acuerdo con el protocolo de la fabricación.</li>
	<li>Transformar 50 l de E. coli electrocompetente con 1 l de la reacción de ensamblaje del ADN. Placar la E. coli transformada en placas de agar LB que contengan 100 g/ml de espectromicina esparciendo 150 ml por placa. Incubar las placas a 37oC durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, las colonias de pantalla para la fluorescencia verde y roja utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia. Se esperan un total de 5-30 colonias por placa de agar.</li>
	<li>Escoge de 5 a 10 colonias para inocular 4 ml de caldo LB complementado con espectromicina de 100 g/ml. Incubar cultivos a 37oC durante la noche con agitación a 250 rpm.</li>
	<li>Usando los cultivos nocturnos de E. coli, realice purificación de ADN a pequeña escala. Eluye el ADN con 50 l de H2O libre de nucleasas.</li>
	<li>Confirme la inserción de cada brazo de homología en el vector pSUmC-4.0 utilizando las imprimaciones de cribado PCR (diseñadas en el paso 1.4) para amplificar cada inserción. Si el ensamblaje de ADN es exitoso, se debe observar un producto de PCR de 4 kb en un gel de agarosa de ADN del 1% para las regiones del brazo de 5' y 3'. Un producto PCR de 1 kb indica una falta de inserción. NOTA: Si la inserción de los brazos de homología no tiene éxito en una reacción de ensamblaje de doble fragmento, realice dos reacciones de montaje para insertar el brazo de 5' y luego 3' brazo, individualmente. Digerir el vector con sólo Sall antes de ensamblar con el brazo de 5', luego digerir el vector con SbfI para ensamblar el brazo de 3'.</li>
	<li>Transformar presa-/dcm- competente E. coli con 200 ng de pSUmc-4.0 montado con ambos brazos de homología. Placar las bacterias transformadas en placas de agar LB que contienen 100 g/ml de espectromicina mediante la propagación de 25 ml por placa. Incubar las placas a 37oC durante la noche. Se esperan un total de 20-200 colonias.</li>
	<li>Busque las placas en busca de colonias fluorescentes rojas y verdes como se describe en el paso 1.13.</li>
	<li>Establecer un cultivo para una purificación de ADN a gran escala mediante la inoculación de 100 ml de caldo LB que contiene 100 g/ml de espectromicina con colonias rojas y verdes. Incubar el cultivo a 37oC durante la noche con agitación a 250 rpm.</li>
	<li>Cosecha el cultivo y purifica el ADN usando una purificación de ADN a gran escala.<ol>
<li>Resuspenda el ADN plásmido purificado en 100 ml de NF-H2O. Un rendimiento total de ADN de al menos 2 g/l es ideal para la transformación de C. trachomatis.</li>
		<li>Secuenciar las regiones del brazo de homología de 5' y 3' para asegurar el correcto montaje en pSUmC-4.0 antes de transformar C. trachomatis.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transformación de C. trachomatis con pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion by Allelic Exchange
<ol><li>Células McCoy de semilla, fibroblastos de ratón utilizados estándarmente para el cultivo de clamidia,en dos placas de 6 pozos (1 x 106 células/pozo) con medios de crecimiento #1. Incubar las placas a 37oC con un 5% deCO2 hasta que la monocapa sea confluente (aproximadamente 24 h).</li>
	<li>En un tubo de 1,5 ml, agregue un volumen de cuerpos elementales C. trachomatis WT serovar L2 que sea suficiente para infectar 12 pozos de una placa de 6 pocillos en un MOI de 2. Peletar los EBs a >20,000 x g durante 30 min, luego deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Inicie la transformación clamidia mediante la resustitución suave de los EBs en 600 ml de tampón CaCl2, y luego agregue 24 g de pSUmC-4.0 + brazos homtológicos al tubo. Mezcle suavemente la solución moviendo. Incubar el tubo a RTfor 30 min y mover para mezclar cada 10 min.</li>
	<li>Añada la solución de transformación a 24 ml de la solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks y mezcle pipeteando suavemente. Transfiera 2 ml del inóculo a cada pozo de células Confluentes de McCoy en las 6 placas de pozo e infecte por centrifugación a 900 x g durante 1 h a 20 oC.</li>
