Name: Muestreo y análisis de señales de olor animal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Aprenda a muestrear y analizar señales de olor animal mediante microextracción en fase sólida y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Este método permite identificar compuestos volátiles clave en la comunicación química de especies como lémures y babuinos.

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Agradecemos a Keith Holding por su asistencia con los análisis químicos en el Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, y a Ben Mantle por la producción del video. También estamos agradecidos al Prof. Gloriano Moneti, al Dr. Giuseppe Pieraccini y a los miembros del Centro de Espectrometría de Masas de la Universidad de Florencia, Florencia, y al Prof. Luca Calamai y al Dr. Marco Michelozzi del Laboratorio ARCA del CNR, Florencia, por su ayuda en la creación de esta metodología. Los proyectos de investigación que incluían los métodos de muestreo y análisis descritos en el manuscrito fueron apoyados por dos becas intraeuropeas Marie Skłodowska-Curie (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), una pequeña subvención ('El primate enriquecido sensorial') de la Sociedad de Primates de Gran Bretaña, y una pequeña beca de investigación ('¿Tienen los cazadores-recolectores un sentido especial del olfato?') de la Academia Británica/The Leverhulme Trust a S.V. El trabajo de laboratorio necesario para establecer esta metodología también recibió financiación del Concurso Anual de Financiación de la Facultad de Ciencias e Ingeniería (Wolverhampton) a S.V.

1. Recogida de muestras
<ol><li>Olores de muestra que son uno de los siguientes:<ol>
<li>Recolectar liberadas espontáneamente por sujetos de estudio habituados (por ejemplo, primates de zoológicos) a través de la marca de olores en papel de filtro estéril (por ejemplo, secreciones de olor de glándulas olfativas) o directamente en viales (por ejemplo, orina).</li>
		<li>Recoger frotando hisopos de algodón estériles después de la formación de los sujetos de estudio mediante el uso de entrenamiento de refuerzo positivo.</li>
		<li>Recoger frotando hisopos de algodón estériles después de la sedación de los sujetos de estudio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque las muestras en viales estériles de vidrio transparente taponados con tapa de tornillo de 10 ml y selle con tapas rematadas con tornillo que incorporen septos FTFE / silicona. Guárdelos inmediatamente a -20 °C. NOTA: Es vital usar equipos de protección personal limpios, como guantes de nitrilo; cambiarlos con frecuencia; evitar el contacto directo de la piel con muestras y viales. Se prefiere utilizar viales nuevos; sin embargo, en el caso de viales usados, es vital pre-limpiar los viales, y luego usar el mismo protocolo.</li>
	<li>Tome espacios en blanco ambientales cada vez que se recogen marcas de olor. Por ejemplo, recopile los medios de muestreo (por ejemplo, papel de filtro o hisopo) y un vial de espacio de cabeza que están expuestos al medio ambiente mientras se realiza el muestreo.</li>
</ol>2. Preparación de la muestra
<ol><li>Prepare las muestras en el campo cortando con una cuchilla un cuadrado aproximado de 10 milímetros de un papel de filtro olor-marcado, o la cabeza del hisopo, y colocándolo en un frasco tornillo-atornillado-tapado del espacio de la cabeza.</li>
	<li>Después de que cada muestra haya sido preparada, deseche o limpie la cuchilla utilizada para cortar el medio de muestreo utilizando una toallita antibacteriana apropiada y/o alcohol y séquela bien.</li>
	<li>Almacene todas las muestras a -20 °C. NOTA: Se prefiere a -20 °C o de lo contrario tan bajo como sea posible en la práctica en el campo.</li>
</ol>3. Preparación para el análisis
<ol><li>Retire las muestras del congelador y deje que se calienten naturalmente a temperatura ambiente durante al menos 1 h.</li>
	<li>Configure el método analítico en el GC-MS de la siguiente manera:<ol>
