Infusión y estimulación combinadas con voltamperometría cíclica de exploración rápida (CIS-FSCV) para evaluar la regulación del receptor del área tegmental ventral de la dopamina fásica

Este enfoque puede ayudar a dilucidar el papel del área tegmental ventral específica, los receptores somatodendríticos y la liberación fásica de dopamina en el núcleo accumbens. La principal ventaja de este enfoque es que las preguntas sobre el control de la función del receptor sobre la liberación fásica de dopamina se pueden abordar en el cerebro intacto. Optimizar la ubicación del microelectrodo de fibra de carbono y el estimulador bipolar puede ser un desafío, y algunos consejos para los principiantes son comenzar a grabar en el cuerpo estriado dorsal.

Debido al uso y la manipulación de múltiples tipos de electrodos, incluidos los electrodos de registro, referencia y estimulación, será útil una guía visual de cuándo y dónde se implantan estos electrodos. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal, limpie el cuero cabelludo de una rata anestesiada con tres exfoliantes secuenciales de yodopovidona y etanol al 70%. Después del último frotado, use pinzas de punta de aguja esterilizadas y tijeras quirúrgicas para cortar suficiente tejido del cuero cabelludo para dejar espacio para los electrodos implantados.

Limpie suavemente la superficie expuesta del cráneo con aplicadores de punta de algodón esterilizados antes de aplicar dos o tres gotas de peróxido de hidrógeno al 3% para ayudar a identificar lambda y bregma. A continuación, utilice una broca de un milímetro ajustada a aproximadamente 20.000 revoluciones por minuto para hacer un agujero de 1,5 milímetros de diámetro, 2,5 milímetros anterior y 3,5 milímetros lateral a la bregma. Implante un tornillo de 1,59 milímetros de diámetro exterior y 3,2 milímetros de largo aproximadamente hasta la mitad del orificio hasta que el tornillo esté firmemente en su lugar.

A continuación, perfore un orificio de electrodo de referencia de un milímetro de diámetro en el hemisferio izquierdo, 1,5 milímetros anterior y 3,5 milímetros lateral al bregma. Inserte aproximadamente dos milímetros de alambre de referencia en el orificio mientras envuelve el alambre alrededor y debajo de la cabeza del tornillo implantado. A continuación, implante completamente el tornillo, fijando el electrodo de referencia en su lugar.

En el hemisferio derecho, perfore un orificio de 1,5 milímetros de diámetro, 1,2 milímetros anterior y 1,4 milímetros lateral a la bragma, y use pinzas para quitar con cuidado la duramadre. Para el electrodo estimulante, perfore un orificio cuadrado de dos milímetros antero-posterior y cinco milímetros medial-lateral centrado a 5,2 milímetros posterior y un milímetro lateral al bregma. Usando barras estereotácticas para los brazos, baje la cánula guía del electrodo estimulante bipolar cinco milímetros por debajo de la duramadre.

Usando las barras estereotácticas del brazo, baje el microelectrodo de fibra de carbono cuatro milímetros por debajo de la duramadre en la porción más dorsal del cuerpo estriado y conecte el cable de referencia y la fibra de carbono a un potenciostato. A continuación, aplique una forma de onda triangular de menos 0,4 a 1,4 voltios, 400 voltios por segundo durante 15 minutos a 60 hercios, seguida de un estímulo de 10 minutos a 10 hercios. Para optimizar la ubicación del electrodo de estimulación, configure el estimulador para que produzca una forma de onda eléctrica bipolar con una frecuencia de 60 hercios, 24 pulsos, corriente de 300 microamperios y un ancho de pulso de dos milisegundos por fase.

Baje suavemente el estimulador en incrementos de 0,2 milímetros de 5 a 7,8 milímetros por debajo de la duramadre, estimulando el VTA en cada incremento. Continúe bajando la cánula guía de electrodos estimulantes bipolares hasta que una estimulación produzca la liberación fásica de dopamina en el microelectrodo de fibra de carbono dentro del cuerpo estriado dorsal. Una vez que se haya observado una liberación de dopamina, baje el microelectrodo de fibra de carbono hasta que esté al menos seis milímetros por debajo de la duramadre en la parte más dorsal del núcleo accumbens.

Cuando el electrodo esté en posición, estimule el VTA y registre la amplitud máxima del pico de dopamina, luego baje o eleve el microelectrodo de fibra de carbono al sitio que produce la mayor liberación de dopamina, asegurándose de que el pico de la respuesta de dopamina se represente como un pico de oxidación claro a 0,6 voltios y un pico de reducción a menos 0,2 voltios. Una vez que se haya optimizado la ubicación de la cánula guía de electrodos estimulantes y de fibra de carbono, estimule al animal cada tres minutos durante 20 a 30 minutos. Después de lograr una línea de base estable, baje suavemente la cánula interna con la mano en la cánula guía preinstalada en el estimulador bipolar y obtenga dos o tres registros de referencia adicionales para confirmar que la inserción de la cánula no causó un cambio en la señal evocada.

Una vez que se haya establecido una respuesta basal, use una bomba de jeringa y una microjeringa para infundir 0,5 microlitros de la solución del fármaco de interés en el VTA durante un período de dos minutos. Después de la infusión, deje la cánula interna en su lugar durante al menos un minuto antes de retirarla, continuando registrando la respuesta cada tres minutos para medir los efectos posteriores a la infusión. Como se demostró en estos gráficos de color representativos, la infusión de solución salina no altera la liberación de dopamina fásica estimulada.

La infusión de NMDA produce un aumento robusto en la liberación de dopamina fásica estimulada, mientras que el antagonista competitivo del receptor NMDA, AP5, produce una disminución robusta. Tanto el antagonista nicotínico no competitivo del receptor de acetilcolina, la mecamilamina, como el antagonista del receptor muscarínico competitivo no selectivo, la escopolamina, producen una fuerte disminución en la liberación de dopamina fásica estimulada. En este gráfico se puede observar un resumen de los efectos de los fármacos probados a lo largo del tiempo.

La cánula de infusión debe insertarse cuidadosamente en el electrodo estimulante bipolar. De lo contrario, puede producirse un daño excesivo, lo que provoca cambios artificéticos en la liberación fásica de dopamina. Este enfoque ha permitido a los investigadores abordar con mayor precisión los mecanismos específicos de los receptores por los que se regula la liberación fásica de dopamina in vivo.