	<li>Retire el inóculo y sustitúyalo por medios de crecimiento RPMI de 2 ml/bien #2. Incubar las placas a 37oC con 5% co2.</li>
	<li>Después de un mínimo de 7 h, pero no más de 12 h, reemplace el soporte por 2 ml/bien de los medios de selección #1. Continuar la incubación a 37oC durante 48 h desde el momento de la infección.</li>
	<li>Cosecha y pasa las bacterias a una nueva monocapa de células McCoy.<ol>
<li>Usando un rascador de celdas, raspe suavemente la monocapa de McCoy para levantar las células en los medios. Transfiera el material de cada pozo a un tubo de 2 ml. Peletel el material celular a >20.000 x g en una microcentrífuga durante 30 min a 4 oC.</li>
		<li>Retire y deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet celular en 1 ml de HBSS pipeteando suavemente.</li>
		<li>Reventar los restos celulares a 200 x g durante 5 min a 4 oC. Transfiera el sobrenadante a un pozo fresco de células McCoy confluentes. Añadir 1 ml adicional de HBSS a cada pocal para un volumen total de 2 ml/bien.</li>
		<li>Infectar por centrifugación a 900 x g durante 1 h a 20oC. Sustituya el inóculo por un medio de selección #1 inmediatamente después de la infección.</li>
	</ol></li>
	<li>Continúe pasando la bacteria a una nueva monocapa de células McCoy (sección 2.7) cada 48 h durante tres o más pasajes hasta que se detecten inclusiones rojas y verdes utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia 24 h después de la infección (24 hpi).</li>
	<li>Una vez detectadas las inclusiones rojas y verdes, continúe paseando la monocapa (sección 2.7) utilizando medios de selección #2.</li>
	<li>Continuar el paso de la monocapa hasta que se detecten inclusiones sólo verdes 24 hpi (pasaje #3 o posterior), lo que indica la pérdida del vector pSUmC-4.0 y la incorporación del casete de selección loxP en el genoma.</li>
	<li>Elija un pozo de inclusiones solo verdes para enriquecer se enriquece con el passaging. Cosecha y congela cualquier otro pozo que también contenga inclusiones de solo verde en tampón de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG).<ol>
<li>Para enriquecer las inclusiones sólo verdes, pasar la monocapa de un pozo de una placa de 6 pozos como se hace en el paso 2.7, pero después de peletizar los restos celulares (paso 2.7.3), transferir el sobrenadante en un cónico con 12 ml de HBSS. Utilice este inóculo para infectar dos 6 placas de pozo agregando 2 mL por pozo, luego gire las placas a 900 x g durante 60 min a 20 oC.</li>
		<li>Para congelar pozos adicionales, cosechar la monocapa como en el paso 2.7.1, pero resuspender los pellets en 1 mL de AAP en lugar de HBSS. Reventar los restos celulares (paso 2.7.3) y transferir el sobrenadante en un criotubo de 1,5 ml. Congele el material a -80 oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de enriquecer las inclusiones de solo verde a un MOI de 0.5–1.0 (uno a dos pasajes más después de la detección), cosecha las monocapas en SPG como se describe en el paso 2.11.2. Obtener alícuotas de 50 ml en tubos de 1,5 ml y congelar a -80 oC.</li>
	<li>Bacterias de titer green-only para determinar la inclusión, formando unidades / L, de acuerdo con un protocolo de valoración estándar17.</li>
</ol>3. Aislamiento Clonal de C. trachomatis Desovainado binario que contiene el casete de selección flanqueado loxP limitando la dilución
<ol><li>Sembrar una placa de cultivo de tejido de 384 pozos con 50 ol de células McCoy a 2.000 células/bien en media de crecimiento #1. Incubar a 37oC con un 5 % deCO2 durante 24 h o hasta que confluente.</li>
	<li>Diluir una alícuota de bacterias sólo verdes en HBSS para lograr 50 EBs por 20 ml. Transfiera el inóculo diluido a una bandeja de depósito.<ol>