<li>Para las condiciones de análisis de SPME, siga las instrucciones del fabricante para acondicionar las fibras SPME antes del primer uso: pre-condición de la fibra (260 °C durante 5 min), incubación de la muestra (40 °C durante 2 min), tiempo de extracción (15 min), tiempo de desorción (2 min) y post-condición de la fibra (260 °C durante 20 min).</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de GC: columna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), temperatura del inyector (270 °C), caudal (1 mL/min), modo de inyección (sin división), perfil de horno GC (45 °C durante 2 min; 4 °C/min a 170 °C; 20 °C/min a 300 °C), línea de transferencia MSD (280 °C). Nota : para mejorar entre la coherencia de tiempo de retención de la muestra el método analítico es el tiempo de retención bloqueado).</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones msd: retardo del disolvente (2,5 min) y rango de exploración (29 a 400 amu). NOTA: Enprotocolosanteriores se utilizó un rango de 10 a 400.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asegúrese de que el suministro de gas de purga a la unidad de acondicionamiento de fibra esté encendido. NOTA: Es vital que el conjunto SPME esté instalado correctamente en el muestreador automático y que esté alineado con las bandejas del muestreador automático, la unidad de acondicionamiento de fibra y el puerto de entrada GC. La alineación incorrecta podría resultar en daños o destrucción de la fibra SPME.</li>
</ol>4. Análisis
<ol><li>Coloque un vial vacío en el espacio de la cabeza (para que actúe como un sistema en blanco) en la primera posición de la bandeja del muestreador automático GC-MS. Coloque el espacio en blanco del ambiente en la segunda posición de la bandeja del muestreador automático. Coloque las muestras para su análisis en las posiciones posteriores de la bandeja de muestra automática.</li>
	<li>Cree una secuencia analítica para analizar cada muestra dentro de la bandeja de muestras.<ol>
<li>En la pantalla de inicio de MassHunter, seleccione Sequence | Secuencia de carga.</li>
		<li>Complete la tabla de secuencias para todos los espacios en blanco y muestras insertando la información adecuada. Guarde la tabla de secuencia completada. Nota : la información exacta de la tabla de secuencia dependerá de los laboratorios de formato para la tabla. La información mínima normalmente incluiría el tipo de muestra, el nombre de la muestra, la ubicación y el número del vial, el método analítico y la ubicación y el nombre del archivo de datos (la asignación de un nombre de archivo de datos que coincida con el nombre de la muestra ayuda al procesamiento de datos futuro). Se pueden agregar muestras adicionales a la secuencia durante el análisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute la secuencia seleccionando Secuencia | Secuencia de ejecución.</li>
	<li>Después del análisis, devuelva las muestras al congelador lo antes posible. NOTA: puede ser posible volver a analizar las muestras, pero debe tenerse en cuenta que algunos componentes volátiles pueden haber sido totalmente extraídos durante el análisis inicial y algunos compuestos pueden haber sufrido descomposición térmica y bacteriana a 40 °C, por lo que el cromatograma resultante puede no ser completamente representativo del marcado de olor original.</li>
</ol>5. Análisis de datos
NOTA: El análisis inicial de los datos incluye la integración de cromatogramas para obtener datos de tiempo de retención y área de pico junto con la identificación tentativa de picos utilizando el software ChemStation y las bases de datos espectrales de masas NIST (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología), versión MSD F.01.01.2317. El análisis de datos se puede llevar a cabo manualmente o a través de un método semiautomatizado. Si se utiliza el método semiautomatizado, a veces es beneficioso realizar un grado de análisis manual de datos para verificar las identificaciones tentativas.
