Name: Microwaving y fluorofore-Tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - Uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprende inmunomarcado múltiplex en secciones de glándulas suprarrenales de ratón mediante microondas y fluoróforo-tiramida. Este protocolo elimina la reactividad cruzada de anticuerpos para visualizar proteínas con precisión.

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Este trabajo es compatible con NIH R00 HD032636.

1. Manchado con el primer anticuerpo
<ol><li>Dewax y rehidratar los portaobjetos FFPE con 5 min asignados a cada uno de los siguientes pasos: xileno o reactivos equivalentes 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x, y agua destilada 2x. NOTA: Las diapositivas deben permanecer húmedas a partir de este paso de rehidratación hasta el montaje en el paso final.</li>
	<li>Para la recuperación opcional de antígenos, coloque las diapositivas en 275 ml de solución de citrato de sodio hirviendo (10 mM, pH a 6,0) durante 8 min. Para mantener la solución hirviendo, coloque los portaobjetos planos en la parte inferior de una caja de punta de pipeta de 14 x 9,5 x 9 cm3 (Ancho x L x Al) con tapa y microondas la solución con una potencia del 70% en un horno microondas de 700 W durante 8 min. A continuación, retire la caja de punta de pipeta del horno microondas, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente (RT) durante al menos 20 minutos.</li>
	<li>Transfiera las diapositivas en un frasco de Coplin que contenga PBST (solución salina con fosfato con polisorbato 20/80). Lavar con PBST durante 5 min 3x. Si no se mueve inmediatamente al siguiente paso, almacene las diapositivas en este paso con PBST en un frasco de Coplin en RT durante unas horas o a 4 oC durante 1-2 días si no se mueve inmediatamente al siguiente paso.</li>
	<li>Para preparar la solución de bloqueo utilice el suero normal de las especies anfitrionas del anticuerpo secundario como reactivo de bloqueo. También se pueden utilizar otros reactivos de bloqueo comercial. Si utiliza suero normal empleado para el estudio presentado en este estudio, agregue 100 ml de suero de burro normal a 4,9 ml de PBST. La solución de bloqueo se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 días.</li>
	<li>Para el bloqueo, sacuda el PBST de las diapositivas y cúbralos rápidamente con suficiente solución de bloqueo. Incubar los portaobjetos a RT en una cámara humidificada durante 30 min.</li>
	<li>Preparar la solución de anticuerpos primarios (500 ml para dos diapositivas) utilizando la solución de bloqueo para diluir el anticuerpo primario a la concentración deseada. La solución debe almacenarse en hielo hasta su uso.<ol>
<li>Para 3HSD, agregue 2 sde 3sD en 498 ml de solución de bloqueo.</li>
		<li>Para TH, agregue 0,5 ml de anticuerpo TH a 499 ml de solución de bloqueo.</li>
		<li>Para la -catenina, añadir 1 l de anticuerpo de la catenina en 499 l de solución de bloqueo.</li>
		<li>Para 20-HSD, agregue 1 l de anticuerpo de 20-HSD en 499 sdesde bloqueo.</li>
		<li>Para CYP2F2, añadir 2 ml de anticuerpo CYP2F2 en 498 ml de solución de bloqueo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar con el anticuerpo primario sacudiendo la solución de bloqueo de las diapositivas y cubriéndolos rápidamente con suficiente solución de anticuerpos primarios. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante la noche a 4oC. Durante la incubación, los portaobjetos pueden estar cubiertos por un pequeño trozo de película de parafina para evitar que se sequen.</li>
	<li>A la mañana siguiente lavar los portatores con PBST durante 5 min 3x.</li>
	<li>Preparar la solución secundaria de anticuerpos (500 ml para dos diapositivas) utilizando la solución de bloqueo para diluir el anticuerpo secundario biotinylado a la concentración deseada (p. ej., 1 l de anticuerpo anti-ratón de burro o anticuerpo anticonejo de burro en 499 oL de bloqueo solución). La solución debe almacenarse en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Incubar con el segundo anticuerpo sacudiendo PBST de las diapositivas y cubriéndolos rápidamente con suficiente solución secundaria de anticuerpos. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante 1 h a RT. NOTA: Si la biotina endógena es una preocupación, utilice un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa en lugar del anticuerpo secundario biotinulado. Vaya al paso 1.14 si utiliza un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa en el paso 1.10.</li>
