Fabricación de redes de nanotubos lipídicos multicomponente utilizando el ensayo de motilidad de quinesina deslizante
26 de julio de 2021
Este protocolo describe un proceso para fabricar redes de nanotubos lipídicos utilizando la motilidad de la quinesina deslizante junto con vesículas lipídicas unilamelares gigantes.
Este protocolo permite la generación simple de redes de nanotubos lipídicos a gran escala en las que los nanotubos individuales muestran un comportamiento de separación de fase similar al de la vesícula madre. La ventaja clave de este enfoque es que cooptamos el trabajo realizado por los motores moleculares para autoensamblar los nanotubos lipídicos de una manera altamente paralela y sin intervención humana. Para configurar un ensayo de motilidad deslizante, primero, coloque tres juegos de tiras de cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de vidrio a cinco milímetros de distancia.
Presione suavemente un trozo de cubierta sobre la cinta y agregue 30 microlitros de una solución de kinesina de un micromolar en la celda de flujo preparada. Después de cinco minutos, agregue 30 microlitros de una solución de microtúbulos de 10 microgramos / mililitros en la célula, presionando una toallita de laboratorio suavemente contra el extremo opuesto del canal de flujo para facilitar el intercambio de soluciones. Después de otra incubación de cinco minutos, lave la célula de una a tres veces con 50 microlitros de solución de motilidad a temperatura ambiente por lavado antes de agregar 30 microlitros de solución de estreptavidina de 10 microgramos / mililitro a la célula de flujo.
Después de 10 minutos, agregue 30 microlitros de una solución 10X GUV para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue dos microlitros de una solución AMP-PNP de 100 milimolares y cierre la cámara con sellador. Transfiera la cámara de flujo a un microscopio invertido para obtener imágenes y seleccione el conjunto de filtros adecuado.
Utilice un objetivo de aceite 100X para enfocar primero la superficie del resbalón de la cubierta antes de adquirir una imagen de una red de interés. A continuación, abra la imagen en ImageJ y haga clic en Imagen, Color y Compuesto para superponer los canales rojo y verde y crear una imagen compuesta. Después de obtener la imagen, abra la imagen de interés y haga clic en Analizar y establecer escala para calibrar la escala para el microscopio.
Rellene los píxeles hasta el factor de conversión de micrómetros y haga clic en Aceptar. Utilice la herramienta de línea multipunto para trazar los nanotubos a partir del GUV padre y mantenga pulsadas las teclas Control y M para medir la longitud. La herramienta de procesamiento de imágenes guardará cada nueva medición en la ventana de resultados. Cuando se hayan medido todos los tubos, seleccione Imagen, Ajustar y Umbral y haga clic en Aplicar para aplicar el umbral.
Luego, dibuje un rectángulo de longitud conocida sobre el tubo deseado. Para medir la densidad integrada del área, haga clic en Analizar y medir Para determinar la partición de lípidos en los nodos de nanotubos líquidos, utilice la herramienta de línea para dibujar una línea sobre el nodo de interés y mida la intensidad del nodo en los canales verde y rojo. En este análisis representativo, se fabricaron redes de nanotubos líquidos como se demostró para generar fases desordenadas y ordenadas por líquido, así como vesículas separadas por fases.
Por ejemplo, las vesículas sintetizadas con un 45% de lípidos saturados y un 55% de lípidos insaturados dan como resultado vesículas que se separan en fases líquidas y sólidas coexistentes. Sin embargo, si se incluye el colesterol, se puede observar la coexistencia líquido-líquido, creando GUV que se separan en fases coexistentes ordenadas por líquido y desordenadas por líquido. Además, se pueden observar nodos dentro de las mezclas separadas por fases.
Lo más importante a recordar es elegir el tiempo de exposición adecuado y el conjunto de filtros ND para poder visualizar los nanotubos lipídicos sin fotoblanquear los fluoróforos. Adaptar la composición del comportamiento de fase de los nanotubos lipídicos nos permite utilizar un sistema modelo minimalista para comenzar a estudiar la biofísica de los nanotubos de tunelización que conectan las células.
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Descripción general
Este protocolo permite la generación sencilla de redes de nanotubos lipídicos a gran escala utilizando la motilidad de quinesina deslizante. Los nanotubos individuales exhiben un comportamiento de separación de fases similar al de las vesículas progenitoras.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- biofísica
- Biología celular
Antecedentes
- Los nanotubos lipídicos son importantes para estudiar la dinámica de membranas.