<ol><li>Abra el archivo de datos haciendo clic en el archivo apropiado en la barra de navegación de la izquierda. El cromatograma iónico total (TIC) se mostrará en la ventana superior de la pantalla de análisis de datos.</li>
	<li>Para integrar las TIC mediante el integrador RTE, seleccione Cromatograma | Integrar.</li>
	<li>Ajuste los parámetros de integración para que se integren los picos que son mayores que 3 x ruido de línea de base. Seleccione | cromatograma Parámetros de integración de ms signal. En el cuadro de salida, ajuste el área de pico mínima según corresponda (1.0 produce resultados aceptables en nuestros ejemplos).</li>
	<li>Para identificar picos y generar un informe de resumen, seleccione Exportar informes | Informe de resultados de búsqueda de biblioteca a XLS. NOTA: Las bibliotecas espectrales que se buscarán junto con el número de coincidencias de biblioteca que se mostrarán deben estar preestablecidas dentro del software antes de que se pueda realizar una búsqueda en la biblioteca.</li>
	<li>El informe de hoja de cálculo resultante contiene datos de integración para cada pico y una coincidencia de biblioteca espectral tentativa para asignar la identidad. Normalmente, la coincidencia calidad de biblioteca/biblioteca debe ser >80 para aceptar la identificación provisional. Guarde la hoja de cálculo.</li>
	<li>Identifique un pico directamente desde el TIC.<ol>
<li>Elija el pico de interés.</li>
		<li>Si el pico es pequeño, acerque dibujando un cuadro alrededor del pico manteniendo presionado el botón izquierdo del ratón, estire el cuadro sobre el pico y suéltelo.</li>
		<li>Coloque la línea del cursor para que esté en el punto más alto del pico (o justo después).</li>
		<li>Haga doble clic en el botón derecho del ratón y el espectro de masa para el pico aparecerá en la ventana inferior de la pantalla de análisis de datos.</li>
		<li>Para buscar en la biblioteca espectral, mueva el cursor a cualquier lugar de la ventana espectral y haga doble clic en el botón derecho del ratón. Los resultados de la búsqueda de la biblioteca aparecerán en una nueva ventana.</li>
		<li>Para eliminar el ruido de fondo de un espectro de interés, primero haga doble clic en el botón derecho del ratón en el pico en cuestión. A continuación, haga doble clic en el botón derecho del ratón en un área sin picos inmediatamente delante del pico de interés. Seleccione | cromatograma Restar espectros. El espectro restado se mostrará en la ventana inferior de la pantalla de análisis de datos y mostrará '(-)' junto a los datos de SCAN en el encabezado de la ventana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWyatt%2C+TD+%22Pheromones+and+Animal+Behavior%3A+Chemical+Signals+and+Signatures%22">Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).</li>
<li>Heymann, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+sense-olfaction+in+primate+behavior%2C+ecology%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution.</a> American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).</li>
<li>Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22secret%22+in+secretions%3A+Methodological+considerations+in+deciphering+primate+olfactory+communication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication.</a> American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).</li>
<li>Vaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sternal+gland+scent-marking+signals+sex%2C+age%2C+rank+and+group+identity+in+captive+mandrills%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills.</a> Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).</li>
<li>Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dung+odours+signal+sex%2C+age%2C+territorial+and+oestrous+state+in+white+rhinos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).</li>
<li>Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+phylogenetic+signal+in+milliped+chemical+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Systematics+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses.</a> Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).</li>
<li>Kimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+substances+in+feces%2C+urine+and+urine-marked+feces+of+feral+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses.</a> Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).</li>
<li>Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+signals+during+pregnancy%3A+a+possible+chemical+basis+for+mother-infant+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+of+scent-gland+secretions+in+an+Old+World+monkey+%28Mandrillus+sphinx%29%3A+influence+of+sex%2C+male+status%2C+and+individual+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity.</a> Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+signals+MHC+genotype+in+an+Old+World+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Odour signals MHC genotype in an Old World monkey.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).</li>
<li>Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawliszyn%2C+J+%22Solid+phase+microextraction%3A+theory+and+practice%22">Solid phase microextraction: theory and practice</a>. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).</li>
<li>Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+scent-marking+in+captive+red-ruffed+lemurs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs.</a> American Journal of Primatology. 81 (1), 22951(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de muestras de control, tanto los controles ambientales creados en el momento de la recolección de muestras como los espacios en blanco del sistema, son cruciales para la interpretación de las muestras de marcas de olor. Los picos atribuidos al entorno de muestreo o al sistema instrumental deben excluirse de las muestras de marcas de olores para que solo los picos de interés se incluyan en cualquier interpretación. Estos controles también pueden desempeñar un papel en la evaluación y supervisión de la "salud" de l...

Se sabe muy poco acerca de los cambios químicos que sustentan las señales olfativas en animales1, también debido a los desafíos metodológicos en el registro y cuantificación de perfiles químicos volátiles de olores2. Hay varios escollos potenciales cuando se trabaja con matrices químicas altamente complejas; estos incluyen al tomar muestras y analizar las muestras de olor3.
En el Rosalind Franklin Science Center de la Universidad de Wolverhampton, estamos llevando a cabo el análisis de olores y marcas de olor para comprender cómo pueden ser utilizados por los animales. Combinamos la semioquímica con la ecología del comportamiento, la endocrinología y la citología para mejorar nuestra comprensión del papel que desempeñan las señales olfativas en la comunicación animal.
