Name: Modelado 3D de espinas dendríticas con plasticidad sináptica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprende modelado 3D computacional de espinas dendríticas usando Blender con CellBlender y MCell para simular plasticidad sináptica. Este método permite analizar el tráfico de receptores AMPA y estudiar mecanismos neuronales.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención de la Fundación Estatal de Ciencias de Sao Paulo (FAPESP) #2015/50122-0 e IRTG-GRTK 1740/2, por la subvención IBM/FAPESP #2016/18825-4, y por la subvención FAPESP #2018/06504-4.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Este artículo presenta un método para la construcción de mallas 3D para modelar procesos de plasticidad sináptica de reacción-difusión en un segmento dendrítico con espinas dendríticas. El modelo desarrollado contiene un segmento dendrítico con pocas espinas dendríticas. La difusión lateral y la reacción de los AMPAR con anclajes sinápticos permiten la simulación de la dinámica basal. Los pasos críticos en el protocolo son cortar la esfera para la creación de la parte superior de la cabeza de la columna vertebral (<stron...

La plasticidad sináptica se ha asociado con el aprendizaje y la memoria1. La plasticidad sináptica, como la potenciación a largo plazo (LTP) y la depresión a largo plazo (LTD), se asocia respectivamente con la inserción y eliminación de receptores AMPA (AMPAR) dentro y fuera de la membrana sináptica2. Las sinapsis AMPAR se encuentran en la parte superior de las estructuras de pequeño volumen llamadas espinas dendríticas3. Cada columna vertebral contiene una región densa de proteína en la membrana postsináptica llamada densidad postsináptica (PSD). Las proteínas de anclaje en los AMPAR de DSP en la región sináptica. Hay pocas copias de AMPAR dentro de una sola sinapsis y el tráfico y la reacción de AMPAR con otras especies en espinas dendríticas es un proceso estocástico2,,4. Existen varios modelos compartimentales de tráfico de receptores sinápticos en espinas dendríticas5,6,7,8. Sin embargo, hay una falta de modelos computacionales estocásticos del tráfico de AMPAR asociados con la plasticidad sináptica en las estructuras 3D de las dendritas y sus espinas dendríticas.
El modelado computacional es una herramienta útil para investigar los mecanismos subyacentes a la dinámica de sistemas complejos como la reacción-difusión de AMPAR en espinas dendríticas durante la aparición de plasticidad sináptica9,,10,,11,,12. El modelo se puede utilizar para visualizar escenarios complejos, variando parámetros sensibles y haciendo predicciones importantes en condiciones científicas que implican muchas variables que son difíciles o imposibles de controlarexperimentales 12,,13. Definir el nivel de detalle de un modelo computacional es un paso fundamental para obtener información precisa sobre el fenómeno modelado. Un modelo computacional ideal es un delicado equilibrio entre complejidad y simplicidad para capturar las características esenciales de los fenómenos naturales sin ser computacionalmente prohibitivo. Los modelos computacionales demasiado detallados pueden ser costosos de calcular. Por otro lado, los sistemas que están mal detallados pueden carecer de los componentes fundamentales que son esenciales para capturar la dinámica del fenómeno. Aunque el modelado 3D de espinas dendríticas es computacionalmente más caro que 2D y 1D, hay condiciones, como en sistemas complejos con muchas variables no lineales que reaccionan y difunden en el tiempo y el espacio 3D, para lo cual el modelado a un nivel 3D es esencial para obtener información sobre el funcionamiento del sistema. Además, la complejidad se puede reducir cuidadosamente para preservar las características esenciales de un modelo de menor dimensión.
En un sistema estocástico con pocas copias de una especie determinada dentro de un pequeño volumen, la dinámica media del sistema se desvían de la dinámica media de una gran población. En este caso, se requiere el modelado computacional estocástico de partículas difusoras de reacciones. Este trabajo introduce un método para el modelado estocástico de reacción-difusión de algunas copias de AMPAR en espinas dendríticas 3D. El propósito de este método es desarrollar un modelo computacional 3D de un segmento dendrítico con espinas dendríticas y sus sinapsis para modelar plasticidad sináptica.
El método utiliza el software MCell para resolver el modelo numéricamente, Blender para la construcción de mallas 3D, y CellBlender para crear y visualizar las simulaciones MCell, incluyendo la reacción-difusión espaciotemporal de moléculas en mallas 3D14,,15,,16. Blender es una suite para la creación de mallas y CellBlender es un complemento para el software base Blender. MCell es un simulador de Monte Carlo para la reacción-difusión de moléculas individuales17.
La razón de ser detrás del uso de este método consiste en modelar la plasticidad sináptica para lograr una mejor comprensión de este fenómeno en el entorno microfisiológico de las espinas dendríticas14. En particular, este método permite la simulación de potenciación homosináptica, depresión homosináptica y plasticidad heterosináptica entre espinas dendríticas14.
Las características de este método incluyen el modelado de la estructura geométrica 3D de la dendrita y sus sinapsis, la difusión por caminata aleatoria, y las reacciones químicas de las moléculas implicadas con plasticidad sináptica. Este método proporciona la ventaja de crear entornos enriquecidos para probar hipótesis y hacer predicciones sobre el funcionamiento de un sistema no lineal complejo con un gran número de variables. Además, este método se puede aplicar no sólo para el estudio de la plasticidad sináptica, sino también para el estudio de la reacción estocástica-difusión de moléculas en estructuras de malla 3D en general.
Alternativamente, las mallas 3D de estructuras dendríticas se pueden construir directamente en Blender a partir de reconstrucciones seriales de microscopio electrónico18. Aunque las mallas basadas en reconstrucciones en serie proporcionan estructuras 3D, el acceso a los datos experimentales no siempre está disponible. Así, la construcción de mallas adaptadas a partir de estructuras geométricas básicas, como se describe en el presente protocolo, proporciona flexibilidad para desarrollar segmentos dendríticos personalizados con espinas dendríticas.
Otro método computacional alternativo es la simulación a granel de reacciones bien mezcladas en un volumen regular9,10,11,19,20,21,22. Las simulaciones a granel son muy eficientes en la resolución de las reacciones de muchas especies dentro de un solo volumen bien mezclado23,pero el enfoque a granel es extremadamente lento para resolver la reacción-difusión de moléculas dentro de muchos voxels bien mezclados en una malla 3D de alta resolución. Por otro lado, el método actual que utiliza simulaciones MCell de reacción-difusión de partículas individuales funciona eficientemente en mallas 3D de alta resolución15.
Antes de utilizar este método, uno debe preguntarse si el fenómeno estudiado requiere un enfoque estocástico de reacción-difusión en una malla 3D. Si el fenómeno tiene pocas copias (menos de 1.000) de al menos una de las especies que reaccionan difuminando en una estructura geométrica compleja con compartimentos de pequeño volumen como espinas dendríticas, entonces el modelado estocástico de la reacción-difusión en mallas 3D es apropiado para la aplicación.
Hay varios pasos necesarios para construir un modelo computacional 3D de un segmento dendrítico que contiene espinas dendríticas con plasticidad sináptica. Los pasos principales son la instalación del software adecuado para la construcción del modelo, la construcción de una sola columna vertebral dendrítica que se utilizará como plantilla para crear múltiples espinas, y la creación de un segmento dendrítico que está conectado con múltiples espinas dendríticas. El paso para modelar la plasticidad sináptica consiste en insertar anclajes en la región PSD y AMPAR en el segmento dendrítico y espinas dendríticas. Luego, las reacciones cinéticas entre los anclajes situados en el PSD y los AMPAR se definen para producir especies complejas de anclaje-AMPAR que atrapan los AMPAR en la región sináptica. Respetuosamente, el aumento y la disminución de la afinidad entre los anclajes y los AMPAR sinápticos crean el proceso de LTP y LTD.

