Evaluación morfológica y funcional de los axónyis y sus sinapsis durante la muerte de Axon en Drosophila melanogaster

El objetivo general de este protocolo de lesión Drosophila es observar tanto la preservación de la morfología axonal y sináptica, como la función sináptica de los axones y sus sinapsis. Estos ensayos también se pueden utilizar para caracterizar los factores de mantenimiento neuronal, estudiar el transporte axonal o analizar orgánulos axonales en axones intactos. El ensayo de lesión parcial del ala permite la observación de axones lesionados sometidos a degeneración lado a lado con axones de control no lesionados dentro del mismo haz nervioso en el ala Drosophila.

Este ensayo de lesiones se puede practicar fácilmente de antemano en moscas de tipo salvaje aplicando un corte aproximadamente en el centro del ala con micro-tijeras. El daño interno permite la evaluación de la morfología axonal y mediante el uso de optogenética para visualizar la preservación funcional del axón y sus sinapsis. La ablación antena requiere manos firmes.

También se recomienda practicar la eliminación de las antenas en moscas de tipo salvaje de antemano. En la adicción, cualquier configuración optogenética disponible es adecuado para activar las neuronas en vuelo con sombrero. De lo contrario, una configuración simple se puede construir fácilmente desde cero.

Para empezar, utilice cinco hembras vírgenes y cinco machos del genotipo adecuado para realizar cruces a temperatura ambiente. Transfiera la generación P0 a viales nuevos cada tres o cuatro días. Recoger recién eclosed adult progeny F1 generación diaria en nuevos viales y envejecer durante siete a 14 días.

Después de la anestesia, utilice micro-tijeras para cortar la vena del ala interior aproximadamente en el medio del ala. Utilice un ala para la lesión y la otra como un control sin lesionar igualado por la edad. Aplique una lesión por ala y asegúrese de lesionarse 15 alas.

Recuperar las moscas en los alimentos que contienen viales. A continuación, con una pipeta, extender 10 microlitros de aceite de halocarbono 27 a lo largo de un tobogán de vidrio entero. Uno o siete días después de la lesión, utilice micro-tijeras para cortar el herido, así como el ala de control no lesionada.

Utilice pinzas para agarrar el ala en el centro, montar al máximo cuatro alas en el aceite de halocarbono 27 y cubrirlos con un portaobjetos. Las imágenes de las neuronas etiquetadas por GFP en el ala se pueden adquirir fácilmente con un disco giratorio. Sin embargo, el tiempo de adquisición debe realizarse en menos de ocho minutos después de montar las alas porque el plato no está fijo.

Imagen del ala inmediatamente usando un microscopio de disco giratorio. Adquiera una serie de secciones ópticas a lo largo del eje Z con un tamaño de paso de 0,33 micrómetros y comprima las pilas Z en un solo archivo para análisis posteriores. Cruza cinco hembras vírgenes y cinco machos del genotipo correcto y recoge la generación de F1 como antes.

Después de la anestesia, utilice pinzas para oblar el tercer segmento antenal derecho para la ablación unilateral o segmentos de antenas tercera izquierda y derecha para la ablación bilateral. Esto elimina los cuerpos celulares neuronales etiquetados por la GFP mientras que sus proyecciones axonales permanecen en el SNC. Dependiendo de las neuronas etiquetadas por GFP utilizadas en la técnica, es importante saber si los cuerpos celulares están alojados en el tercer o en el segundo segmento antenal para el ensayo de lesión posterior.

Recuperar las moscas en los alimentos que contienen viales. Después de la anestesia, usa pinzas para agarrar el cuello y otra pinza para fijar el tórax. Tire suavemente del cuello y la cabeza del tórax.

Utilizando pinzas que se han sumergido en la solución de fijación, transfiera todas las cabezas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de solución de fijación de 4%paraformaldehído y 0,1 tritón X100 en PBS. Fije las cabezas durante 20 minutos con agitación suave a temperatura ambiente. A continuación, coloque el tubo de microcentrífuga sobre hielo y las cabezas gravitan en la parte inferior del tubo de microcentrífuga.

Retire el sobrenadante con una pipeta y agregue un mililitro de tampón de lavado que contenga 0,1%tritón X100 en PBS. Coloque el tubo sobre una rueda giratoria a temperatura ambiente para lavarlo durante dos minutos. Repita el lavado cuatro veces más para eliminar la solución de fijación residual.

