Name: Caracterización de la diferenciación in vitro de los queratinocitos primarios humanos por análisis de ARN-Seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda a diferenciar queratinocitos primarios humanos in vitro mediante inhibición por contacto y caracterizarlos con análisis de ARN-Seq. Este protocolo facilita estudios de biología epidérmica y epigenómica.

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Esta investigación fue apoyada por la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Beca de la Universidad Radboud (H.Z.); y la subvención del Consejo De Becas China 201406330059 (J.Q.).

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<li>Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+differentiation+of+in+vitro+keratinocytes+requires+multifactorial+external+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control.</a> PLoS One. 8 (10), 77507(2013).</li>
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<li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
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<li>Luis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+epidermal+stem+cell+proliferation+and+senescence+requires+polycomb-+dependent+and+-independent+functions+of+Cbx4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4.</a> Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).</li>
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<li>Qu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+p63+Affects+Epidermal+Cell+Identity+through+Rewiring+the+Enhancer+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape.</a> Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).</li>
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<li>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit. , Available from: 
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<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
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<li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((clusterProfiler%3A+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li>
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<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
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<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo describe un método para inducir la diferenciación de queratinocitos humanos y la posterior caracterización utilizando análisis de ARN-seq. En la literatura actual, muchos estudios sobre la diferenciación de queratinocitos humanos utilizan otros dos métodos, con una alta concentración de calcio o con suero como métodos para inducir la diferenciación2,3,23. Un informe anterior comparó cuidadosamente estos tres métodos...

Los queratinocitos primarios humanos derivados de la piel humana se utilizan a menudo como modelo celular para estudiar la biología de la epidermis1,2,3,4. La estratificación de la epidermis se puede modelar por diferenciación de queratinocitos, ya sea en una moda monocapa sumergida 2D o 3D aire-lift modelo organotípico2,3,5,6,7. Aunque los modelos 3D se han vuelto cada vez más importantes para evaluar la estructura epidérmica y la función, los modelos de diferenciación 2D siguen siendo ampliamente utilizados, debido a su comodidad y la posibilidad de generar un gran número de células para análisis.
Se han aplicado varias condiciones para inducir la diferenciación de queratinocitos en 2D, incluyendo la adición de suero, alta concentración de calcio, menor temperatura e inhibición de los receptores del factor de crecimiento epidérmico2,3. Cada uno de estos métodos ha sido validado por una serie de genes marcadores de diferenciación de queratinocitos y ha demostrado ser eficaz en la evaluación de la diferenciación de queratinocitos, incluso en condiciones patológicas. Sin embargo, estas condiciones de inducción también muestran diferencias en su eficiencia de diferenciación y cinética cuando se examinan paneles específicos de genes marcadores2,3.
Uno de estos métodos implica la inhibición del contacto con queratinocitos y el agotamiento de los factores de crecimiento en el medio de cultivo8. Se ha demostrado que los queratinocitos pueden diferenciarse espontáneamente cuando las células alcanzan la densidad completa.  Excluir los factores de crecimiento en el medio de cultivo puede mejorar aún más la diferenciación. Se ha demostrado que el método que combina la inhibición del contacto y agota los factores de crecimiento genera que los queratinocitos diferenciados con patrones de expresión génica similares a la epidermis estratificada normal cuando se utilizan varios marcadores epidérmicos3,lo que sugiere que este modelo es adecuado para estudiar la diferenciación normal de queratinocitos. Recientemente, se han notificado dos análisis completos de expresión génica de la diferenciación de queratinocitos utilizando este modelo9,10. Los investigadores validaron este modelo a nivel molecular y demostraron que se puede utilizar para estudiar la diferenciación normal y enferma de queratinocitos.
Este protocolo describe el procedimiento para el método de diferenciación in vitro y el análisis molecular de células diferenciadas utilizando ARN-seq. También ilustra la caracterización del transcriptoma de las células en el día de diferenciación 0 (etapa de proliferación), el día 2, el día 4 y el día 7 (diferenciación temprana, media y tardía, respectivamente). Se muestra que los queratinocitos diferenciados muestran patrones de expresión génica que se asemejan en gran medida a las células durante la estratificación epidérmica. Para examinar si este método se puede utilizar para el estudio de la patología cutánea, aplicamos la misma canalización experimental y de análisis para investigar queratinocitos portadores de mutaciones del factor de transcripción p63 que se derivan de pacientes con ectrodactyly, displasia ectodérmica y síndrome de labio/paladar hendido (CEE)11,12. Este protocolo se centra en la diferenciación in vitro de los queratinocitos, así como en el posterior análisis bioinformático del ARN-seq. Otros pasos en el procedimiento completo como la extracción de ARN, la preparación de muestras de ARN-seq y la construcción de bibliotecas, están bien documentados y se pueden seguir fácilmente, especialmente cuando se utilizan muchos kits comerciales de uso común. Por lo tanto, estos pasos se describen brevemente en el protocolo. Los datos muestran que esta tubería es adecuada para el estudio de eventos moleculares durante la diferenciación epidérmica en queratinocitos sanos y enfermos.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de hipófisis bovina (BPE)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del sistema bulletKit</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time Máquina</td> de <td>qPCR</td><td>Bio-Rad</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico (EGF)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte de la bulletKit</td></tr><tr><td>Etanolamina >= 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Chips de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortison</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>iScript Síntesis de ADNc</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Library Quant Kit</td><td>Roche</td><td>07960255001</td><td>Kit de medición de baja concentración</td></tr><tr><td>KAPA RNA HyperPrep Kit con RiboErase</td><td>Roche</td><td>KK8540</td><td>RNAseq kit</td></tr><tr><td>KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza</td><td></td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX (modelo)</td><td>Nanodrop y Qbit para mediciones de ADN y ARN</td></tr><tr><td>NEXTflex Códigos de barras de ADN -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 pb cebadores largos</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ARN Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de la diferenciación in vitro de los queratinocitos primarios humanos por análisis de arn-seq