<table><tbody><tr><td>Blender</td><td>Fundación</td><td></td> Blender <td>https://www.blender.org/</td></tr> <tr><td>CellBlender</td><td>Universidad de Pittsburgh</td><td></td><td>https://mcell.org/</td></tr> <tr><td>Mcell</td><td>Universidad de Pittsburgh</td><td></td><td>https://mcell.org/</td></tr></tbody></table>

modelado 3d de espinas dendríticas con plasticidad sináptica

3D Modeling of Dendritic Spines with Synaptic Plasticity

El modelado computacional de la difusión y la reacción de las especies químicas en una geometría tridimensional (3D) es un método fundamental para entender los mecanismos de plasticidad sináptica en las espinas dendríticas. En este protocolo, la estructura 3D detallada de las dendritas y espinas dendríticas se modela con mallas en el software Blender con CellBlender. Las regiones sinápticas y extrasinápticas se definen en la malla. A continuación, el receptor sináptico y las moléculas de anclaje sináptica se definen con sus constantes de difusión. Por último, se incluyen las reacciones químicas entre los receptores sinápticos y los anclajes sinápticos y el modelo computacional se resuelve numéricamente con el software MCell. Este método describe la ruta espaciotemporal de cada molécula en una estructura geométrica 3D. Por lo tanto, es muy útil estudiar el tráfico de receptores sinápticos dentro y fuera de las espinas dendríticas durante la aparición de plasticidad sináptica. Una limitación de este método es que el alto número de moléculas ralentiza la velocidad de las simulaciones. El modelado de espinas dendríticas con este método permite el estudio de la potenciación homosináptica y la depresión dentro de espinas individuales y plasticidad heterosináptica entre las espinas dendríticas vecinas.

