Name: Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprende el ensayo de adhesión opsonica para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra Bacillus anthracis y otros patógenos encapsulados. Este método seguro permite analizar la eficacia de anticuerpos sin infectar animales.

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J. Chua, D. Chabot y A. Friedlander diseñaron los procedimientos descritos en el manuscrito. J. Chua y T. Putmon-Taylor realizaron los experimentos. D. Chabot realizó análisis de datos. J. Chua escribió el manuscrito.
Los autores agradecen a Kyle J. Fitts por su excelente asistencia técnica.
El trabajo fue apoyado por la agencia de reducción de amenazas de defensa CBM. VAXBT.03.10.RD.015, número de plan 921175.
Opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las de los autores y no necesariamente están respaldadas por el Ejército de los Estados Unidos. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Defensa, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica el respaldo del Gobierno de los Estados Unidos.

En cumplimiento de la Ley de Bienestar Animal, la política del Servicio de Salud Pública y otras leyes y regulaciones federales relativas a animales y experimentos que involucran animales, la investigación descrita aquí se llevó a cabo bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. La instalación donde se llevó a cabo esta investigación está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado De Los Animales de Laboratorio, Internacional y se adhiere a los principios indicados en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Consejo Nacional de Investigación, 201124.
1. Cultura y mantenimiento de la línea celular, RAW 264.7
NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse con técnicas asépticas.
<ol><li>Caliente el suero bovino fetal (FBS) en un baño de agua de 56 °C durante 30 minutos para inactivar el complemento. NOTA: El tiempo de inactivación de 30 min comienza cuando FBS alcanza los 56 °C. Para controlar la temperatura, caliente un volumen similar de agua en un vaso de precipitados en el mismo baño de agua. Una vez que el agua alcance los 56 °C, comience la cuenta atrás de 30 minutos para FBS. Alternativamente, FBS que ha sido desactivado por calor también está disponible comercialmente.</li>
	<li>Preparar medio para células RAW 264.7 combinando 90% DMEM con glucosa alta y 10% FBS inactivado por calor (v/v). Añadir L-glutamina a una concentración final de 6 mM. NOTA: DMEM con glucosa alta está formulado con 4 mM L-glutamina. Complementar L-glutamina a 6 mM promueve el crecimiento constante de las células. Se pueden añadir 100 penicilinas U/ml y 100 μg/ml de estreptomicina para evitar la contaminación. Otra línea celular murina común, J774A.1, también se puede utilizar y se cultiva en condiciones similares.</li>
	<li>Descongelar un vial congelado de células en un baño de agua de 37 °C y retirar del baño tan pronto como se derrita. Añadir contenido asépticamente a 5 ml de medio completo en un tubo cónico. Invierta el tubo cónico dos veces y gire a 300 x g durante 5 minutos a las células de pellets.</li>
	<li>Aspirar medio usando un pipete pasteur estéril unido a un vacío para eliminar el agente de congelación. Pellet de celda resuspend en 5 ml de medio fresco.</li>
	<li>Transfiera la suspensión a un matraz o plato tratado con cultivo tisular. Agregue suficiente medio para cubrir completamente la parte inferior del matraz y arremolinarse para distribuir uniformemente las células. Indique el número de pasaje a partir de "1".</li>
	<li>Incubar células a 37 °C en presencia de 5% DE CO2 y humedad hasta alcanzar entre el 95% y el 100% de confluencia. Revise las células diariamente bajo el microscopio comenzando con el segundo día de incubación. No permita que las células alcancen >100% de confluencia, ya que esto hará que las células se levanten y mueran. NOTA: El tiempo necesario para alcanzar la confluencia depende de cuántas células vivas fueron chapadas y el área de crecimiento del matraz. Por lo tanto, es prudente comprobar las células diariamente.</li>
	<li>Células de subcultura raspando y diluyendo el caldo celular en medio fresco permitiendo al menos dos días de crecimiento entre raspados. Aumente el número de pasaje en 1 con cada subcultura. NOTA: Pasar y raspar inmediatamente al día siguiente resultará en una pérdida más rápida de la adherencia general de la célula con el tiempo. Las células RAW 264.7 solo deben utilizarse hasta aproximadamente el paso 15.</li>
	<li>Para chapar células RAW 264.7 para el ensayo OAA, reemplace con un medio fresco y utilice un raspador de células para raspar suavemente las células del matraz. Pipeta arriba y abajo para romper los grupos celulares para facilitar el recuento celular. NOTA: El método tradicional para subcultar RAW 264.7 es raspado. En nuestra experiencia, el uso de trypsin hace que las células RAW 264.7 pierdan adherencia con el tiempo más rápido que con el raspado.</li>
	<li>Para contar las células, diluya los volúmenes iguales de células y pruebe la solución azul. Cargue 10 μL en un hemociclo. Observe y cuente el número de células vivas que excluyen el tinte utilizando un microscopio compuesto invertido con una lente objetiva de 10x.</li>
	<li>Placa 1,4 x 104 células viables por pozo en una placa plana de vidrio de 96 pozos de 0,15 μm de espesor (placa #1). Permita que las células crezcan durante 3 días. Reemplace el medio gastado un día antes de realizar OAA. NOTA: Después de 3 días de incubación, el número de células debe ser de aproximadamente 5 x 104/pozo.</li>
</ol>2. Cultivo y preparados bacterianos
NOTA: La especie bacteriana utilizada en este protocolo es una cepa virulenta encapsulada, B. anthracis Ames. Todas las manipulaciones con esta especie requieren seguridad adecuada y autorizaciones de seguridad y deben realizarse en un armario de seguridad biológica clase II o clase III ubicado en un laboratorio BSL-3. Siga los procedimientos operativos institucionales para el trabajo de BSL-3 y para el uso de equipos de protección personal al manipular bacterias.
<ol><li>Prepare el caldo de infusión cardíaca cerebral (BHI) disolviendo 37 g de polvo BHI en agua de 1 L y autoclavando a 121 °C durante 15 minutos. Almacene el caldo a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare una solución de bicarbonato de sodio al 8% en agua y esterilizar con una jeringa filtrante de 0,20 μm. Almacene la solución a 4 °C y utilícenla en un plazo de 1 día.</li>