Hemos desarrollado una metodología y luego analizado olores y marcas de una variedad de especies, incluidos varios primates no humanos (es decir, lémures coronados, lémures de volantes rojos, macacos japoneses, babuinos olivares, chimpancés) y otros mamíferos (es decir, gatos, vacas). Hemos recogido y analizado una variedad de muestras, incluyendo orina, heces, cabello y secreciones de olor de glándulas olfativas. Estos olores y marcas de olor consisten en mezclas complejas de compuestos y, por lo tanto, cualquier metodología utilizada para su análisis debe incluir alguna forma de técnica de separación. Como se ilustra, también se producen en una serie de matrices que requiere el uso de técnicas para extraer los componentes de interés.
Estudios previos de Vaglio et al.4 y otros autores5 utilizaron la extracción dinámica del espacio de cabeza (DHS) con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), mientras que la extracción directa con disolvente6 y las extracciones complejascon disolventes 7 también se han utilizado. En particular, el muestreo dinámico del espacio de cabeza implica purgar el espacio de cabeza con un volumen conocido de gas inerte que, en última instancia, elimina todos los compuestos volátiles con la excepción de aquellos que muestran una fuerte afinidad por la matriz de la muestra (por ejemplo, compuestos polares en muestras acuosas).
Para la metodología actual, hemos adoptado la técnica de microextracción en fase sólida del espacio de la cabeza (HS-SPME) junto con GC-MS. En particular, hemos desarrollado y mejorado la metodología ya utilizada por Vaglio et al. en su anterior laboratorio GC-MS8,9,10.
Las técnicas de extracción sin solventes son muy efectivas para analizar compuestos pequeños y altamente volátiles (que de lo contrario se pueden perder fácilmente de una muestra) porque estos métodos inmovilizan los compuestos en un soporte de fase estable y sólido. El HS-SPME utiliza una fibra recubierta con un polímero adsorbente para capturar compuestos volátiles en el espacio de la cabeza de la muestra o para extraer compuestos disueltos por inmersión en un fluido biológico acuoso11. La capa del polímero no ata los compuestos fuertemente, por lo tanto calentando en el puerto de la inyección de la CROMATOGRAFÍA GASEOSA pueden ser quitados. Este método es más potente que las técnicas de extracción con disolventes y también más eficaz que el DHS.
En el enfoque actual, las muestras están contenidas dentro de viales de vidrio. Estos viales se calientan a una temperatura de 40 °C para simular la temperatura corporal del animal con el fin de promover que los componentes volátiles de la marca de olor ocupen el espacio de la cabeza del vial. Una fibra SPME, recubierta con 65 μm de material sorbente de polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB), se expone al entorno del espacio de la cabeza y los componentes volátiles de la muestra se adsorben en la fibra. Al calentar la fibra en el puerto de entrada de un GC-MS, los componentes volátiles se desorben de la fibra y luego se separan por el GC. Los patrones de fragmentación espectral de masa se obtienen para cada componente utilizando la EM. Mediante la comparación de estos espectros de masas con las bases de datos espectrales de masas, puede ser posible identificar tentativamente los componentes de la marca de olor. A través del uso de un auto-muestreador, somos capaces de analizar múltiples muestras en lotes de una manera consistente.
Dado que cada tipo de fibra SPME tiene una afinidad diferente con los productos químicos polares, la fibra generalmente se elige dependiendo de la polaridad y / o peso molecular de los compuestos químicos objetivo. Además, las condiciones de GC se cambian dependiendo del tipo de columna gc y las características de los compuestos químicos objetivo.
Esta técnica permite el análisis semicuantitativo de los componentes volátiles de las marcas de olores al permitir la separación e identificación tentativa de los componentes en la muestra, seguida del análisis de las relaciones de área de pico para buscar tendencias que podrían significar componentes de la marca de olores que pueden estar involucrados en la señalización.