Estos resultados proporcionan los pasos para la construcción de una malla 3D que simula una columna vertebral dendrítica con la cabeza de la columna vertebral y el cuello de la columna vertebral(Figura 1 a Figura 4). Además, se pueden insertar múltiples espinas dendríticas en un solo segmento dendrítico (Figura 5) para estudiar la plasticidad heterosináptica de ampers14. El PSD en la parte superior de la cabe...

El protocolo desarrolla un modelo tridimensional (3D) de un segmento dendrítico con espinas dendríticas para modelar plasticidad sináptica. La malla construida se puede utilizar para el modelado computacional del tráfico de receptores AMPA en la plasticidad sináptica a largo plazo utilizando el programa de software Blender con CellBlender y MCell.

Modelado 3D de espinas dendríticas con plasticidad sináptica

Computational modeling of diffusion and reaction of chemical species in a three-dimensional (3D) geometry is a fundamental method to understand the ...

Modelado Geométrico 3D computacional de la reacción de especies químicas a través de la fusión. es un método útil para estudiar los mecanismos de tráfico de receptores dentro y fuera de la columna vertebral dendrítica está haciendo plasticidad sináptica. Esta técnica tiene la ventaja de crear un entorno enriquecido para hacer hipótesis y proyecciones sobre sistemas no lineales con un gran número de variables.Para crear una malla de una sola columna vertebral dendrítica con una cabeza de columna vertebral y un cuello de columna vertebral utilizando una esfera modificada. Primero abra Blender. Con Cell Blender ya instalado y pulse 5 en el teclado, para cambiar de la perspectiva a la vista ortogonal.Pulse 1 para cambiar a la vista frontal y pulse Mayús C para centrar el cursor. Para crear la cabeza de la columna vertebral, pulse Mayús A para abrir la paleta Malla y seleccione malla. Seleccione Esfera UV y en la opción Añadir esfera UV, establezca el tamaño en 0.25 y los anillos en 32.Para que la parte superior de la cabeza sea plana, pulse Tab para cambiar Blender del modo Objeto al modo De edición. Pulse B para seleccionar los tres cuartos superiores de la esfera y pulse Suprimir, seleccione Vértices e Intro para eliminar los vértices. Pulse B y seleccione la parte superior de la esfera.Pulse E, S, 0 y Intro para sellar la parte superior de los vértices aún seleccionados. Y mueva la flecha azul hacia abajo para alinearla a la parte superior de la cabeza de la columna vertebral. Para aumentar la resolución de malla en la parte superior de la columna vertebral, seleccione Herramienta y cuchillo y utilice el cuchillo para cortar un círculo alrededor del centro de la parte superior.Luego selecciona Corte de Herramienta y Bucle y desliza cuatro veces para crear cuatro círculos concéntricos alrededor del centro de la parte superior. Para crear el cuello de la columna vertebral pulse B y seleccione la parte inferior de la malla. Pulse Eliminar vértices y B y seleccione la parte inferior de la malla.Presione E y Z y seleccione menos 0,45 para crear una extrusión a la posición del eje Z, a menos 0,45 micro metros. Para que la malla sea compatible con la celda M, presione Ctrl T para triangular la malla y seleccione Herramienta y Eliminar dobles. Para crear una dendrita de varias columnas, pulse Mayús A para abrir la paleta Malla y seleccione Malla y Cilindro.En el menú Añadir cilindro, establezca el radio 0,3 micrómetros y la profundidad en dos micrómetros y pulse Intro. Pulse 3 para obtener una vista frontal del cilindro y pulse Z para que la malla sea transparente.Utilice la flecha normal azul para mover la base de la columna vertebral al interior del cilindro y haga clic con el botón derecho para seleccionar la Dendrita. Seleccione Modificador y Agregar modificador y seleccione Boolean, Operation Union y seleccione Object Spine. Haga clic en Aplicar para crear una malla de unión de la Dendrita y la columna vertebral.A continuación, utilice el ratón para seleccionar la malla de la columna vertebral aislada, cambiando la posición y el ángulo para insertar cada nueva columna vertebral en una posición fisiológica. Para crear AMPAR, seleccione Moléculas e inserte una nueva molécula. Cambie el nombre a AMPAR y cambie el tipo de molécula a Molécula de superficie.Luego cambie la constante de difusión 0.05 por 10 a los octavos centímetros cuadrados por segundo. Para trazar los anclajes enlazados a los AMPAR, en el PSD1 durante la condición basal, abra Configuración de salida de trazado y pulse para definir las moléculas. A continuación, establezca la molécula en Anchor_AMPAR, el objeto en dendrita y la región en PSD1.Para ejecutar una simulación de Condición basal, seleccione Ejecutar simulación. Y establezca las iteraciones en 30.000 y el paso de tiempo en una por 10 en menos tres segundos. Haga clic en Exportar y ejecutar y espere a que finalice la simulación.Al final de la simulación, seleccione Recargar datos de visualización, Reproducir animación, Trazar configuración de salida y trazar para visualizar los resultados temporales espaciales. Para ejecutar la condición de potenciación homosynáptica, seleccione Colocación de moléculas y rel_anchorLTP_psd1. Seleccione rel_anchorLTP_psd1 y cambie Cantidad a Liberar a 200.A continuación, cambie Cantidad a Liberar a cero. Seleccione rel_anchor_psd1. Cambie Cantidad para liberar a cero y ejecute la simulación como se acaba de demostrar.La plasticidad sináptica se puede verificar aproximadamente a través de cambios en el número de especies de AMPAR unidos a anclajes en cada columna vertebral. Para el cálculo exacto de la aparición de plasticidad sináptica. Se recomienda calcular la variación del número total de AMPAR anclados y libres en la sinapsis.La potenciación y la depresión homosinápticas AMPAR se pueden verificar a través de aumentos y disminuciones en el número de AMPAR anclados respectivamente, causados por cambios en la afinidad de ampanadores por anclajes en comparación con la condición basal. Por ejemplo, la inducción homosináptica a largo plazo a largo plazo en una sola columna vertebral, crea un efecto de depresión heterosináptica a largo plazo en las espinas vecinas. Después de este procedimiento, el modelo se puede ampliar para investigar el proceso de inducción de LTP y LTD en espinas dendríticas.Este método permite la prueba de hipótesis sobre el funcionamiento de sistemas no lineales complejos con un gran número de variables.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Numerosos estudios recientes han identificado mutaciones en las proteínas sinápticas asociadas a patologías cerebrales. Primaria neuronas corticales cultivadas ofrecen una gran flexibilidad en el examen de los efectos de estas proteínas asociadas a la enfermedad en la morfología y motilidad de la espina dendrítica.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Fuente: Gouder, et. al. Cuantificación tridimensional de espinas dendríticas a partir de neuronas piramidales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. J. Vis. Exp. (2015).Este video demuestra la obtención de imágenes y el análisis de espinas dendríticas en neuronas piramidales transducidas e inmunomarcadas mediante microscopía confocal. Se reduce el ruido de fondo y se rastrean las dendritas estimando su diámetro y longitud. La segmentación automatizada de la columna...