<li>Retire el medio de la placa de pozo 384 moviendo firmemente toda la placa boca abajo en un contenedor de residuos. Con una pipeta multicanal, añada 50 s de C. trachomatis inoculum a cada pocil. Infectar por centrifugación a 900 x g durante 1 h a 20oC. NOTA: Tenga en cuenta no mover tan fuerte que la monocapa se separa. Si las células son sobre-confluentes, se separarán más fácilmente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire el inóculo parpadeando y sustitúyalo por medios de crecimiento de 50 l/pozos #2. Incubar placas a 37oC con 5% co2. NOTA: En esta etapa, la integración del casete de selección en el genoma es estable, por lo que ya no es necesaria la selección de antibióticos con espectinomicina.</li>
	<li>Después de incubar la placa durante 5-12 días, identifique pozos individuales con inclusiones fluorescentes verdes utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia o una plataforma de cribado de alto contenido.</li>
	<li>Cosecha pozos con inclusiones sólo verdes raspando la monocapa con una punta p-10 y transfiriendo todo el contenido del pozo a un tubo que contiene 2 ml de HBSS. Mezcle suavemente y aplique los 2 ml de inóculo a una monocapa McCoy confluente fresca en una placa de 6 pocillos para la infección. NOTA: Al identificar pozos individuales con inclusiones, las inclusiones estarán en un clúster debido a la expansión de la inclusión inicial. Si un pozo tiene varios clústeres, es probable que más de un EB haya infectado inicialmente ese pozo. Estos pozos no deben ser cosechados, y en algunos casos, pueden ser necesarias múltiples rondas de aislamiento clonal por dilución en serie.</li>
	<li>Infectar la placa de 6 pocillos por centrifugación a 900 x g durante 1 h a 20 oC. Sustituya el inóculo por un medio de crecimiento de 2 ml/pozo #2. Incubar a 37oC con 5 %co2 durante 48 h.</li>
	<li>Repita los pasos 2.11–2.13 para enriquecer, congelar y titer poblaciones clonales.</li>
	<li>Confirmar la eliminación de genes dirigidos de C. trachomatis aislados clonalmente utilizando qPCR como se describió anteriormente12.</li>
</ol>4. Transformación de C. trachomatis FRAEM Mutante con pSU-Cre para iniciar la eliminación de loxP Flanked Selection Cassette
<ol><li>Repita el proceso de transformación en una placa de 6 pozos como se describió anteriormente (pasos 2.1–2.8) utilizando el mutante FRAEM aislado clonalmente, vector pSU-Cre y medios de selección #3. NOTA: Una transformación exitosa se indica mediante inclusiones que son fluorescentes rojas y verdes.<ol>
<li>Pasar la monocapa hasta que se detecten inclusiones sólo rojas utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia, que indica la pérdida del casete de selección (dos a tres pasajes). Continúe pase la monocapa hasta que las inclusiones solo rojas se enriquezcan a un MOI de 0,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislar clonalmente inclusiones sólo de color rojo limitando la dilución en una placa de pozo 384 como se describió anteriormente (pasos 3.1–3.8); sin embargo, utilice los medios de selección #3 para todos los pasos.</li>
	<li>Enriquecer las poblaciones clonales mediante el paso hasta un MOI de 0,1. Una vez enriquecidos, sustituya los medios de sección por medios de crecimiento #2 para iniciar la pérdida del vector pSU-Cre (aproximadamente de tres a cuatro pasajes).</li>
	<li>Aislar clonalmente bacterias no fluorescentes (pasos 3.1–3.8); sin embargo, escanee manualmente la placa con un microscopio de campo brillante para detectar inclusiones. Enriquecer y congelar bacterias (paso 2.11–2.12).</li>
	<li>Pantalla para la cepa mutante utilizando PCR cuantitativo en tiempo real, hincha occidental y secuenciación de ADN del genoma completo como se describió anteriormente12.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El protocolo descrito aquí para la generación de deleciones de genes sin marcadores en C. trachomatis por FLAEM permite la eliminación dirigida de genes no esenciales y elimina los efectos polares inducidos por casete. El protocolo se basa en el diseño cuidadoso de los brazos de homología de 5' y 3' insertados en el vector suicida pSUmC 4.0, la transformación eficiente de C. trachomatis, y la detección cuidadosa de cepas mutantes aisladas. La ingeniería exitosa del genoma a través de este método da como...