	<li>Lave los portaobjetos con PBST durante 5 min 3x.</li>
	<li>Preparar la solución de estriptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (SA-HRP) (500 l para dos diapositivas) añadiendo 0,5 ml de SA-HRP a 499 l de PBS. La concentración final es de 1 g/ml.</li>
	<li>Incubar con la solución SA-HRP. Agitar PBST de las diapositivas y cubrir rápidamente las diapositivas con suficiente solución SA-HRP. Incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante 0,5 h a RT.</li>
	<li>Lave los portaobjetos con PBST durante 5 min 3x.</li>
	<li>Preparar la solución de fluoróforo-tiramida diluyendo la tampaida de fluorofóforo con su tampón de dilución de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, 5 l de fluoroforócor-tiramida en 496 ml de tampón de dilución).</li>
	<li>Realice el desarrollo de la señal con fluoróforo-tiramida sacudiendo PBST de las diapositivas y cubriendo rápidamente las diapositivas con suficiente solución de taquimida de fluoróforo. Incubar en una cámara humidificada durante 1 min a RT. El tiempo de incubación se puede ajustar para obtener la intensidad de fluorescencia deseada. Detenga la reacción transfiriendo las diapositivas a un frasco de Coplin que contenga PBST. Lave los portaobjetos con PBST durante 3 min 2x.</li>
	<li>Las señales se pueden revisar rápidamente bajo un microscopio de fluorescencia para confirmar el resultado en esta etapa. Si no se utilizan los cubreobjetos, aplique una gota de glicerol:PBS (1:1) en cada sección para mantener las muestras húmedas. Lave los portaobjetos con PBST durante 3 min 2x. Las diapositivas se pueden almacenar en PBST a 4 oC durante unos días antes de pasar al siguiente paso.</li>
</ol>2. Strip the First Anticuerpo
<ol><li>Coloque los portaobjetos en 275 ml de solución de citrato de sodio hirviendo (10 mM, pH a 6,0) durante al menos 8 minutos. Mantenga la solución hirviendo colocando los portaobjetos planos en la parte inferior de una caja de punta de pipeta de 14 x 9,5 x 9 cm3 (ancho x l x alto) con tapa y microondiendo la solución a una potencia de 700 W en un horno de microondas de 700 W durante 8 min. Si se prefiere un tiempo de desmontaje más largo, puede ser necesario rematar el tampón utilizando una solución de citrato de sodio hirviendo para mantener las diapositivas sumergidas en la solución tampón en todo momento. Retire la caja de punta de pipeta del horno microondas, abra la tapa y deje que la solución se enfríe en RT durante al menos 20 minutos.</li>
	<li>Transfiera las diapositivas a un frasco de Coplin que contenga PBST. Lavar con PBST durante 5 min 3x. Si el siguiente paso si no se realiza inmediatamente, guarde las diapositivas en un frasco de Coplin con PBST en RT durante unas horas o a 4 oC durante 1-2 días.</li>
</ol>3. Mancha con el segundo anticuerpo
<ol><li>Comience desde el paso de bloqueo y siga los mismos procedimientos en el paso 1.5 al paso 1.14. En los pasos de desarrollo de la señal (paso 1.15 y paso 1.16), utilice el fluoróforo-tiramida en un espectro de fluorescencia diferente. NOTA: Las diapositivas se pueden quitar utilizando este método varias veces para permitir la tinción múltiplex. El último anticuerpo no requiere fluoroforóta-tiramida como reportero. Se podría utilizar un anticuerpo secundario conjugado por fluoróforo para mostrar las señales del último anticuerpo primario.</li>
	<li>Incubar portaobjetos con 2 g/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o solución Hoechst durante 1 min a RT si se necesita la tinción de contador nuclear. A continuación, lave los portaobjetos con PBST durante 3 min 2x.</li>
</ol>4. Imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia para detectar señales
<ol><li>Montar un cubreobjetos con una gota de medio de montaje adecuado para la inmunofluorescencia.</li>
	<li>Para obtener imágenes, utilice un microscopio de fluorescencia para detectar señales de cada canal de fluorescencia. Comience con el canal de tinción nuclear (DAPI) y la lente 4x para localizar el tejido en la diapositiva.</li>
	<li>Cambie a la lente 10x para la toma de imágenes. Ajuste el tiempo de exposición (300 ms) y la intensidad de la fuente de luz (80% de intensidad). Ajuste estos ajustes si la señal es demasiado brillante o demasiado oscura. Tome fotos de cada canal sin mover el escenario. Es posible que sea necesario reenfocar para cada canal. Combine las imágenes de cada canal utilizando el software del microscopio o ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).</li>
</ol>