	<li>Mezcle 8 g de caldo nutritivo, 3 g de extracto de levadura y 15 g de agar en agua de 1 L para preparar placas de agar NBY. Autoclave a 121 °C durante 15 min. Vierta en placas de Petri y deje solidificar. Guarde las placas a 4 °C. NOTA: Las placas de agar NBY se pueden hacer con o sin bicarbonato de sodio. La adición de bicarbonato de sodio a las placas de caldo y agar induce el crecimiento de colonias de mucoides que consisten en bacilo encapsulado. La concentración final de bicarbonato de sodio en medios líquidos y sólidos es del 0,8%.</li>
	<li>Prepare el caldo de cultivo para B. anthracis mezclando caldo BHI autoclavado al 50%, 40% FBS y 10% solución de bicarbonato sódico (v/v). NOTA: Este caldo está formulado para producir cadenas cortas de bacilo encapsulado.</li>
	<li>Prepare una placa maestra de B. anthracis con rayas para su aislamiento en una placa de agar NBY de un stock de esporas un día antes de cultivar en caldo. Incuba a 37 °C.</li>
	<li>Inocula 30 ml de caldo de cultivo en un matraz de 250 ml ventilado con varias colonias de B. anthracis. NOTA: Se necesita una relación volumen-superficie específica del caldo, como se especifica aquí, para producir bacilos encapsulados al máximo.</li>
	<li>Agitar el cultivo del caldo a 125 rpm, 37 °C con 20% DE CO2 y humedad para 18-24 h. NOTA: Crecer B. antrasis a temperaturas superiores a 37 °C puede inhibir la producción de cápsulas.</li>
	<li>Utilice la tinción negativa con tinta india para garantizar una encapsulación suficiente y que los bacilos estén en cadenas cortas (1-5 bacilos/cadena) antes de la fijación (ver sección 3).</li>
	<li>Para determinar las unidades formadoras de colonias (CFU), diluya en serie 100 μL de cultivo 1:10 en solución de solución de fosfato y diluciones de cultivo de placas en placas de agar de sangre de oveja. Incubar de 12-18 h a 37 °C. Cuente las CFU y determine el número de bacterias por ml de cultivo. NOTA: El conteo también se puede realizar utilizando un hemociclo dentro del microscopio una vez que las bacterias han sido reparadas. Sin embargo, esto no se recomienda porque los bacilos son difíciles de ver bajo bajo aumento.</li>
	<li>Añadir 16% paraformaldehído (PF) a todo el volumen de cultivo bacteriano a una concentración final de 4% PF para fijar el bacilo. Agitar lentamente en una coctelera a temperatura ambiente durante 7 días. NOTA: Siete días de incubación en 4% PF se basa en el procedimiento operativo estándar institucional USAMRIID para la fijación de bacilos vegetativos.</li>
	<li>Para eliminar el fijador y la prueba de esterilidad, lave tres veces 4 ml (10% de volumen) de suspensión bacteriana fija en un tubo cónico de 50 ml por centrifugación a ≥3000 x g durante 45 minutos y usando un tubo cónico de 30 ml/lavado con PBS. Almacene la muestra restante en 4% PF a 4 °C. NOTA: Después de la peletía, el pellet bacteriano es esponjoso debido a la presencia de la cápsula. No se cuide de no molestar el pellet durante el lavado. Es necesario eliminar todo fijador para que no interfiera con las pruebas de viabilidad. Si es necesario, aumente el número de lavados.</li>
	<li>Para pruebas de viabilidad, inocular 40 ml de un medio de crecimiento bacteriano (por ejemplo, caldo BHI) con 4 ml de suspensión lavada (≤ 10% del volumen de caldo) e incubar a 37 °C durante 7 días. Compruebe la densidad óptica a 600 nm antes y después de 7 días para medir la turbidez.</li>
	<li>Después de 7 días de incubación en cultivo de caldo, placa ≥100 μL de caldo en una placa de agar e incubar durante otros 7 días. Si no se observa ningún aumento en la turbidez y no se observa ningún crecimiento en las placas, el cultivo original se considera estéril y puede transferirse a un laboratorio BSL-2. NOTA: El Programa Federal de Agentes Seleccionados22 exige que B. anthracis inactivado solo se pueda transferir desde laboratorios BSL-3 después de demostrar la esterilidad completa de la muestra. Las pruebas de viabilidad para B. anthracis inactivadas consisten en cultivar el 10% de la muestra en caldo durante 7 días seguido de la culturing en medios sólidos durante otros 7 días22,23. Siga las directrices institucionales para recibir la aprobación de transferencia una vez establecida la esterilidad.</li>
</ol>3. Tinción negativa y microscopía ligera para observar las cadenas de encapsulación y bacilo
<ol><li>Mezcle 5 μL de suspensión bacteriana con 2 μL de tinta india en una diapositiva del microscopio. Coloque un vaso de cubierta de 1 o 1,5 μm de espesor encima de la suspensión sin crear burbujas. NOTA: El esmalte de uñas se puede utilizar para sellar el vidrio de la cubierta en el tobogán.</li>
	<li>Observe la suspensión bacteriana utilizando una lente objetivo de aceite de 40x a 100x en un microscopio ligero. Asegúrese de que el bacilo se encapsula observando una zona de aclaramiento (cápsula excluye la tinta india) que rodea cada bacteria y que las cadenas de bacilos son cortas.</li>
</ol>4. Etiquetado fitc de bacterias
<ol><li>Disolver el isotiocyanato de fluoresceína (FITC) en sulfóxido de dimetil a una concentración de 2 mg/ml.</li>
	<li>Mida el volumen del caldo bacteriano inactivado.</li>
	<li>Lave el caldo 3x en PBS para eliminar el fijador.</li>
	<li>Añadir solución FITC a una concentración final de 75 μg/ml. Agitar lentamente la mezcla durante 18-24 h a 4 °C.</li>
	<li>Lave tres veces las bacterias peletizando a ≥3000 x g, 45 min y usando 30 mL PBS/wash para eliminar el exceso de FITC. Asegúrese de que el pellet esponjoso no se moleste durante el lavado. Resuspend el bacilo en PBS en el mismo volumen inicial.</li>
	<li>Aliquot y almacenar el bacilo en microtubos a -20 °C hasta su uso. No congele/descongele bacilo varias veces, ya que el bacilo puede perder cápsula.</li>
</ol>5. Opsonización bacteriana
<ol><li>El calor inactiva un pequeño volumen de sera de prueba (de LOSP) a 56 °C durante 30 minutos en un bloque de calor.</li>
	<li>Descongelar y lavar bacterias etiquetadas con FITC con PBS 2x por peletización a 15000 x g durante 3-5 min. Resuspend en PBS en el mismo volumen inicial.</li>