La clamidia trachomatis es la principal causa de enfermedad bacteriana de transmisión sexual y representa una carga significativa para la salud humana. Más de 100 millones de personas se infectan cada año con C. trachomatis1. Aproximadamente el 70% de las infecciones en las mujeres son asintomáticas a pesar de los efectos perjudiciales para la salud reproductiva, como la enfermedad inflamatoria pélvica, el embarazo ectópico o la infertilidad. La secuencia de la enfermedad está directamente relacionada con la inmunopatología iniciada por la infección por C. trachomatis 2. Aún no se ha desarrollado una vacuna eficaz; por lo tanto, comprender la función de los factores de virulencia bacteriana y otros productos genéticos bacterianos es una cuestión de investigación importante y urgente.
Como bacterias intracelulares, la invasión de células huésped, la replicación intracelular, la liberación de progenie y la evasión de las respuestas inmunológicas del huésped son procesos críticos. C. trachomatis forma una vacuola ligada a la membrana parasitoforo, denominada inclusión, para el desarrollo intracelular. Establecimiento de la inclusión y muchos otros procesos críticos se logran mediante la secreción de proteínas efectoras a través de un sistema de secreción tipo III (T3SS)3. Elaludar las funciones de estos efectores secretados fue limitada durante muchos años debido a la intractabilidad genética de C. trachomatis. A diferencia de E. coli, muchas técnicas clásicas de clonación no son aplicables a la clamidia. Algunas limitaciones importantes implican la eficiencia de la transformación, la falta de reporteros de contraselección como sacB y mantenimiento de plásmidos. Mientras que los plásmidos de E. coli generalmente pueden mantenerse indefinidamente con un origen de replicación y una presión selectiva adecuada, C. trachomatis plásmido requiere ocho marcos de lectura abiertos adicionales (pgp1-8) para el mantenimiento que se encuentran en el plásmido pL2 nativo dentro del l2 serovar4.
En los últimos años se han generado múltiples herramientas genéticas que acomodan la biología única de La clamidia, pero todavía hay limitaciones5,6,7. La mutagénesis química por tratamiento de metanosulfonato etílico (EMS) puede introducir mutaciones erróneas, o (con menos frecuencia) puede dar lugar a transiciones de nucleótidos que introducen un codón de parada prematuro para producir una mutación sin sentido8. La inserción de transposon es eficiente para la interrupción de genes, pero la tecnología actual en la investigación de la clamidia es laboriosa y requiere mucho tiempo9. Tanto el tratamiento del SME como las técnicas de mutagénesis de transposón generan mutaciones aleatorias y requieren métodos de detección rigurosos para aislar las cepas mutantes. Un método para interrumpir genes mediante la inserción de intrones de grupo II (por ejemplo, TargeTron) permite la mutagénesis dirigida; sin embargo, este método está limitado por la eficiencia, y el sitio de inserción no siempre se predice correctamente10.
Mutagénesis de intercambio alélico reportada por fluorescencia (FRAEM) es una estrategia utilizada para la eliminación de genes dirigido según la inserción de un casete de selección que proporciona resistencia a los antibióticos y un reportero de fluorescencia11. Sin embargo, la FRAEM se complica por el potencial de los efectos polares inducidos por casetes en genes aguas abajo, especialmente cuando se dirige a genes dentro de operons policistricos. La mutagénesis del intercambio alélico de casete floxed (FLAEM) es un novedoso enfoque genético desarrollado para aliviar los efectos polares inducidos por casete observados previamente con el casete de selección FRAEM12. FLAEM utiliza la edición del genoma De xalo para eliminar el casete de selección y restaurar la expresión de genes aguas abajo. El casete de selección que contiene resistencia a los antibióticos y proteína fluorescente verde (GFP) se ha rediseñado con sitios loxP flanqueantes. Estos sitios loxP pueden recombinarse en presencia de Cre recombinase y dar lugar a la escisión del casete del genoma13. Esta estrategia se ha demostrado para aliviar los efectos polares inducidos por el casete al apuntar a tmeA para la eliminación12,14.
Los métodos FRAEM y FLAEM utilizan el mismo vector suicida, pSUmC 4.0, que se puede mantener condicionalmente mediante la expresión inducible de pgp6. Anteriormente se ha demostrado que la expresión de pgp6 es necesaria para la retención de plásmidos y, por lo tanto, se aprovecha para controlar el mantenimiento del plásmido11,15. Cuando C. trachomatis se cultiva en medios complementados con tetraciclina anhidra (aTc) para inducir la expresión pgp6, se mantiene el vector. En ausencia de aTc, el vector se pierde. La eliminación de genes dirigida se logra mediante el intercambio alélico del gen para el casete de selección. Las regiones de 3 kb directamente aguas arriba y aguas abajo del gen dirigido sirven como brazos homológicos para la recombinación. Estos brazos se clonan en el vector pSUmC 4.0 que flanquea el casete de selección. Los eventos exitosos de transformación y recombinación de C. trachomatis se observan a través de informes de fluorescencia. La expresión de mCherry en la columna vertebral vectorial y gfp dentro del casete de selección producen inclusiones fluorescentes rojas y verdes. Una vez que aTc se elimina de los medios de cultivo, las inclusiones de solo verde indican eventos de recombinación exitosos con la pérdida del vector suicida y la integración del casete de selección en el genoma bacteriano.