Los puntos fuertes clave de este enfoque actual son:
<ul style="list-style-type: square;"><li>El rango de tipos de muestra que se pueden analizar.</li>
	<li>No se requiere preparación de muestras complejas ni extracciones.</li>
	<li>La capacidad de analizar componentes volátiles.</li>
	<li>La capacidad de separar los componentes de una mezcla.</li>
	<li>Poder identificar los componentes detectados.</li>
	<li>La capacidad de proporcionar información semicuantitativa y potencialmente cuantitativa sobre los componentes detectados.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>Viales de muestreador automático de 10 ml</td><td>Agilent</td><td>5188-5392</td><td>Viales de rosca de 10 ml con</td></tr><tr><td>tapones de vial de 18 mm</td><td>Agilent</td><td>8010-0139</td><td>Magnético con tabiques de PTFE/silicona</td></tr><tr><td>Muestreador automático</td><td>Agilent</td><td>GC120 PAL Columna</td><td></td></tr><tr><td>capilar</td><td>Agilent</td><td>HP5-MS</td><td>30 m x 0,25 mm; 0,25 y micro; m</td></tr><tr><td>Software de análisis de datos</td><td>Agilent-ChemStation</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cromatógrafo de gases</td><td>Agilent</td><td>7890B</td><td></td></tr><tr><td>Septos de entrada</td><td>Agilent</td><td>5182-3442</td><td>Merlin microseal</td></tr><tr><td>Detector selectivo de masas</td><td>Agilent</td><td>5977A Software de</td><td></td></tr><tr><td>informes</td><td></td> <td>Microsoft-Excel</td><td></td></tr> <tr><td>Biblioteca espectral</td><td>NIST</td><td>-</td><td>Biblioteca espectral de masas NIST/EPA/NIH Programa</td></tr><tr>de<td>búsqueda de bibliotecas espectrales</td><td>NIST-MS</td><td></td> <td>Search v.2.2</td></tr><tr><td>Liner de entrada sin división</td><td>Agilent</td><td>5190-4048</td><td></td></tr><tr><td>Fibras SPME</td><td>Agilent</td><td>SU57345U</td><td>65 &micro; m Fibra PDMS/DVB</td></tr></tbody></table>

muestreo y análisis de señales de olor animal

Sampling and Analysis of Animal Scent Signals

Hemos desarrollado una metodología eficaz para el muestreo y análisis de señales de olor, mediante el uso de microextracción en fase sólida del espacio de la cabeza junto con cromatografía de gases-espectrometría de masas, para entender cómo se pueden utilizar en la comunicación animal. Esta técnica permite el análisis semicuantitativo de los componentes volátiles de las secreciones de olores al permitir la separación e identificación tentativa de los componentes de la muestra, seguido del análisis de las relaciones de área de pico para buscar tendencias que pudieran significar compuestos que pudieran estar involucrados en la señalización. Las fortalezas clave de este enfoque actual son el rango de tipos de muestras que se pueden analizar; la falta de necesidad de cualquier preparación o extracción de muestras complejas; la capacidad de separar y analizar los componentes de una mezcla; la identificación de los componentes detectados; y la capacidad de proporcionar información semicuantitativa y potencialmente cuantitativa sobre los componentes detectados. La principal limitación de la metodología se refiere a las propias muestras. Dado que los componentes de interés específico son volátiles, y estos podrían perderse fácilmente, o alterar sus concentraciones, es importante que las muestras se almacenen y transporten adecuadamente después de su recolección. Esto también significa que las condiciones de almacenamiento y transporte de muestras son relativamente costosas. Este método se puede aplicar a una variedad de muestras (incluyendo orina, heces, cabello y secreciones de olor de glándulas olfativas). Estos olores consisten en mezclas complejas, que ocurren en una gama de matrices, y por lo tanto requieren el uso de técnicas para separar los componentes individuales y extraer los compuestos de interés biológico.

Siguiendo este protocolo, identificamos tentativamente un total de 32 compuestos químicos volátiles a partir del análisis de 14 marcas de olor ano-genitales liberadas espontáneamente en papel de filtro por lémures rojizos(Varecia variegata rubra)y comparamos perfiles de olor con características del señalizador12. Los compuestos volátiles naturales, tales como hidrocarburos, terpenos, alcoholes del terpeno y cetonas, estaban presentes dentro de estos perfiles e incluyeron los compuestos qu...