<ol><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+simple%2C+reliable%2C+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining%3A+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li>
<li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li>
<li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043(2012).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li>
<li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li>
<li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li>
<li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMPLE%3A+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li>
<li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li>
<li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieved+endogenous+biotin%3A+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li>
<li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues%3A+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La inmunomancha múltiple es útil para examinar la colocalización celular de dos o más antígenos. Esta técnica ampliamente utilizada da resultados convincentes de colocación cuando los anticuerpos primarios se conjugan con diferentes reporteros (tinción directa). Sin embargo, la tinción directa generalmente proporciona señales más débiles en comparación con la tinción indirecta, que implica anticuerpos secundarios conjugados para detectar los anticuerpos primarios. En la tinción indirecta, un resultado de inmunomancha múl...

En la inmunomancha múltiple, la tinción directa con anticuerpos primarios conjugados puede proporcionar resultados informativos. Sin el uso de anticuerpos secundarios, el método de tinción directa tiene un bajo riesgo de señales de colocalización falsas debido a la reactividad cruzada de anticuerpos. Sin embargo, los reporteros conjugados (fluoróforo, enzimas) o biotina en el anticuerpo primario limitan su uso futuro. Alternativamente, la inmunomancha indirecta generalmente proporciona señales más fuertes mediante el uso de un anticuerpo primario no conjugado con un anticuerpo secundario etiquetado. Idealmente, los anticuerpos primarios no conjugados utilizados en la inmunomancha múltiple deben provenir de diferentes especies anfitrionas para evitar la reactividad cruzada de anticuerpos. Sin embargo, la combinación adecuada de anticuerpos primarios de diferentes especies anfitrionas no siempre está disponible.
Se han establecido varios métodos para eliminar el riesgo de que el anticuerpo secundario reaccione con un anticuerpo primario no deseado. Un método común es el uso de un anticuerpo monomérico F(ab) para bloquear los epítopos de unión restantes en el primer complejo de anticuerpos primarios antes de manchar con el segundo anticuerpo primario1. El desmontaje de anticuerpos, que es similar a la tira y resondas de una hoja de manchas occidentales, elimina el complejo de anticuerpos previamente teñidos sin eliminar la deposición de moléculas de reportero detectables como el tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB)2 y la deposición de tiramida fluorescente3. Con este método, las moléculas de reportero en diferentes colores pueden mostrar un resultado multiplex en la misma diapositiva. La tinción múltiple también se puede lograr mediante la eliminación completa de las capas de anticuerpos previamente depositadas y la alineación de las imágenes adquiridas posteriormente de otros anticuerpos4,5. Todos estos métodos proporcionan resultados fiables, aunque cada método tiene sus limitaciones y requiere procedimientos complicados o un sistema de imágenes especial.
El presente protocolo muestra la aplicación de un método de desmontaje de anticuerpos con el uso de búferes comúnmente disponibles. Este protocolo se puede utilizar para realizar la tinción inmunofluorescente múltiple x en secciones suprarrenales de ratón con incrustación de parafina fija de formalina (FFPE) con dos anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped.