	<li>En una placa inferior redonda de 96 pozos (placa #2), diluya en serie el sera de prueba en el medio celular. En otra placa inferior redonda de 96 (placa #3), agregue 10 μL de sera de prueba diluida en cada pozo. NOTA: En cada plato, PBS y sera mono normal se incluyeron en lugar de sueros de prueba diluidos como controles negativos. También elegimos un suero de prueba como un control positivo para generar una curva estándar para normalizar todos los ensayos realizados en diferentes días. El suero de prueba de control positivo fue elegido arbitrariamente porque era abundante.</li>
	<li>Para #3, agregue un complemento de conejo bebé recién reconstitutado de 10 μL. NOTA: Una vez reconstituydo, deseche el complemento restante de conejo bebé; no se descongelen y se descongelen.</li>
	<li>Para chapar #3, agregue el volumen adecuado de bacilos etiquetados con FITC para una multiplicidad de infección de 1:20. Por ejemplo, agregue el volumen que contiene 5 x 104 x 20 bacilos para 5 x 104 celdas. Remate cada pozo en placa #3 con el volumen adecuado de medio celular a total de 105 μL. NOTA: La placa #1, que contiene células, recibe 100 μL de bacterias opsonizadas con los 5 μL restantes como volumen vacío. Probamos cada dilución de la prueba sera en duplicado.</li>
	<li>Incubar placa #3 a 37 °C durante 30 min en presencia de 5% CO2 con humedad para opsonizar bacilos.</li>
</ol>6. Ensayo de adherencia y etiquetado fluorescente de células de mamíferos
<ol><li>Mantenga todos los reactivos a 37 °C antes de su uso.</li>
	<li>Coloque la placa #1, que contiene células adherentes, en un bloque de calor de 37 °C.</li>
	<li>Utilice un pipeteador multicanal para eliminar el medio gastado de los pozos y reemplazar rápidamente con 100 μL de bacterias opsonizadas de la placa #3. Asegúrese de que no se hayan generado burbujas en los pozos durante el pipeteo. La placa de incubación #1 a 37 °C con un 5% de CO2 y humedad durante 30 minutos para la adherencia.</li>
	<li>Lave cada pozo 5 veces con 150 μL PBS encima de un bloque de calor de 37 °C para eliminar bacilos no asociados. NOTA: Se debe tener cuidado para garantizar que las células no se dispersen accidentalmente durante el lavado.</li>
	<li>Diluir 16% PF con PBS 1:4 para hacer 4% PF. Fijar células con 4% PF para 1 h mediante la adición de 150 μL a cada pozo. Lave las células 2 veces con PBS.</li>
	<li>Mezcle 2 μL HCS (cribado de alto contenido) Mancha de células anaranjadas en PBS de 10 ml. Añadir 150 μL de esta solución de tinción a las células fijas e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave los pozos 2 veces con PBS.</li>
	<li>Conservar a 4 °C hasta la microscopía.</li>
</ol>7. Microscopía
NOTA: En general, un microscopio automatizado de fluorescencia de alto rendimiento facilitará la toma de imágenes para la OAA. Si no hay un sistema automatizado disponible, las imágenes fluorescentes de bacilos adherentes se pueden tomar manualmente21. En este estudio20,bacilos adherentes y monocapas celulares fueron imagines usando el sistema de microscopía de escaneo láser Zeiss 700 con equipo especializado; nuestro sistema se componía del microscopio invertido Zeiss Axio Observer Z1 equipado con una etapa automatizada, el módulo Definite Focus, el objetivo 40 x NA 0.6, la cámara Axio Cam HRc y el software Zen 2012 (Blue Edition). Las imágenes adquiridas son imágenes de campo ancho, no imágenes confocales. El siguiente protocolo está pensado como una configuración básica de microscopio que es aplicable a una variedad de sistemas automatizados de microscopía.
<ol><li>Incubar la placa #1 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Encienda el microscopio y el equipo relacionado. NOTA: La aclimatación a temperatura ambiente impide que la condensación se forme en la placa de vidrio durante la toma de imágenes. Además, evita el desenfoque debido al cambio de temperatura.</li>
	<li>Coloque la placa en el escenario y concéntrese en las celdas utilizando el campo brillante o el contraste de fase.</li>
	<li>Seleccione el formato 96 bien como ajuste de placa. Seleccione configuración de canal. NOTA: La excitación máxima de FITC y la longitud de onda de emisión son 495/519 nm; la mancha de células anaranjadas HCS es de 556 y 572 nm. Otros fluoróforos se pueden utilizar dependiendo de los filtros que están disponibles en el microscopio.</li>
	<li>Seleccione configuración en modo mosaico. Indique el número de imágenes que se adquirirá. NOTA: La función de ordenamiento en teselas permite la captura de varias ubicaciones en un pozo de muestra y se puede configurar para adquirir imagen en un mosaico o un formato aleatorio. Hemos captado 10 áreas aleatorias por pozo.</li>
	<li>Cambie el modo de adquisición a "blanco y negro" o "monocromo" y binning ≥ 2x2. NOTA: Establecer el binning de 1x1 a 2x2 o 4x4 aumentaría la velocidad de microscopía, pero también daría lugar a una menor resolución de la imagen. Para OAA, es suficiente utilizar estos ajustes, ya que el ensayo enumera tanto los macrófagos como las bacterias adherentes.</li>
	<li>Active el módulo de enfoque automático o enfoque. Indique la frecuencia con la que se va a realizar la función de enfoque automático. Active la función de pila Z, si está disponible. Indique el número de pilas Z que capturarán el grosor de la monocapa celular y el bacilo adherente. NOTA: El número de pilas Z elegidas aumentará el tiempo de microscopía, pero garantizará que se tome una imagen con el enfoque correcto en cada pila Z.</li>
	<li>Designe una carpeta de archivos en la que guardar imágenes. Ejecute el programa de imágenes automatizadas.</li>
</ol>8. Recopilación y análisis de datos
<ol><li>Contar el número de bacilos adherentes y células de mamíferos por imagen. Cuente cada cadena de bacilos como una bacteria.</li>
	<li>Trace los bacilos/células del suero y el valor de prueba de control positivo (por ejemplo, la dilución de 1:10 es de 10 titeres) para generar una curva estándar en un programa de estadísticas adecuado.</li>
	<li>Analice el suero de prueba de control positivo utilizando un empalme de curva de regresión no lineal. A continuación, analice las muestras restantes utilizando la curva estándar del suero de prueba de control positivo para determinar las títulos correspondientes. NOTA: Por lo general, es más preciso elegir las diluciones de la muestra cerca del centro de la curva estándar al determinar los títulos.</li>
	<li>Calcule la media geométrica de las muestras de cada grupo vacunal. Calcule los valores P de los títulos transformados de registro por la diferencia menos significativa del análisis ANOVA.</li>
</ol>