FLAEM representa una extensión de FRAEM a través de la transformación posterior de un vector cúdita-expresión de la recombinación Cre, pSU-Cre, en la cepa mutante recién creada. Cre recombinase facilita la recombinación entre los sitios loxP y la escisión del casete de selección. Los eventos de recombinación se indican mediante informes de fluorescencia. El vector pSU-Cre codifica mCherry; por lo tanto, la transformación exitosa se indica mediante la adición de fluorescencia roja a gfp-expresando inclusiones. El cultivo en ausencia de presión selectiva para el cassette da como resultado una recombinación mediada por Cre en los sitios loxP, y la pérdida del cassette se indica mediante inclusiones solo rojas. Al igual que con pSUmC-4.0, la expresión inducible de pgp6 se utiliza para mantener condicionalmente pSU-Cre. Una vez que se retiran las selecciones de aTc y antibióticos, el plásmido se cura y la cepa de eliminación sin marcadores resultante no es fluorescente. Este método aborda el problema de los efectos polares inducidos por casete.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>KSE Scientific</td><td>BMK-A1705</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Clorhidrato de anhidrotetraciclina</td><td>ACROS Organics</td><td>233131000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Tampón</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Cloruro de calcio dihidratado</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>Adecuado para el cultivo celular</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma</td><td>7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>dam-/dcm- Competente E. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C2925H</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td>Cultivo celular filtrado estéril probado</td></tr><tr><td>Ácido glutámico</td><td>Sigma</td><td>G8415-100G</td><td>Ácido L-glutámico Medios</td></tr> de <tr><td>crecimiento #1</td><td></td><td></td><td>Medios RPMI 1640 suplementados con un 10 % (vol/vol) de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor.</td></tr><tr><td>Medios de crecimiento #2</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 medios suplementados con 10 % (vol/vol) de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor y 1 &micro; g/mL de cicloheximida</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino inactivado por calor calificado de una sola inyección (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A38402-02</td><td></td></tr><tr><td>Células McCoy ATCC</td><td></td><td>CRL-1696</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit de Miniprep de Plásmido Monarca</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>T1010S</td><td>Purificación</td></tr> <tr><td>de ADN a pequeña escalaNaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139-250G</td><td>Fosfato de sodio monobásico</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td>Fosfato de sodio dibásico</td></tr><tr><td>NEB 10-beta Electrocompetente E. coli Células</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder Ensamblaje de ADN HiFi Kit de clonación</td><td>Nuevo Inglaterra BioLabs</td><td>E5520S</td><td>Gibson Kit de montaje</td></tr><tr><td>Penicilina G sal sódica</td><td>Sigma</td><td>P3032-10MU</td><td>Biorreactivo adecuado para el cultivo celular</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td>Purificación de ADN a gran escala</td></tr><tr><td>Q5 Arranque en caliente ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>M0515</td><td>Fragmento PCR Polimerasa</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio (1x)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Contiene 2mM L-glutamina</td></tr><tr><td>Sall-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Sbfl-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3642S</td><td></td></tr><tr><td>Medios de selección #1</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 &micro; g/mL de cicloheximida, 500 y micro; g/mL de espectinomicina y 50 ng/mL de tetraciclina anhidra disuelta en DMSO</td></tr><tr><td>Selection Media #2</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 &micro; g/mL de cicloheximida, 500 y micro; g/mL de espectinomicina</td></tr><tr><td>Medios de selección #3</td><td></td><td></td><td>RPMI 10 % FBS, 1 &micro; g/mL de cicloheximida, 50 ng/mL de aTc y 0,6 &micro; g/mL de penicilina</td></tr><tr><td>Solución tampón de acetato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S7899-100ML</td><td>3M</td></tr><tr><td>SOC</td> Medio de crecimiento New <td>England BioLabs</td><td>B9020SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>Espectinomicina diclorhidrato pentahidratado, grado de cultivo celular</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61820</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S1888-1KG</td><td>Biorreactivo adecuado para el cultivo celular</td></tr><tr><td>Tampón de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG)</td><td></td><td></td><td>37,5 g de sacarosa, 1,25 g de Na2HPO4, 0,18 g NaH2PO4, 0,36 de ácido glutámico para 500 ml de agua de grado de cultivo</td></tr><tr><td>de tejidos Tris</td><td>AMRESCO</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA de grado ultrapuro (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500-500ML</td><td>Filtrado estéril, BioReactivo, Apto para cultivo celular</td></tr></tbody></table>