<table><tbody><tr><td>Medio de montaje antidecoloración</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Burro biotinilado anti-ratón</td><td>JacksonImmuno</td><td>715-066-151</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Burro biotinilado anti-conejo</td><td>JacksonImmuno</td><td>711-066-152</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>2 &mu; g/mL en agua destilada</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>ECHO</td><td>Revolve 4</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-030-084</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Horno microondas, 700 W</td><td>General Electric</td><td>JEM3072DH1BB</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-CYP2F2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-374540</td><td>Dilución 1:250</td></tr><tr><td>Anti-TH</td> <td>de ratónSanta Cruz</td><td>SC-25269</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>JacksonImmuno</td><td>017-000-121</td><td>Suero al 2% en PBST</td></tr><tr><td>Conejo anti-20&alfa; HSD</td><td>Kerafast</td><td>EB4002</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Conejo anti-3&beta; HSD</td><td>TransGenic</td><td>KO607</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>Conejo anti-TH</td><td>NOVUS</td><td>NB300-109</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>Conejo anti-&beta;-catenina</td><td>Abcam</td><td>ab32572</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Estreptavidina Rábano picante Peroxidasa (SA-HRP)</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-303-084</td><td>Dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>TSA Cy3 Tiramida</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT704B001EA</td><td>Dilución 1:100</td></tr><tr><td>TSA Fluoresceína Tiramida</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT701001EA</td><td>dilución 1:100</td></tr></tbody></table>

microwaving y fluorofore-tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

La inmunomancha es ampliamente utilizada en la investigación biomédica para mostrar el patrón de expresión celular de una proteína dada. La inmunomancha múltiple permite el etiquetado con múltiples anticuerpos primarios. Para minimizar la reactividad cruzada de anticuerpos, la inmunomancha múltiple mediante tinción indirecta requiere anticuerpos primarios sin etiquetar de diferentes especies huésped. Sin embargo, la combinación adecuada de diferentes especies de anticuerpos no siempre está disponible. Aquí, describimos un método de uso de anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped (por ejemplo, en este caso, ambos anticuerpos son de conejo) para la inmunofluorescencia múltiplex en secciones suprarrenales de ratón con incrustación de parafina fijada en formalina (FFPE). Este método utiliza el mismo procedimiento y reactivos utilizados en el paso de recuperación de antígenos para eliminar la actividad del complejo de anticuerpos primarios previamente manchado. Las diapositivas se teñieron con el primer anticuerpo primario utilizando un protocolo general de inmunomanchado seguido de un paso de unión con un anticuerpo secundario biotinilado. Luego, se utilizó un método de desarrollo de señal de avidina-biotina-peroxidasa con fluoróforo-tiramida como sustrato. La inmunoactividad del primer complejo de anticuerpos primarios se desprendía a través de la inmersión en una solución de citrato de sodio hirviendo por microondas durante 8 min. La deposición insoluble de fluoróforo-tiramida permaneció en la muestra, lo que permitió que la diapositiva se manchase con otros anticuerpos primarios. Aunque este método elimina la mayoría de las señales falsas positivas, puede quedar algún fondo de la reactividad cruzada de anticuerpos. Si las muestras se enriquecen con biotina endógena, se puede utilizar un anticuerpo secundario conjugado por peroxidasa para reemplazar el anticuerpo secundario biotintilado para evitar el falso positivo de la biotina endógena recuperada.