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Los autores no tienen una asociación comercial u otra que pueda plantear un conflicto de intereses.

Se ha demostrado que las vacunas basadas en cápsulas son eficaces contra numerosos patógenos bacterianos, y muchas tienen licencia para su uso en seres humanos25,26,27. Estas vacunas funcionan mediante la generación de anticuerpos dirigidos a la cápsula y muchos de estos estudios utilizan el OPKA para mostrar las funciones opsono-fagocíticas de los anticuerpos13,14,...

El reconocimiento, la adherencia, la internalización y la degradación de un patógeno son parte integral de la fagocitosis1,una vía destacada en la respuesta inmune innata huésped descrita por primera vez por Ilya Metchnikoff en 18832,3. Los leucocitos fagocíticos, así como otras células del sistema inmunitario, son altamente discriminatorios en su selección de objetivos; son capaces de distinguir entre "yo infeccioso" y "yo no infeccioso" a través de patrones moleculares asociados a patógenos por su repertorio de receptores de reconocimiento de patrones (PRR)4,5. El reconocimiento del huésped de un patógeno también puede producirse con la unión de opsoninas huésped, como complemento y anticuerpos6. Este proceso, llamado opsonización, recubre el patógeno con estas moléculas, mejorando la internalización al unirse a los receptores opsónicos (por ejemplo, complemento y receptores Fc) en las células fagocíticas6. Para que un patógeno se adhiera a un fagocito, es necesaria la unión colectiva de múltiples receptores con sus ligandos de cognado. Sólo entonces la adherencia puede activar y sostener cascadas de señalización dentro de la celda host para iniciar la internalización6.
Debido a la importancia de la fagocitosis en el aclaramiento de patógenos y la prevención de infecciones, patógenos extracelulares han desarrollado numerosas maneras de subvertir este proceso para prolongar su supervivencia. Una estrategia de importancia es la producción de una cápsula polimérica aniónica (por ejemplo, polisacárido o poliaminoácido) que es anti-fagocítica en virtud de su carga, es poco inmunogénica, y protege moléculas en la envolvente bacteriana de los PRR6,7. Patógenos como Cryptococcus neoformans y Streptococcus pneumoniae tienen cápsulas compuestas de polímeros de sacárido, mientras que Staphylococcus epidermidis y algunas especies de Bacillus producen ácido poli-ɣ-glutámico (PGGA)7,8. Sin embargo, otros patógenos producen cápsulas que se asemejan al yo no infeccioso. Por ejemplo, Streptococcus pyogenes y una cepa patógena de B. cereus tienen una cápsula de ácido hialurónico que no sólo es anti-fagocítica, sino que también puede no ser reconocido como extraño por el sistema inmune9,10.
La conjugación de proteínas portadoras de cápsulas las convierte de antígenos pobres e independientes de T en antígenos altamente inmunogénicos dependientes de la T que pueden inducir títulos de anticuerpos anti-cápsula séricos altos11,12. Esta estrategia se emplea para vacunas autorizadas contra S. pneumoniae, Haemophilus influenzaey Neisseria meningitides11. Las actividades opsónicas de anticuerpos anti-cápsula han sido comúnmente evaluadas por ensayos de matanza opsono-fagocítica (OPKA)13,14,15,16. Estos ensayos prueban si los anticuerpos funcionales pueden desencadenar fagocitosis y matara 14. Sin embargo, el uso de OPKA con patógenos infecciosos, como agentes biológicos selectos de nivel 1 y toxinas (BSAT), incluido B. anthracis17,es peligroso y presenta riesgos para la seguridad; estos ensayos requieren un manejo exhaustivo de un agente selecto. El manejo de agentes seleccionados solo se puede realizar en laboratorios restringidos de bioseguridad nivel 3 (BSL-3); el trabajo en estas áreas exige procedimientos operativos prolongados debido a las numerosas precauciones de seguridad que deben seguirse. Los laboratorios BSL-3 tampoco suelen estar equipados con el equipo especializado utilizado para el trabajo opka, como microscopios y citómetros. Así, desarrollamos un ensayo alternativo basado en el uso de bacterias inactivadas18,19. Nos referimos a esto como un ensayo de opsono-adherencia (OAA) que no depende de la internalización y la eliminación de las salidas de ensayo; en su lugar, la adherencia de patógenos inactivados osonizados se utiliza como un índice de fagocitosis. Mecanicistamente, OAA es un sustituto adecuado porque la adherencia ocurre a priori y está íntimamente entrelazada con la internalización y la matanza intracelular. Desde una perspectiva de bioseguridad, OAA es preferible porque requiere un manejo mínimo de un agente infeccioso, es experimentalmente de menor duración que OPKA, y se puede realizar en laboratorios BSL-2 después de que se haya producido y transferido un stock del patógeno inactivado.
Demostramos la utilización de OAA para examinar la función opsónica de anticuerpos anti-cápsula que se encuentran en el sera de primates no humanos (NHP) vacunados con una cápsula conjugada [es decir, PGGA de B. anthracis conjugada al complejo proteico de membrana externa (OMPC) de Meningitidas Neisseria]20. Bacilos osonizados séricos fueron incubados con una línea celular de macrófago de ratón adherente, RAW 264.7. Después de la fijación, la monocapa celular y el bacilo adherente fueron imagenados por microscopía de fluorescencia. La adherencia bacteriana aumentó cuando los bacilos fueron incubados con suero de los NHP vacunados con la cápsula conjugada en comparación con el control sérico20. Adherencia correlacionada con la supervivencia del desafío de ántrax20,21. Por lo tanto, el uso de OAA caracterizó la función de los anticuerpos anti-cápsula y facilitó en gran medida las pruebas de nuestro candidato a la vacuna.

<table><tbody><tr><td>0,20 y micro; m filtro de jeringa (25 mm, celulosa regenerada)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>431222</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 10 mL (punta Luer-Lok)</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15&micro; 96 placas negras de pocillos (placa #1 para imágenes)</td><td>In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA</td><td>P96-1-N</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehído Ciencia de</td><td>la microscopía electrónica, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Matraz tratado con cultivo de tejidos de 75 cm</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Agar (polvo)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Complemento de conejo bebé</td><td>Cedarlane Labs, Burlington, NC</td><td>CL3441</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura Bacto</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>BBL Infusión de corazón y cerebro (BHI)</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Placas de agar sangre (TSA con sangre de oveja)</td><td>Remel, Lenexa, KS</td><td>R01198</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Sarstedt, Newton, NC</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 placas de cultivo celular de pocillos (placas # 2 y 3 para diluciones)</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio</td><td>Ciencia de microscopía electrónica, Hatfield, PA</td><td>72200-10</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de nutrientes</td><td>Difco BD, Sparks, MD</td><td>234000</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alta glucosa</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>11965-092</td><td>contiene 4500 mg/L de glucosa, 4 mM de L-glutamina, rojo de fenol</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Cell Imaging System (microscopio de fluorescencia)</td><td>Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>Suero</td> <td>fetal bovinoHyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>no irradiado con rayos gamma, no inactivado</td></tr><tr><td>por calor Isotiocianato de fluoresceína</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>F143</td><td></td></tr><tr><td>HCS Cell Mask Orange Cell Stain</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>hemocitómetro (Neubauer mejorado)</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinta china</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA</td><td>25030081</td><td>medio complementario con L-glutamina adicional de 2 mM</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U (microscopio compuesto invertido)</td><td>Nikon Instruments, Melville, NY</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin calcio ni magnesio</td><td>Lonza, Walkersville, MD</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina, 100x</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri (100 x 15 mm)</td><td>Falcon, Corning, Durham, NC</td><td>351029</td><td>para placas de agar</td></tr><tr><td>RAW 264.7 línea celular de macrófagos (Tib47)</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía de escaneo láser Zeiss 700 (microscopio confocal)</td><td>Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY</td><td>4109001865956000</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de adhesión a opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