eliminación de genes sin marcadores por floxed cassette allelic exchange mutagenesis en chlamydia trachomatis

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

La clamidia trachomatis es un patógeno intracelular obligatorio que ha sido históricamente difícil de manipular genéticamente. El progreso definitivo en la esclarecimiento de los mecanismos que C. trachomatis utiliza para crear y mantener un nicho intracelular privilegiado se ha limitado debido a la falta de herramientas genéticas. Afortunadamente, recientemente ha habido varios avances nuevos en las técnicas de manipulación genética. Entre ellos se encuentra el desarrollo de mutagénesis de intercambio alélico reportada por fluorescencia (FRAEM). Este método permite la eliminación de genes dirigida junto con la inserción de un casete de selección que codifica resistencia a los antibióticos y proteína fluorescente verde (GFP). La confianza en esta estrategia puede ser complicada cuando se dirige a genes dentro de operines policistricos debido al potencial de efectos polares en genes aguas abajo. Mutagénesis de intercambio alélico de casete floxed (FLAEM), el protocolo para el que se describe aquí, fue desarrollado para aliviar los efectos polares inducidos por casete. FLAEM utiliza la edición del genoma Cre-loxP para eliminar el casete de selección después de la eliminación dirigida por intercambio alélico. Las cepas resultantes contienen eliminaciones genéticas sin marcadores de una o más secuencias de codificación. Esta técnica facilita la evaluación directa de la función génica y amplía el repertorio de herramientas para la manipulación genética en C. trachomatis.

El método para la eliminación de genes sin marcadores en C. trachomatis utilizando FLAEM depende de técnicas cuidadosas de clonación y transformación. La recombinación alélica exitosa es un primer paso esencial y requiere la identificación e inserción de brazos de homología en el vector de clonación pSUmC-4.0 (Figura 1). Un segundo paso esencial para la eliminación de genes sin marcadores es la eliminación del reportero de fluorescencia y el casete de selección de antibióticos media...

