Estimulación de nichos de células madre y regeneración de tejidos en piel de ratón mediante fotogeneración in situ dependiente de protoporfirina IX conmutable de especies reactivas de oxígeno

Nuestra metodología es la primera en proporcionar una herramienta experimental fiable para inducir una activación transitoria de una especie endógena reactiva de oxígeno o producción de ROS en un tejido in vivo. Nuestra metodología proporciona un procedimiento robusto, fácil de usar y no invasivo que produce una producción constante de niveles de ROS estimulantes fisiológicos en la piel básicamente utilizando una fuente de luz roja. A medida que la inducción fisiológica de ROS en la piel logra las necesidades del tallo tisular, hemos aplicado aún más nuestra metodología para la terapia de regeneración de la piel, incluida la buena curación y el crecimiento del cabello.

La biología y señalización de ROS es actualmente un hervidero de investigación. Una limitación importante para investigar la función de las ROS in vivo es la falta de herramientas adecuadas para inducir una producción endógena controlada de ROS. Nuestra metodología es fácil de usar y sencilla, pero todos los dispositivos, lámparas, IV, IS, etc., deben calibrarse adecuadamente.

Los precursores químicos críticos deben ser frescos y se deben seguir rigurosamente todos los pasos del protocolo. Para inducir el crecimiento de pelo en la piel dorsal de los ratones en la segunda fase telógena, después de confirmar una falta de respuesta al reflejo pedal en aproximadamente el día 50 de la camada postnatal C57 negro seis ratones, use una navaja de afeitar y una crema depilatoria para eliminar dos regiones independientes de piel lado a lado de la parte posterior de cada ratón. Pasados unos minutos, retirar la crema con PBS y registrar el crecimiento del folículo piloso mediante la adquisición diaria de imágenes de alta resolución de las zonas control y de la piel dorsal tratada de cada animal.

Para inducir la generación de lesiones de quemaduras de segundo grado en la piel dorsal de ratones en la segunda fase telógena, se retira el pelo de la parte posterior del ratón. Precaliente una barra de latón de sección transversal de un centímetro a 95 grados centígrados en agua hirviendo y aplique la barra en la región central de la piel del ratón durante cinco segundos. Inmediatamente después de la generación de la quemadura, inyectar intraperitonealmente a los animales un mililitro de solución fisiológica para prevenir la deshidratación y permitir que los ratones se recuperen durante 24 horas antes de proceder al tratamiento.

Para la generación de células de retención marcadas con BrdU o LRC, inyecte a los compañeros de camada de 10 o 14 días de edad por vía intraperitoneal una vez al día durante cuatro días consecutivos con 50 miligramos por kilogramo de peso corporal de BrdU en PBS. Después de la fase de etiquetado, deje que los ratones se desarrollen durante 50 a 60 días antes de aplicar el tratamiento. Para inducir la producción transitoria de especies reactivas de oxígeno no letales o niveles de ROS en la piel del ratón para un análisis del crecimiento del cabello, después de adquirir una imagen de crecimiento del cabello de referencia, aplique tópicamente aproximadamente 25 miligramos de crema mALA en la región derecha de la piel afeitada y coloque al animal en la oscuridad durante 2,5 horas.

Al final del período de tratamiento con fotosensibilizador, elimine completamente cualquier exceso de crema con PBS y confirme la producción de PP9 in situ mediante la expresión de fluorescencia roja bajo excitación con luz azul, luego irradie toda la piel de la espalda con una fuente de luz roja adecuada para una dosis total de 2,5 a 4 julios por centímetro cuadrado. Luego, permita que los ratones se recuperen en una manta eléctrica con monitoreo hasta que estén completamente recostados antes de devolver a los animales a sus jaulas. Para activar la producción transitoria de ROS para la curación de quemaduras de segundo grado, aplique aproximadamente 25 miligramos de crema mALA a lo largo de la superficie derecha de la quemadura y aproximadamente cuatro milímetros de tejido adyacente y coloque a los animales en la oscuridad durante 2,5 horas como se demuestra.

Después de retirar la crema, irradie toda la piel de la espalda y permita que los ratones se recuperen con un seguimiento como se ha demostrado. Para inducir la producción transitoria de ROS en la piel de la cola, aplique aproximadamente 25 miligramos de crema mALA a lo largo del área del tejido dorsal de los ratones tratados con BrdU e irradie la piel dorsal de la cola como se ha demostrado. Después de sacrificar a los ratones, recoja la piel de la cola para la detección de BrdU.