- Los motores quinesina facilitan la autoensamblaje de estructuras lipídicas.
- La separación de fases en sistemas lipídicos puede revelar información sobre los procesos celulares.
- Este método mejora la escalabilidad de la producción de nanotubos.
Objetivo del estudio
- Para fabricar redes de nanotubos lipídicos de manera eficiente.
- Para utilizar motores moleculares en la autoensamblaje sin intervención humana.
- Para explorar el comportamiento de fase de los nanotubos lipídicos.
Métodos Utilizados
- Preparación de un ensayo de motilidad de deslizamiento utilizando quinesina y microtúbulos.
- Uso de cinta de doble cara para crear una celda de flujo sobre un portaobjetos de vidrio.
- Adición secuencial de soluciones de quinesina y microtúbulos.
- Lavado y adición de estreptavidina para facilitar la formación de nanotubos.
Resultados principales
- Generación exitosa de redes de nanotubos lipídicos.
- Demuestra el comportamiento de separación de fases en los nanotubos.
- Alta escalabilidad del método debido al uso de motores moleculares.
- Aplicaciones potenciales en el estudio de la dinámica de membranas y procesos celulares.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para fabricar nanotubos lipídicos.
- La utilización de motores de quinesina permite un autoensamblaje eficiente.
- Este enfoque puede impulsar la investigación en biología lipídica y dinámica de membranas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La fabricación rápida de redes de nanotubos lipídicos multicomponente utilizando el ensayo de motilidad de kinesina deslizante permite obtener modelos in vitro escalables y reproducibles para el transporte asociado a membranas y la biofísica lipídica. Este enfoque favorece el descubrimiento en etapas iniciales al proporcionar sistemas ajustables y biológicamente relevantes que imitan la complejidad de los tubos lipídicos celulares. El método mejora la confianza predictiva en estudios mecanicistas y en la selección de carteras en la investigación de terapias dirigidas a membranas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar mecanismos de transporte en membranas en un sistema controlado y ajustable.
- Posibilita la validación funcional de dianas moleculares implicadas en la dinámica y el transporte de lípidos.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la modelización de comportamientos de separación de fases y partición de lípidos.
- Ofrece una plataforma para la comprobación de hipótesis sobre interacciones entre lípidos y proteínas relevantes para las vías de enfermedades.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una preparación reproducible y escalable de redes de nanotubos lipídicos para ensayos posteriores.
- Permite la medición cuantitativa de la longitud, anchura y partición de lípidos en los nanotubos para la estandarización del ensayo.
- Posibilita la generación rápida de sistemas lipídicos complejos utilizando equipos de laboratorio estándar.
- Facilita el cribado de compuestos que afectan la estructura de la membrana o los procesos de transporte.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Proporciona un modelo relevante para la enfermedad que permite estudiar los nanotúbulos de túnel implicados en la comunicación intercelular.
- Se alinea con el descubrimiento de biomarcadores traslacionales al permitir el análisis del comportamiento de fase lipídica y su partición.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de intervenciones dirigidas a la membrana.
- Reduce la ambigüedad biológica en la selección de modelos preclínicos para compuestos activos sobre membranas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde estudios mecanicistas iniciales hasta el desarrollo de modelos preclínicos para dianas asociadas a membranas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en el transporte y la señalización mediados por lípidos.
- Selección: Proporciona redes de nanotubos lipídicos listas para ensayos, reproducibles y con propiedades ajustables.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa de las dimensiones de los nanotubos y la partición de lípidos para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta los conocimientos mecanicistas in vitro con fenómenos de membrana relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y escalable, adaptable a múltiples programas de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de biología de membranas.
- Valor operativo: Agiliza la fabricación, estandarización y reproducibilidad de sistemas lipídicos complejos.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en carteras dirigidas a membranas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos activos sobre membranas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biofísica de lípidos y microscopía de fluorescencia para el análisis cuantitativo.
- Necesita instrumentación de laboratorio estándar para el ensamblaje de la celda de flujo y la adquisición de imágenes.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de adquisición de imágenes y mediciones.
- Adaptable a una variedad de composiciones lipídicas y sistemas modelo para satisfacer diversas necesidades de investigación.
- Depende del control cuidadoso de los parámetros de adquisición de imágenes para evitar el fotoblanqueo del fluoróforo.