Aquí se describe un método para la eliminación de genes dirigida y sin marcadores en Chlamydia trachomatis mediante mutagénesis de intercambio alélico de casete floxed, FLAEM.

Eliminación de genes sin marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis en Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

La mutagénesis de intercambio alélico de casete floxado es un método importante porque la deleción genética es una herramienta valiosa que se puede utilizar para comprender la función de los productos genéticos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la deleción de genes dirigidos sin infligir efectos polares sobre genes posteriores. Identificar aproximadamente tres regiones de kilobase directamente aguas arriba y aguas abajo del gen destinado a la deleción para servir como los cinco brazos de homología principal y tres primos para la recombinación homóloga y asignar imprimaciones como se indica en el protocolo de texto.Amplifique las tres armas de kilobase cinco prime y tres de homología de primera calidad del ADN genómico clamidol recién extraído por PCR en una o dos reacciones para producir suficiente fragmento para su posterior ensamblaje de ADN. Después de purificar y concentrar los fragmentos de PCR como se describe en el protocolo de texto, digiere 500 nanogramos del vector pSUmC-4.0 en una reacción de 20 microlitros con una unidad de celda una y una unidad de SBF uno de acuerdo con el protocolo del fabricante. Combine el vector pSUmC-4.0 digerido y purificado y

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

Sistemáticos ya gran escala sintéticos genéticos (gen-gen o epistasis) pantallas de interacción puede ser utilizado para explorar la redundancia genética y la vía de la diafonía. A continuación, se describe un alto rendimiento cuantitativo sintético tecnología de detección genética amplia, denominada eSGA que hemos desarrollado para la aclaración de las relaciones y explorar epistatic interacción en redes...

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Se describe una metodología para llevar a cabo el análisis genético de Chlamydia basada en la mutagénesis química y la secuenciación del genoma completo. Además, un sistema para el intercambio de ADN dentro de las células infectadas se describe que se puede utilizar para la cartografía genética. Este método puede ser ampliamente aplicable a los sistemas microbianos que carecen de sistemas de transformación y herramientas de genética molecular.

Enfoques Forward genéticos en<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Aquí presentamos un protocolo para el uso de preexistentes antibiótico resistencia-cassette borrado construcciones como base para la fabricación de mutantes de deleción en otras cepas de e. coli . Tales mutaciones de la canceladura pueden ser movilizados e inserta en el correspondiente locus de una cepa receptora mediante transducción de bacteriófago P1.

Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos

Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.

Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras

Este protocolo utiliza promotor-reporteros fluorescentes, microscopía de células vivas y extracción de inclusión individual en un enfoque genético hacia adelante dirigido para identificar y aislar mutantes del desarrollo de Chlamydia trachomatis.

Enfoque genético de células vivas para identificar y aislar mutantes del desarrollo en Chlamydia trachomatis

Aquí, describimos la construcción de mutantes nulos de Aeromonas en glicosiltransferasas específicas o regiones que contienen glicosiltransferasas, los ensayos de motilidad y la purificación de flagelos realizados para establecer la participación y función de sus enzimas codificadas en la biosíntesis de un glicano, así como el papel de este glicano en la patogénesis bacteriana.

Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana

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Transfección y mutagénesis de los genes diana en células de mosquito por nucleico cerrado modificado ácido oligonucleótidos

Trasplante de médula ósea proporciona una manera de cambiar el genotipo de las células de médula ósea derivadas. Si el gen de interés se expresa tanto en las células derivadas de la médula ósea y no células de médula ósea derivadas, transplante de médula ósea puede cambiar las células de médula ósea derivadas de un genotipo diferente sin cambiar la no de la médula ósea derivada genotipo celular.

Diferenciar los roles funcionales de la expresión génica de las células inmunes y no inmunes en la colitis de ratón por Trasplante de Médula Ósea

Aprende a eliminar genes sin marcadores en Chlamydia trachomatis mediante mutagénesis FLAEM. Este método permite deleciones precisas sin efectos polares en genes adyacentes para estudios funcionales.

Eliminación de genes sin marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis en Chlamydia trachomatis

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