Los resultados se obtuvieron de muestras tratadas con todos los pasos descritos, incluido el paso 1.2 de recuperación de antígenos. Todos los anticuerpos secundarios utilizados aquí fueron biotinylados. El fluoróforo-tiramida se utilizó para desarrollar señales de los anticuerpos primarios primero y segundo. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un cubo FITC (para fluorescencia verde), un cubo TxRED (para Cy3) y un cubo DAPI (para DAPI).</p...

Se han establecido varios métodos diferentes para la inmunomanchación múltiple utilizando anticuerpos primarios de la misma especie huésped. Aquí, describimos el uso de desmontaje de anticuerpos mediados por microondas y de taquimida de fluoróforo para bloquear la reactividad cruzada de anticuerpos durante la inmunomancha multiplex en secciones suprarrenales de ratón incrustadas en parafina fija sin forfina.

Microwaving y fluorofore-Tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - Uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

La inmunostaining se utiliza ampliamente en la investigación biomédica para identificar la ubicación de una proteína de interés. La inmunostaining multiplex puede detectar múltiples dianas en la misma muestra utilizando diferentes anticuerpos primarios. El beneficio de este método es el uso de tampones comúnmente disponibles para eliminar la reactividad cruzada de anticuerpos permitiendo la inmunosutención utilizando dos o más anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped.Demostrando el procedimiento estarán Sophia Zheng, una estudiante de posgrado, y Qiongxia Lyu, una estudiante visitante de mi laboratorio. Antes de la tinción, descerar y rehidratar diapositivas de parafina fijada en formalina con inmersiones de cinco minutos en cada solución como se indica. Después de la segunda inmersión en agua destilada, coloque los portaobjetos en 275 mililitros de solución de citrato sódico hirviendo en la parte inferior de una caja de punta de pipeta con una tapa y coloque la caja en un microondas de 700 vatios a una potencia del 75% durante ocho minutos.Al final del tratamiento, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de lavar los portaobjetos con tres lavados de cinco minutos de PBST fresco en un frasco de Coplin. Para bloquear cualquier sitio de unión no específico, después del último lavado agitar el exceso de PBST de cada diapositiva y cubrir las diapositivas con un volumen suficiente de una solución de bloqueo adecuada. Después de 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada, agitar el exceso de solución de bloqueo de cada diapositiva y añadir 250 microlitros del primer anticuerpo primario de interés para cada muestra.Para evitar que las muestras se sequen, las diapositivas pueden estar cubiertas por un trozo de película de parafina. Después de una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara humidificada, lave los portaobjetos tres veces con PBST fresco durante cinco minutos por lavado. Agitar el exceso de PBST y luego cubrir rápidamente cada diapositiva con 250 microlitros de una solución de anticuerpos secundaria apropiada para una incubación de una hora en una cámara humidificada a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco como se ha demostrado y agregue 250 microlitros de estreptavidina recién preparada peroxidasa de rábano picante a cada tobogán. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco. A continuación, sacuda el exceso de PBST y cubra cada diapositiva con 250 microlitros de solución de fluoróforo-tiromida recién preparada.Un minuto más tarde, sumerja los portaobjetos en PBST fresco seguido de tres lavados de dos minutos en PBST fresco. Después del último lavado, aplique unas gotas de una solución de glicerol a PBS uno a uno en las secciones y compruebe la presencia de una señal de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia. Para eliminar el primer complejo de anticuerpos, coloque los portaobjetos etiquetados con anticuerpos en 275 mililitros de solución de citrato sódico hirviendo durante al menos ocho minutos como se ha demostrado.Al final del tratamiento, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de lavar los portaobjetos tres veces con PBST