Hemos desarrollado una metodología eficaz para el muestreo y análisis de señales de olor con el fin de comprender cómo se pueden utilizar en la comunicación animal. En particular, utilizamos la microextracción de fase sólida del espacio de la cabeza junto con la cromatografía de gases y la espectrometría de masas para analizar los componentes volátiles de los olores y las marcas de olor de los animales.

Muestreo y análisis de señales de olor animal

We have developed an effective methodology for sampling and analysis of odor signals, by using headspace solid-phase microextraction coupled with gas ...

El papel desempeñado por el olor en la comunicación animal está actualmente subestimado y, por lo tanto, poco estudiado. En particular, se sabe muy poco sobre los cambios químicos que sustentan las señales olfativas en animales, incluidos los seres humanos. Y esto se debe también a los desafíos metodológicos, registrando y cuantificando los compuestos químicos de olores utilizados por los animales para comunicarse.Hay varios desafíos potenciales cuando se trabaja con mezclas químicas altamente complejas y estos incluyen también al tomar muestras y analizar las muestras de olores. Estamos llevando a cabo el análisis de los olores utilizados por los animales con el fin de entender cómo pueden ser utilizados por ellos cuando se comunican entre sí. Combinamos citoquímica con endocrinología bioecología y citología para mejorar nuestra comprensión del papel desempeñado por el olor en la comunicación animal.Para nuestra metodología actual en Wolverhampton, hemos adoptado la técnica de la microestructura de fase sólida Headspace junto con la espectrometría de masas cromatografía de gases, construida sobre y una metodología invisible de la se utilizan en el pasado. Los olores de muestra se recogen de una de las siguientes maneras. Uno, los olores espontáneamente lanzados de la muestra de temas habituados del estudio.Por ejemplo, los primates del zoológico recogen las secreciones del olor de la glándula del olor por la marca del olor en el papel de filtro estéril o las muestras de orina directamente en los frascos. Dos, después de entrenar a los sujetos del estudio mediante el uso de refuerzo positivo recoger las secreciones de olor frotando la mirada de olor con hisopos de algodón estériles. Tres, después de la sedación de los sujetos del estudio recoger las secreciones de olor frotando las glándulas olfativas con hisopos de algodón estériles, por muestras en estériles 10 mililitro tornillo tapado, viales de vidrio transparente y sello con tapas rematadas de tornillo que incorporan P T F E sector de silicona.Guarde inmediatamente los viales a menos 20 grados Centígrados. Tenga en cuenta que es vital que se use equipo de protección personal limpio, como guantes de nitrilo, durante el muestreo. Los guantes de cambio con frecuencia evitan el contacto directo de la piel con muestras y viales.Se prefiere utilizar viales nuevos. Sin embargo, en el caso de viales usados, es vital pre-limpiar los viales, y luego usar el mismo protocolo. Tome espacios en blanco ambientales cada vez que se recogen marcas de olor.Haga esto exponiendo un papel de filtro no utilizado o un hisopo de algodón y viales al medio ambiente mientras se realiza el muestreo. Las muestras se preparan en el campo. Para un olor marcado papel de filtro cortar un cuadrado aproximado de 10 milímetros del papel y colocar en un tornillo de 10 mililitros rematado vial de espacio de la cabeza.Para un hisopo, corte la cabeza del hisopo en el extremo del eje del hisopo y colóquelo en un vial de espacio de la cabeza. Después de que cada muestra haya sido preparada desechar o limpiar la cuchilla de uso para cortar el medio de muestreo, con una toallita antibacteriana adecuada y o alcohol y secar bien. Guarde todas las muestras a menos 20 grados centígrados.Tenga en cuenta que las muestras deben almacenarse a menos 20 grados centígrados, sin embargo, en el almacén de campo a la temperatura más baja posible y transferirse a menos 20 grados celsius en la primera oportunidad. Antes del análisis, retire las muestras del congelador y permita caminar naturalmente a temperatura ambiente durante al menos una hora. Configure los métodos analíticos en el GCMS de la siguiente manera para las condiciones de análisis de SPMS, siga las instrucciones del fabricante para acondicionar las fibras SBME antes del primer uso.Es vital que el conjunto SBME esté instalado correctamente en el muestreador automático y que esté alineado con la unidad de acondicionamiento de fibra de las bandejas del muestreador automático y el puerto de entrada GC. La alineación incorrecta podría resultar en daños o destrucción