El ensayo de opsono-adherencia es un ensayo funcional que enumera el apego de patógenos bacterianos a fagocitos profesionales. Debido a que la adherencia es necesaria para la fagocitosis y matar, el ensayo es un método alternativo a los ensayos de matanza opsono-fagocítico. Una ventaja del ensayo de opsono-adherencia es la opción de usar patógenos inactivados y líneas celulares de mamíferos, lo que permite la estandarización a través de múltiples experimentos. El uso de un patógeno inactivado en el ensayo también facilita el trabajo con agentes infecciosos de nivel 3 de bioseguridad y otros patógenos virulentos. En nuestro trabajo, el ensayo de adhesión al opsono se utilizó para evaluar la capacidad funcional de los anticuerpos, desde el sera de animales inmunizados con una vacuna a base de cápsulas de ántrax, para inducir la adherencia de Bacillus anthracis fijo a una línea celular de macrófago de ratón, RAW 264.7. La microscopía automatizada de fluorescencia se utilizó para capturar imágenes de bacilos adheridos a macrófagos. El aumento de la adherencia se correlacionó con la presencia de anticuerpos anti-cápsula en el suero. Los primates no humanos que presentaban altas concentraciones séricas de anticuerpos anti-cápsula estaban protegidos del desafío del ántrax. Por lo tanto, el ensayo de opsono-adherencia se puede utilizar para dilucidar las funciones biológicas de anticuerpos específicos de antígenos en sera, para evaluar la eficacia de los candidatos a la vacuna y otras terapias, y para servir como un posible correlato de inmunidad.

Esta sección muestra micrografos representativos recogidos durante un experimento de OAA junto con resultados que muestran que la OAA se puede utilizar para examinar la función biológica de los anticuerpos. Aquí, el ensayo se utilizó con éxito para evaluar la eficacia de un candidato a la vacuna contra el ántrax. Es fundamental verificar el estado de encapsulación en el bacilo, ya que la poca o ninguna encapsulación hace que se adhieran a las celdas del host, produciendo un fondo alto. La Figura 1</s...

El ensayo de adhesión a opsono es un método alternativo al ensayo de muerte opsonótico-fagocítico para evaluar las funciones opsónicas de los anticuerpos en el desarrollo de vacunas.

Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

El ensayo Opsono-Adherence analiza la presencia de anticuerpos oposónicos funcionales producidos en animales después de la vacunación, que se ha demostrado que se correlacionan con la eficacia de varias vacunas humanas autorizadas. Este ensayo es el preferido para su uso con agentes biológicos seleccionados y otros patógenos infecciosos y se puede realizar en un laboratorio BSL-1 o BSL-2 después de transferir el agente BSL-3 inactivado. Se ha demostrado que los anticuerpos contra cápsulas bacterianas, incluida la cápsula de Bacillus anthracis, son eficaces en modelos animales de infección.Los ensayos Opsono-Adherence evalúan funcionalmente los anticuerpos sin infectar a los animales. Siga todos los procedimientos de seguridad institucional cuando trabaje con cepas virulentas encapsuladas de Bacillus anthracis. Para este video, estamos usando una cepa inactivada bajo condiciones de bioseguridad de nivel dos .Comience este procedimiento con la preparación de las celdas RAW 264.7, como se describe en el protocolo de texto. Para colocar las células en la placa para el ensayo de opsonoadherencia, sustituya el matraz por medio fresco y utilice un raspador de células para raspar suavemente las células del matraz. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para romper los grupos de células y facilitar el recuento de células.Placa de 14.000 células por pocillo en una placa de fondo plano de vidrio de 0,15 micras de espesor de 96 pocillos. Deje que las células crezcan durante tres días, reemplazando el medio gastado un día antes de realizar la OAA. Después de tres días de incubación, el número de células debe ser de aproximadamente 50.000 células por pocillo.Para comenzar el ensayo, prepare una placa maestra de Bacillus anthracis a partir de un stock de esporas rayándola para aislarla en una placa de agar NBY. Para fines de demostración, se utilizó una placa de agar sangre de oveja. Incubar a 37 grados centígrados durante un día antes de cultivar en caldo.Luego, inocule 30 mililitros de caldo de cultivo en un matraz de 250 mililitros ventilado con varias colonias de los bacilos. Agitar el caldo de cultivo a 125 RPM, 37 grados centígrados, con 20% de CO2 y humedad durante 18 a 24 horas. Utilice la tinción negativa con tinta china para asegurar una encapsulación suficiente, y que los bacilos estén en cadenas cortas antes de la fijación.Para ello, mezcle cinco microlitros de suspensión bacteriana con dos microlitros de tinta china en un portaobjetos de microscopio. A continuación, coloque un cubreobjetos de uno o 1,5 micras de grosor encima de la suspensión sin crear burbujas. Observe la suspensión bacteriana usando una lente de objetivo de aceite de 40 a 100 veces en un microscopio óptico.Una cápsula gruesa excluye la tinta china. Asegúrese de que los bacilos estén encapsulados observando una zona de aclaramiento que rodee a cada bacteria. También asegúrese de que las cadenas de los bacilos sean cortas.Para determinar las Unidades Formadoras de Colonias, o UFC, diluya en serie 100 microlitros de cultivo de uno a 10 en solución de PBS, y diluciones de cultivo en placa en placas de agar sangre de oveja. Incubar de 12 a 18 horas a 37 grados centígrados. Cuente las UFC y determine el número de bacterias por mililitro de cultivo.Después de asegurarse de que los bacilos están suficientemente encapsulados, diluidos y plateados, fije el cultivo bacteriano restante agregando 10 mililitros de paraformaldehído al 16% a los 30 mililitros de cultivo a una concentración final de 4% de paraformaldehído. Transfiere el volumen a un tubo cónico de 50 mililitros. Luego, agite lentamente en una coctelera a temperatura ambiente durante siete días.Para probar la esterilidad, transfiera cuatro mililitros, o el 10% del volumen, de la suspensión bacteriana fija a un tubo cónico de 50 mililitros. Lave la suspensión agregando PBS y peletizando a un mínimo de 3000 G durante 45 minutos. A continuación, retire el sobrenadante, asegurándose de que no se altere el pellet esponjoso.Después de repetir este lavado al menos dos veces, vuelva a suspender la muestra fija en cuatro mililitros de PBS. Es necesario retirar todo el fijador durante los lavados para que el fijador no interfiera con las pruebas de viabilidad. Si es necesario, aumente el número de lavados.Para la prueba de viabilidad, inocule 40 mililitros de un medio de crecimiento bacteriano con cuatro mililitros de suspensión lavada e incube a 37 grados centígrados durante siete días. Verifique la densidad óptica a 600 nanómetros en un espectrofotómetro antes y después de siete días para medir la turbidez. Después de siete días de incubación en caldo de cultivo, coloque al menos 100 microlitros de caldo en una placa de agar e incube durante otros siete días.Si no se observa un aumento en la turbidez y no hay crecimiento en las placas, el cultivo original se considera estéril y puede transferirse a un laboratorio BSL-2. Siga las pautas institucionales para la aprobación de transferencias. Lave el caldo bacteriano inactivado tres veces en PBS para eliminar el fijador.Agregue la solución de FITC a una concentración final de 75 microgramos por mililitro. Agite lentamente la mezcla durante 