durante cinco minutos por lavado. Para manchar para la segunda proteína diana de interés, después del bloqueo para la unión inespecífico como se ha demostrado, etiquete cada muestra con 250 microlitros del segundo anticuerpo primario de interés a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en PBST fresco por lavado antes de cubrir cada diapositiva con 250 microlitros de una solución de anticuerpos secundaria adecuada para una incubación de una hora a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco como se ha demostrado y agregue 250 microlitros de estreptavidina recién preparada peroxidasa de rábano picante a cada tobogán. Para desarrollar la señal para la segunda proteína diana de interés, después de tres lavados PBST, tratar los portaobjetos con la tiramida conjugada de fluoróforo en un espectro de fluorescencia diferente. Para detener el desarrollo de la señal de tiromida, sumerja las diapositivas en PBST.A continuación, manche las muestras con un tinte nuclear adecuado. Para obtener imágenes por microscopía de fluorescencia, monte cada diapositiva con etiqueta de tinte nuclear con una gota de un medio de montaje adecuado en un cubreobjetos. Utilice el objetivo 4X para localizar el tejido en la diapositiva.Cambie al objetivo 10X para la toma de imágenes y ajuste el tiempo de exposición a 100 a 400 milisegundos con la fuente de luz entre 40 y 80% de intensidad. A continuación, obtenga imágenes en cada canal sin mover la etapa. Las imágenes de cada canal se pueden combinar para formar una imagen fluorescente multiplex.Sin desprendimiento entre la primera y la tinción secundaria de anticuerpos, la segunda tinción de tirosina hidroxilasa recogerá señales de la primera proteína diana de interés, lo que resulta en una falsa tinción positiva de tirosina hidroxilasa, por ejemplo en esta muestra dentro de la corteza suprarrenal. Para eliminar la reactividad cruzada de anticuerpos en la peroxidasa de rábano picante de la primera inmunosuchación, se puede realizar un des nudista mediado por microondas de un minuto y ocho minutos, lo que resulta en resultados limpios de doble tinción. No se recoge ninguna señal significativa en las muestras de control negativo.El despojo de ocho minutos en el tampón de citrato hirviendo también es suficiente para eliminar la reactividad cruzada de anticuerpos para muchos anticuerpos comúnmente utilizados en la glándula suprarrenal. En algunos casos, una señal falsa positiva débil sigue siendo detectable, sin embargo, y un aumento de 20 minutos para el tratamiento de microondas todavía puede no eliminar completamente la reactividad cruzada del anticuerpo. Durante la toma de imágenes por fluorescencia, es importante no mover el escenario al cambiar de canal.Sin embargo, puede ser necesario reajustar el enfoque para obtener imágenes claras de cada canal. Para cada canal, asegúrese de ajustar el tiempo de exposición para asegurarse de que las señales están expuestas adecuadamente sin píxeles o áreas sobreexpuestas en las imágenes. Durante el procedimiento de tinción, es importante mantener los portaobjetos hidratados de la desceración y Los portaobjetos se pueden despojar utilizando los mismos métodos de desprendimiento varias veces para permitir la tinción multiplex.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra un ensayo para realizar inmunotinción múltiple utilizando anticuerpos primarios de la misma especie huésped. En este método, una sección de tejido suprarrenal se somete a un proceso de inmunotinción de dos pasos. Inicialmente, la sección se tiñe con anticuerpos específicos para los marcadores en la corteza, seguido de la extracción del anticuerpo unido y se vuelve a teñir con anticuerpos específicos para los marcadores en la médula.

Un método de inmunotinción múltiple que utiliza anticuerpos primarios de la misma especie huésped

Este artículo de video ilustra un protocolo completo para detectar y cuantificar todas las etapas de la neurogénesis del hipocampo adulto dentro de la misma sección de tejido. Elaboramos un método para superar las limitaciones de la inmunofluorescencia múltiple indirecta que surgen cuando no se dispone de anticuerpos adecuados de diferentes especies de huéspedes.