de la fibra Sbme. Asegúrese de que el suministro de gas de la percha a la unidad de acondicionamiento de fibra esté encendido.Para mejorar la consistencia entre el tiempo de retención de la muestra, el método analítico es el tiempo de retención bloqueado agregar los viales de muestra a la bandeja del muestreador automático colocar un vial de espacio de cabeza vacío para actuar como un sistema en blanco en la primera posición de la bandeja del muestreador automático. Coloque el espacio en blanco ambiental en la segunda posición y, a continuación, coloque todas las muestras restantes para su análisis en las posiciones posteriores de la bandeja del muestreador automático. Cree una secuencia analítica para analizar cada muestra dentro de la bandeja de muestras.En la pantalla de inicio del cazador de masas, seleccione la secuencia para la barra de menús y, a continuación, cargue la secuencia en el menú desplegable. Se mostrará una tabla de secuencia en blanco para completar la tabla de secuencia para todos los espacios en blanco y muestras insertando la información adecuada guardar como tabla de secuencia completada. Tenga en cuenta que la información exacta de la tabla de secuencia dependerá del formato de los laboratorios de la tabla.La información mínima normalmente incluiría el nombre de muestra de tipo de muestra, la ubicación del archivo y el método analítico de número y la ubicación del archivo de datos y la asignación de nombre de un nombre de archivo de datos que coincida con el nombre de muestra que se ha actualizado en el procesamiento de datos futuro. Se pueden agregar muestras adicionales a la secuencia durante el análisis. Ejecute la secuencia seleccionando la secuencia en la barra de menús y, a continuación, ejecute la secuencia.Después del análisis, las muestras se devolvieron al congelador lo antes posible. Tenga en cuenta que puede ser posible volver a analizar las muestras. Pero cabe señalar que algunos componentes volátiles pueden haber sido totalmente extraídos durante el análisis inicial y algunos compuestos pueden haber sufrido descomposición térmica y bacteriana a 40 grados Centígrados.Por lo tanto, el resultado en cromatograma puede no ser completamente representativo de la marca de olor original. El análisis inicial de datos incluye la integración de cromatogramas para obtener datos de tiempo de retención y área de pico junto con la identificación tentativa de picos utilizando software de estación de leva y bases de datos espectrales de masa de nido. El análisis de datos se puede llevar a cabo manualmente o a través de un método semiautomatizado.Si se utiliza el método semiautomatizado, a veces es beneficioso realizar un grado de análisis manual de datos para verificar las identificaciones tentativas. Para iniciar el análisis de datos, abra el archivo de datos haciendo clic en el archivo apropiado en la barra de navegación de la izquierda. El cromatograma de iones total TIC se mostrará en la ventana superior de la pantalla de análisis de datos.Para integrar el TIC utilizando el integrador RTE, primero seleccione el cromatograma en la barra de menús y luego seleccione integrador en el menú desplegable, se abre un cuadro emergente y elija el integrador RTE. Vuelva al menú cromatograma y ahora seleccione integrar. Para ajustar los parámetros de integración de modo que se integren los picos o a más de tres veces el ruido de línea de base, seleccione de nuevo cromatograma en la barra de menús y, a continuación, los parámetros de integración de MS Signal en el menú desplegable.En el cuadro emergente, ajuste el área de pico mínima según corresponda 1.0 produce resultados aceptables en nuestros ejemplos. Para identificar los picos y generar un informe de resumen, seleccione exportar informes en la barra de menús y, a continuación, library search results report to XLS. Tenga en cuenta que las bibliotecas espectrales que se buscarán junto con el número de coincidencias de biblioteca que se mostrarán deben estar preestablecidas dentro del software antes de que se pueda realizar una búsqueda en la biblioteca.El informe de hoja de cálculo resultante contiene datos de integración para cada pico y una coincidencia de biblioteca espectral tentativa para asignar la identidad. Normalmente, la calidad de la biblioteca o la coincidencia de la biblioteca debe ser mayor que 80 para aceptar la identificación provisional. Guarde la hoja de cálculo.Para identificar un pico directamente desde el TIC, elija el pico de interés. Si el pico es pequeño, acerque dibujando un cuadro alrededor del pico, manteniendo presionado el botón izquierdo del mouse, estire el cuadro sobre el pico y suelte el botón del mouse. Coloque la línea del