18 a 24 horas a cuatro grados centígrados. Lave las bacterias como antes para eliminar el exceso de FITC.Después del lavado final, vuelva a suspender los bacilos en PBS en el mismo volumen inicial y almacene los bacilos a menos 20 grados centígrados hasta su uso. Inactivación por calor de un pequeño volumen de sueros de prueba de primates no humanos a 56 grados centígrados durante 30 minutos en una máquina de bloque de calor o PCR.Deje caer y lave las bacterias marcadas con FITC con PBS dos veces granulando a 15.000 veces G durante tres a cinco minutos. Vuelva a suspender en PBS en el mismo volumen de inicio. En una placa de fondo redondo de 96 pocillos, diluir en serie los sueros de prueba en el medio celular.En otra placa de fondo redondo de 96 pocillos, agregue 10 microlitros de sueros de prueba diluidos en cada pocillo. Luego, agregue 10 microlitros de complemento de conejo bebé recién reconstituido. Al plato número tres, agregue el volumen apropiado de bacilos marcados con FITC para una multiplicidad de infección de 20.Por ejemplo, a un volumen que contiene 50.000 veces 20 bacilos por 50.000 células. Rellene cada pocillo de la placa número tres con el volumen adecuado de medio celular hasta un total de 105 microlitros. Incubar la placa número tres a 37 grados centígrados durante 30 minutos en presencia de 5%CO2 con humedad para opsonizar los bacilos.Coloque la placa número uno, que contiene las celdas de adherencia, en un bloque de calor a 37 grados centígrados. Utilice un pipeteador multicanal para eliminar el medio gastado de los pocillos y reemplácelo rápidamente con 100 microlitros de bacterias opsonizadas de la placa número tres, asegurándose de que no se generen burbujas en los pocillos durante el pipeteo. Para no perturbar la monocapa de la celda, agregue volumen a los lados de los pocillos.Incubar la placa número uno a 37 grados centígrados con 5%CO2 y humedad durante 30 minutos para la adherencia. Lave cada pocillo cinco veces con 150 microlitros de PBS, encima del bloque de calor de 37 grados centígrados, para eliminar los bacilos sueltos. Pipetear a los lados de los pocillos para asegurarse de que las células no se dispersen accidentalmente durante el lavado.Agregue 150 microlitros de paraformaldehído al 4% a cada pocillo y fije las celdas durante una hora. Después de lavar las células dos veces con PBS, mezcle dos microlitros de tinción de células de naranja de cribado de alto contenido en 10 mililitros de PBS. A continuación, añada 150 microlitros de esta solución de tinción para fijar las células e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.Coloque la placa número uno en el escenario y concéntrese en las celdas utilizando campo claro o contraste de fase. En la pestaña Adquisición, seleccione Formato de 96 pocillos como configuración de la placa. A continuación, seleccione Configuración del canal.A continuación, seleccione la configuración en Modo de mosaico. Indique el número de imágenes que se van a adquirir. Cambie el modo de adquisición a blanco y negro o monocromo, y establezca la agrupación en al menos dos por dos.Encienda el enfoque automático o el módulo de enfoque. Indica la frecuencia con la que se debe realizar la función de enfoque automático. A continuación, active la función Z-Stack, si está disponible.Indica el número de Z-Stacks que capturarán el espesor de la monocapa celular y los bacilos adherentes. Designe una carpeta de archivos para guardar las imágenes. Ahora, ejecute el programa de imágenes automatizado.Realice la recopilación y el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. La cepa Ames de bacillus anthracis se tiñó negativamente con tinta china para examinar la encapsulación. Se debe verificar el estado de encapsulación, ya que la poca o ninguna encapsulación hace que se adhieran a las células huésped sin anticuerpos, produciendo un fondo alto.La intensidad de fluorescencia y las características de fotoblanqueo de los bacilos se examinaron mediante microscopía confocal. Es fundamental verificar que la fluorescencia de los bacilos no se desvanezca significativamente con el tiempo, ya que los bacilos se someterán a exposiciones prolongadas a la luz durante la toma de imágenes. Aquí se muestran las imágenes de proyección máxima de Bacillus anthracis adheridas a las monocapas celulares.Estos son campos de visión representativos que se contaron y puntuaron para el ensayo de opsonoadherencia. El aumento de la unión de los bacilos incubados con antisuero conjugado en cápsulas se debe a la presencia de anticuerpos anticápsulas que opsonizaron los bacilos. Los títulos séricos de los primates no humanos vacunados con 10 y 50 microgramos de conjugado en cápsula son significativamente más altos que los títulos de conjugado y cápsula solos.Estamos desarrollando un ensayo similar que utiliza citometría de flujo y neutrófilos humanos, que son células no adherentes, para medir la actividad opsónica y también para cuantificar la cápsula en la superficie de las bacterias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión del ensayo de opsonoadherencia. No olvide que trabajar con patógenos BSL-3 es extremadamente peligroso.Se deben seguir estrictamente las pautas institucionales y las precauciones de seguridad.