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

La inmunohistoquímica es una poderosa técnica de laboratorio para evaluar la localización y expresión de proteínas dentro de los tejidos. Los métodos semiautomatizados actuales de cuantificación introducen subjetividad y, a menudo, crean resultados irreproducibles. En este trabajo, describimos los métodos para la inmunohistoquímica multiplexada y la cuantificación objetiva de la expresión y colocalización de proteínas mediante imágenes multiespectrales.

La cuantificación de la expresión de la proteína y Co-localización Uso de multiplexado inmunohistoquímica y tinción de imágenes multiespectrales

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Aquí presentamos un método para aislar las glándulas suprarrenales de los ratones, reparar los tejidos, les sección y realizar tinción de inmunofluorescencia.

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Aquí se describe un protocolo de immunohistochemical fluorescente multiplex la coloración y la proyección de imagen para la localización simultánea de múltiples antígenos asociados a cáncer de linfoma. Este protocolo puede ampliarse para el análisis de colocalización de marcadores biológicos en todas las secciones de tejido.

La coloración de Immunohistochemical fluorescente multiplexado, por imágenes y análisis en muestras histológicas de linfoma

La inmunohistoquímica fluorescente multiplex es una tecnología emergente que permite la visualización de múltiples tipos de células dentro del tejido integrado en parafina (FFPE) fijo en formalina. Se presentan pautas para asegurar un multiplex de 7 colores exitoso con instrucciones para optimizar anticuerpos y reactivos, preparar diapositivas, diseño y consejos para evitar problemas comunes.

Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual

El análisis de imágenes de códigos de barras multiplexadas ha mejorado recientemente la caracterización del microambiente tumoral, permitiendo estudios exhaustivos de la composición celular, el estado funcional y las interacciones célula-célula. Aquí, describimos un protocolo de tinción e imagen utilizando el código de barras de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos y el ciclo de imágenes, que permite el uso de una técnica de análisis de imágenes de alta dimensión.

Análisis de imágenes de código de barras multiplexadas para inmunoperfilado y caracterización de mapeo espacial en el análisis unicelular de muestras de tejido de parafina

En este artículo, se describe un protocolo para la inmunofluorescencia múltiple (mIF) de amplificación manual de señal de tiramida (TSA) combinada con análisis de imágenes y análisis espacial. Este protocolo se puede utilizar con secciones fijadas en parafina con formalina (FFPE) para la tinción de dos a seis antígenos por portaobjetos, dependiendo del escáner de portaobjetos disponible en el laboratorio.

Inmunofluorescencia múltiple combinada con análisis de imágenes espaciales para la evaluación clínica y biológica del microambiente tumoral

La inmunohistoquímica cíclica múltiple permite la detección in situ de múltiples marcadores simultáneamente mediante la incubación repetida antígeno-anticuerpo, el escaneo de imágenes y la alineación e integración de imágenes. En este trabajo se presenta el protocolo operativo para la identificación de sustratos de células inmunitarias con esta tecnología en muestras de cáncer de pulmón y metástasis cerebrales pareadas.

Inmunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex

Este protocolo proporciona una guía paso a paso para diseñar un panel de anticuerpos de inmunofluorescencia multiplex para la obtención de imágenes basadas en códigos de barras de ADN de tejidos murinos de melanoma FFPE. También describimos una línea de análisis de imágenes que utiliza herramientas de código abierto para generar información proteómica espacial sobre el microambiente inmunológico del tumor de melanoma murino.

Imágenes de inmunofluorescencia múltiple basadas en códigos de barras de ADN para analizar muestras de FFPE de melanoma murino reprogramado genéticamente

Aprende inmunomarcado múltiplex en secciones de glándulas suprarrenales de ratón mediante microondas y fluoróforo-tiramida. Este protocolo elimina la reactividad cruzada de anticuerpos para visualizar proteínas con precisión.

Microwaving y fluorofore-Tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - Uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona (Video) | JoVE Journal

Microwaving y fluorofore-Tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - Uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona

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