Cuantificación de espinas dendríticas mediante imágenes de microscopía confocal

En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo in vitro utilizando Estructurado Iluminación Microscopía (SIM). Super-resolución de la microscopía utilizando SIM ofrece una resolución de imagen de manera significativa más allá del límite de difracción de la luz en las tres dimensiones espaciales, lo que permite la obtención de imágenes de las espinas dendríticas individuales con detalles mejorados.

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Las espinas dendríticas son compartimentos postsinápticos de la mayoría de las sinapsis excitatorias. Las alteraciones en la morfología de la espina dendrítica ocurren durante el neurodesarrollo, el envejecimiento, el aprendizaje y muchos trastornos neurológicos y psiquiátricos, lo que subraya la importancia de un análisis confiable de la columna dendrítica. Este protocolo describe la cuantificación de la morfología de la espina dendrítica de forma precisa y reproducible utilizando un software...

Cuantificación de la columna dendrítica mediante un software automático de reconstrucción de neuronas tridimensional

Una de las características de la enfermedad de Alzheimer es la elevación de...

Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo

FRAP se ha utilizado para cuantificar la movilidad de la proteína verde fluorescente (GFP) de etiquetado proteínas en células cultivadas. Se examinaron las fracciones móviles / inmóviles de la GFP mediante el análisis del porcentaje de recuperación después de fluorescencia photobleaching. En este estudio, FRAP llevó a cabo en las espinas de las neuronas del hipocampo.

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

Este informe describe el uso de imágenes de células vivas y técnicas fotoblanquear para determinar la expresión en la superficie, las vías de transporte y la cinética de la trata de exógena expresó, sensible al pH las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en la membrana plasmática de las neuronas.

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Una técnica de imagen para el monitoreo de los cambios de potencial de membrana con una resolución temporal sub-micrométrico espacial y sub-milisegundos es descrito. La técnica, basado en una excitación láser de colorantes sensibles a voltaje, permite realizar mediciones de señales en los axones y colaterales axónicas, ramas terminales individuales dendríticas, y las espinas dendríticas.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

En este artículo presentamos micro-iontoforesis rápida de los neurotransmisores como técnica para investigar la integración de las señales postsináptica con alta precisión espacial y temporal.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

Aprende modelado 3D computacional de espinas dendríticas usando Blender con CellBlender y MCell para simular plasticidad sináptica. Este método permite analizar el tráfico de receptores AMPA y estudiar mecanismos neuronales.

Modelado 3D de espinas dendríticas con plasticidad sináptica

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