Use un bisturí para cosechar la cola de cada animal, luego haga incisiones longitudinales rectas y pele toda la piel como una sola pieza de la columna vertebral. Incubar los trozos de piel pelados en tubos de cinco milimolares de EDTA y PBS y cinco mililitros durante cuatro horas a 37 grados centígrados para permitir la separación cuidadosa de las láminas intactas de la epidermis de la dermis con pinzas. Fije los tejidos separados en formaldehído al 4% y PBS durante al menos 72 horas a temperatura ambiente.

A continuación, etiquete los tejidos fijados con los anticuerpos conjugados por fluorescencia de interés antes de visualizar los tejidos mediante microscopía confocal de fluorescencia de acuerdo con los protocolos estándar para identificar y cuantificar las LRC en cada condición experimental. Para la evaluación ex vivo de la producción de ROS, después de recolectar trozos de piel de cola de ratón como se ha demostrado, incubar los tejidos de control no tratados y cinco milimolares de EDTA y PBS solos y las muestras de tratamiento fotodinámico en EDTA suplementadas con dos milimolares mALA. A continuación, añada hidroetidina a una concentración final de 3,2 micromolares en cada conjunto de tejidos e incube todas las muestras durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.

Al final de la incubación, use las yemas de los dedos para estirar las muestras de piel de la cola sobre una superficie de vidrio e irradie los tejidos tratados con 636 nanómetros de luz roja a una fluencia de 10 julios por centímetro cuadrado. Al final del tratamiento, separe inmediatamente la epidermis de la dermis y fije las láminas epidérmicas en 4% de formaldehído y PBS durante al menos 72 horas a temperatura ambiente. Al final de la fijación, evalúe la emisión de 2-hidroxihidio rojo mediante microscopía de fluorescencia utilizando luz verde excitante para permitir la adquisición de imágenes de alta calidad.

Para la detección in vivo de la producción de ROS en la piel dorsal, justo después de la irradiación con luz roja, aplique 100 microlitros de un miligramo por mililitro DH-FDA y 50% de etanol en todas las áreas de la piel tratadas y de control objetivo. La administración tópica del precursor mALA en la piel del lomo y la cola del ratón da lugar a una acumulación significativa de protoporfirina IX en todo el tejido y notablemente en el folículo piloso, como lo demuestra la fluorescencia rosa rojiza de este compuesto bajo excitación con luz azul. La irradiación posterior del tejido tratado con luz roja promueve la producción transitoria de ROS dentro del tejido, particularmente en la región abultada del folículo piloso.

La activación de la producción de ROS no letales en la piel de ratón in vivo promueve un aumento significativo en el número de LRC en la región abultada del folículo piloso dos días después del tratamiento fotodinámico. En particular, el aumento en el número de LRC es transitorio, restableciendo a niveles normales seis días después del tratamiento. La producción transitoria de ROS acelera la curación de la piel después de una quemadura de segundo grado.

La cuantificación de la reducción gradual de la piel dañada demuestra la solidez y la importancia estadística del tejido del proceso de aceleración de la cicatrización de heridas. De manera similar, los niveles no letales de ROS promueven fuertemente el crecimiento del cabello después del afeitado durante el segundo telógeno coordinado, una fase durante la cual el folículo piloso es refractario para responder a los estímulos de crecimiento. Además, la producción de ROS después de los fototratamientos también se reduce significativamente mediante la aplicación de compuestos antioxidantes.

La producción de PP IX in situ por expresión fluorescente roja bajo excitación con luz azul debe confirmarse cuidadosamente. Para inducir la producción de ROS, la irradiancia de la fuente de luz roja debe establecerse correctamente. frente al tejido y la dosis total de luz.

Después de la inducción de ROS, se pueden utilizar las técnicas bioquímicas y de biología celular y molecular actuales para analizar las muestras recolectadas y evaluar la respuesta fisiológica dinámica del tejido. Nuestra metodología proporciona una poderosa herramienta para investigar el efecto fisiológico de una producción transitoria de ROS endógenas en un tejido in vivo. Se trata de un nuevo enfoque experimental que puede ser muy útil para los investigadores en el campo de la señalización de ROS.