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Investigación

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Inmunología e Infección

El video muestra un ensayo de eliminación opsonofagocítica in vitro utilizando un cocultivo de neutrófilos humanos con Streptococcus pneumoniae. Los anticuerpos y las proteínas del complemento facilitan la opsonización de las bacterias, lo que permite a los neutrófilos reconocer y matar a las bacterias, mostrando una actividad opsonofagocítica exitosa de los neutrófilos.

Evaluación de la actividad de destrucción opsonofagocítica frente a patógenos bacterianos

Este vídeo muestra un ensayo de opsonoadherencia para examinar la interacción entre las bacterias opsonizadas y las células inmunitarias. Las bacterias marcadas con fluorescencia, tratadas con suero de prueba que contiene anticuerpos anticápsulas, se incuban con macrófagos. Después de teñir los macrófagos con fluorescencia, las bacterias adheridas a la superficie del macrófago se observan bajo un microscopio para su visualización.

Un ensayo de opsonoadherencia para evaluar la opsonización de bacterias encapsuladas por anticuerpos anticápsulas

Se presenta una nueva técnica para la visualización rápida de antígeno en una superficie bacteriana, que implica la Biotinilación superficial seguida por la exposición a las proteínas de interés en fusión con avidina monomérica. Carga del BCG con antígenos seleccionados con éxito mejora su inmunogenicidad, lo que sugiere que la decoración superficial puede sustituir los métodos genéticos tradicionales.

Expresión de antígenos exógenos en la vacuna de BCG de Mycobacterium bovis por genética no decoración de superficie con el sistema avidina-biotina

Aquí presentamos un elegante protocolo para la evaluación en vivo de la vacuna eficacia y anfitrión inmunorespuestas. Este protocolo puede ser adaptado para modelos de vacuna que estudian viral, bacteriana o parásitos patógenos.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Este ensayo de matanza opsonofagocítico se utiliza para comparar la capacidad de las células inmunitarias fagocíticas y matar bacterias basadas en diferentes tratamientos o condiciones. Clásicamente, este ensayo sirve como el estándar de oro para la evaluación de funciones efectoras de los anticuerpos contra una bacteria como opsoninas.

Opsonofagocítico asesinato ensayo para evaluar las respuestas inmunológicas contra patógenos bacterianos

Aquí, se presenta un protocolo simple para producir nanopartículas de ARNm basadas en polímeros de poli(beta aminoéster), fáciles de adaptar cambiando el ARNm encapsulado. También se describe el flujo de trabajo para sintetizar los polímeros, las nanopartículas y su caracterización esencial in vitro. También se agrega una prueba de concepto con respecto a la inmunización.

Síntesis y caracterización de nanopartículas de poli(beta aminoésteres) cargadas de ARNm con fines de vacunación

El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.

In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D

En la infección por Mycoplasma pneumoniae, las pruebas serológicas pueden generar buenos resultados, pero con baja especificidad debido a la reacción inmunológica cruzada. El ELISA interno de captura de antígeno, descrito en este documento, garantiza una alta especificidad de la especie y ha demostrado ser una prueba de detección confiable para el diagnóstico preciso de M. pneumoniae.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno para la detección específica de Mycoplasma pneumoniae

El presente protocolo prepara y evalúa las propiedades físicas, la respuesta inmune y el efecto protector in vivo de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión.

Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)

Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) 35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.

Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental

En este protocolo, desarrollamos un ácido retinoico (AR) encapsulado en nanoemulsión catiónica para ser utilizado como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de antígeno. Al agregar el AR aprobado por la FDA a la nanoemulsión, se promovió la sIgA específica del antígeno en la vagina y el intestino delgado después de la inyección intramuscular de la nanoemulsión.

Ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de OVA

Aprende el ensayo de adhesión opsonica para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra Bacillus anthracis y otros patógenos encapsulados. Este método seguro permite analizar la eficacia de anticuerpos sin infectar animales.

Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados (Video) | JoVE Journal

Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

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