cursor para que esté en el punto más alto del pico o justo después.Haga doble clic, el botón derecho del ratón y el espectro de masa para el pico aparecerán en la ventana baja de la pantalla de análisis de datos. Para buscar en una biblioteca espectral, mueva el cursor a cualquier lugar de la ventana espectral y haga doble clic en el botón derecho del ratón, los resultados de la búsqueda de la biblioteca aparecerán en una nueva ventana. Para eliminar el ruido de fondo de un espectro de interés primero, haga doble clic en el botón derecho del ratón en el pico en cuestión y luego haga clic en el botón derecho del ratón en un área sin picos inmediatamente delante del pico de interés, haga clic en el botón restar en la cinta de menú o seleccione cromatograma para la barra de menús y luego reste espectros del menú desplegable.El espectro restado se mostrará en la ventana inferior de la pantalla de análisis de datos y mostrará un guión junto a los datos de escaneo en el encabezado de la ventana. Siguiendo este protocolo, identificamos tentativamente un total de 32 compuestos químicos volátiles del análisis de 14 marcas genitales del olor lanzadas espontáneamente en papel de filtro por los lémures ruffed rojos y comparamos perfiles del olor con las características del signaler naturalmente que ocurren compuestos volátiles tales como hidrocarburos, terpenos, alcoholes del turpin y cetonas estaban presentes dentro de estos perfiles e incluyen los compuestos que habían sido encontrados previamente para actuar como hormonas de sexo y señales a la aptitud en otras especies animales. Los compuestos que se han identificado provisionalmente se enumeran en el cuadro uno.Los cromatogramas representativos uno de un control y otro de una marca de olor de Lima se muestran en la figura uno. El número y la abundancia relativa de los componentes variaron de una muestra a otra entre los diferentes sujetos del estudio. Sin embargo, seis compuestos etiquetados A a F en el cromatograma estaban presentes en todas las muestras.Estos compuestos fueron respectivamente curvas a la altura de la isla de E uno hexanal paracrystal seis paramentha dos ocho tinte uno dos pineno cuatro y pentodecano. Los resultados de este estudio sugirieron que los lémures rojos con volantes usan el marcado enviado para transmitir información sobre el sexo y la edad femenina con un marcado sin genitales que juega un papel en la comunicación socio sexual. Otro resultado representativo que seguía el uso de este protocolo era nuestro estudio del anuncio de la fertilidad por los babuinos olivas femeninos.Identificamos un total de 74 compuestos volátiles del análisis de 395 muestras vaginales del olor del babuino femenino. Estos incluían una gama de compuestos volátiles olorosos naturales como cetonas, alcoholes, aldehídos, terpenos, ácidos grasos volátiles e hidrocarburos. Los cromatogramas típicos que se utilizan para comparar muestras de olor vaginal de troll en blanco y babuino hembra de períodos fértiles y no fértiles se muestran en la figura dos.Examinamos las relaciones entre los perfiles vaginales del olor y la receptividad sexual de babuinos femeninos. Nuestros resultados mostraron que la cantidad total de olor vaginal difiere con la fertilidad, lo que sugiere que el olor podría desempeñar un papel en la señalización de la fertilidad del babuino femenino. También encontramos diferencias en el olor vaginal entre los tipos de grupo, pero no pudimos distinguir los efectos de la composición del grupo, la impaciencia de la edad femenina.Son las ventajas combinadas del muestreo y uso del GCMS. Por lo tanto, el uso de la micro extracción de fase sólida del espacio de la cabeza permite analizar una amplia gama de muestras diferentes utilizando GCMS. Podemos separar los componentes de estas marcas complejas y luego identificar cada uno de esos componentes individuales usando el espectrómetro de masas.Y luego, toda la técnica combinada es muy poderosa y nos da mucha información sobre estas marcas de olor, que en el pasado habría habido mucha extracción de preparación de muestras requerida para poder obtener los resultados.

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Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

En este artículo de vídeo, se describe un nuevo método que permite la construcción de los gradientes de olor con geometrías estable y controlable. Nos muestra brevemente cómo estos gradientes se pueden utilizar para la detección de defectos olfativos (anosmia total y parcial) y el estudio de las características más sutiles de comportamiento quimiotaxis.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

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