Después de preparar los cerebros, obtener una diapositiva de cubierta, pegar cinta de laboratorio en él, y cortar una forma de T como de la cinta. Utilice una punta de pipeta de 20 a 200 microlitros donde se hayan cortado tres milímetros de la punta para ampliar la abertura de la pipeta. Pipetear el cerebro que contiene reactivo antifada en la diapositiva y cubrir los cerebros con una diapositiva de cubierta.

Usa arcilla para preparar dos rollos pequeños y uniformes. Asegúrese de que los rollos de arcilla no sean superiores a la altura de un portaobjetos de vidrio. Pegue los rollos de arcilla en el tobogán de vidrio y coloque el cerebro que contiene el sándwich de diapositivas de cubierta en los rollos de arcilla.

Proceda según el manuscrito. Para preparar las moscas para la optogenética, primero derretir los alimentos para moscas en un microondas. Después de que el alimento se enfríe, antes de la solidificación, añadir 20 mililitros de todo trans-Retinal en etanol a una concentración final de 200 micromolares.

Mezcle bien y vierta los alimentos inmediatamente en los viales vacíos. Cubra los viales que contienen los alimentos solidificados con tapones o bolas de algodón. Envuelva los viales con papel de aluminio.

A continuación, guarde los alimentos que contengan viales en una habitación fría y oscura. Utilice cinco hembras vírgenes y cinco machos del genotipo adecuado para realizar cruces a temperatura ambiente y recoger la generación de F1 como anteriormente en viales cubiertos de aluminio que contienen 200 micromolares todos trans-Retinal en alimentos para moscas. A continuación, recoger las moscas golpeándolas de los alimentos que contienen viales en un vial vacío sin alimentos.

Enfríe el vial en hielo que contenga agua durante aproximadamente 30 segundos. Las moscas se duermen. Ahora, poner rápidamente moscas individuales en pequeñas cámaras cubiertas por una diapositiva de cubierta para realizar optogenéticas.

En una habitación oscura, realice el protocolo que consta de 30 segundos donde la luz roja está ausente, seguido de 10 segundos de exposición a luz roja a 10 Hertz. Repita este procedimiento tres veces en total seguido de un intervalo adicional de 30 segundos donde la luz roja está ausente. Recoger moscas individuales de cada cámara en almohadillas de dióxido de carbono.

Para someterlos a lesiones antenales, ablate los segmentos antenales izquierdo y derecho. Esto elimina los cuerpos celulares de las neuronas orgánicas de Johnston mientras que las proyecciones axonales permanecen en el SNC. Recuperar las moscas en viales cubiertos de aluminio que contienen 200 milimolar todo trans-Retinal.

En los puntos de tiempo correspondientes, por ejemplo, siete días después de la ablación antenal, someter las moscas a otro ensayo de aseo. En este protocolo, se presentaron tres métodos para estudiar la morfología y la función de los axones cortados y sus sinapsis. El primer método permite la observación de alta resolución de axones individuales en el sistema nervioso periférico.

Las cruces esquemáticas para generar clones de tipo salvaje y highwire en el ala se muestran aquí. El control en los axones etiquetados con GFP lesionados también se presenta con flechas que indican axones cortados. Se presenta el segundo enfoque para estudiar la muerte del axón de GFP con axones de neuronas sensoriales etiquetados en el cerebro.

Aquí se muestran cruces esquemáticas para generar clones de tipo salvaje y highwire en el cerebro. Ejemplos de control en axones etiquetados con GFP lesionados se presentan con flechas que indican haces de axones cortados. El tercer método demuestra el enfoque para visualizar la función axonal y sináptica después de la axotomía.

Las cruces esquemáticas para generar tipo salvaje y dnmnat sobre-expresar las neuronas sensoriales de órganos de Johnston se muestra aquí. Las moscas de tipo salvaje son moscas que contienen las neuronas orgánicas de Johnston con muerte atenuada de axón. Ambos albergaban un potente comportamiento de aseo antes de una lesión.

Sin embargo, siete días después de la lesión, el acicalamiento no pudo ser provocado por la optogenética en moscas de tipo salvaje, mientras que los animales con muerte atenuada de axón continuaron acicalándose. Aquí utilizamos mutaciones de pérdida de función o nuestra expresión de genes para observar la preservación de la morfología axonal o función sináptica. Se pueden aplicar otros métodos de modificación, como la interferencia de ARN derribado o los noqueos mediados por CRISPR-Cas9 específicos del tejido.

Estos métodos se pueden utilizar en un contexto independiente de lesiones. Permiten la observación y caracterización de factores de mantenimiento neuronal durante el envejecimiento, el transporte axonal y los orgánulos axones axonales en axones intactos.