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Los queratinocitos primarios humanos se utilizan a menudo como modelos in vitro para estudios sobre la diferenciación epidérmica y enfermedades relacionadas. Se han notificado métodos para la diferenciación in vitro de queratinocitos cultivados en formas sumergidas bidimensionales (2D) utilizando diversas condiciones de inducción. Aquí se describe un procedimiento para el método de diferenciación de queratinocitos in vitro 2D por inhibición del contacto y posterior caracterización molecular por ARN-seq. En resumen, los queratinocitos se cultivan en medio de queratinocitos definidos complementados con factores de crecimiento hasta que son totalmente confluentes. La diferenciación es inducida por contactos estrechos entre los queratinocitos y se estimula aún más excluyendo los factores de crecimiento en el medio. Utilizando análisis de ARN-seq, se muestra que ambos 1) queratinocitos diferenciados exhiben firmas moleculares distintas durante la diferenciación y 2) el patrón de expresión génica dinámica se asemeja en gran medida a las células durante la estratificación epidérmica. En cuanto a la comparación con la diferenciación normal de queratinocitos, los queratinocitos portadores de mutaciones del factor de transcripción p63 exhiben morfología alterada y firmas moleculares, consistentes con sus defectos de diferenciación. En conclusión, este protocolo detalla los pasos para la diferenciación de queratinocitos in vitro 2D y su caracterización molecular, con énfasis en el análisis bioinformático de los datos de ARN-seq. Debido a que la extracción de ARN y los procedimientos de ARN-seq han sido bien documentados, no es el foco de este protocolo. El procedimiento experimental de diferenciación in vitro de queratinocitos y tubería de análisis bioinformático se puede utilizar para estudiar eventos moleculares durante la diferenciación epidérmica en queratinocitos sanos y enfermos.

Diferenciación normal de queratinocitos y análisis de ARN-seq En este experimento, se utilizaron líneas de queratinocitos derivadas de cinco individuos para la diferenciación y análisis de ARN-seq. La Figura 1 resume el procedimiento experimental de diferenciación y los resultados del análisis de ARN-seq. En la Figura 1Ase ilustra una visión general de los procedimientos de diferenciación in vitro de los queratinocitos normales y los cambios ...

Aquí se presenta un procedimiento escalonado para la diferenciación in vitro de queratinocitos primarios humanos por inhibición del contacto seguido de caracterización a nivel molecular por el análisis de ARN-seq.

Caracterización de la diferenciación in vitro de los queratinocitos primarios humanos por análisis de ARN-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

En este protocolo, describimos un procedimiento que contiene dos partes. En primer lugar, un método de diferenciación monocapa de queratinocitos 2D in vitro por inhibición del contacto. En segundo lugar, su caracterización molecular por RNA-seq.El método de diferenciación in vitro 2D es sencillo y fácil de realizar. Se puede utilizar para estudiar la diferenciación epidérmica, especialmente cuando un gran número de células son necesarias. Por ejemplo, en el análisis epigenómico.La canalización detallada de análisis de ARN-seq es clara y transparente para investigadores con habilidades bioinformáticas básicas, y se puede utilizar para cualquier análisis de ARN-seq a granel. Al realizar el protocolo de diferenciación por primera vez, tenga en cuenta que la densidad de siembra puede ser complicada. Pruebe múltiples densidades de siembra para averiguar cuál funciona mejor con su línea celular.Comience preparando el medio de crecimiento de queratinocitos o KGM y 500 mililitros cada uno de medio de proliferación y medio de diferenciación según las instrucciones del manuscrito. Sembrar queratinocitos primarios a una densidad de 5 a 20.000 células por centímetro cuadrado y añadir suficiente medio de proliferación para cubrir las células. Dos días después de la siembra, refresque las células con el medio de proliferación.Revise las células regularmente bajo el microscopio y refresque el medio cada dos días. Cuando las células alcanzan el 90% de confluencia, induzcan la diferenciación cambiando el medio al medio de diferenciación. Para recolectar células para análisis adicionales de ARN, lave las células dos veces con DPBS y luego agregue el búfer de lelisis.Recoger células en los días de diferenciación cero, dos, cuatro y siete. Después del aislamiento de ARN, se convertirá el ADNn a dos cadenas y se prepararán las bibliotecas RNA-seq para la secuenciación de próxima generación. Después de la secuenciación, las lecturas de secuencia serán descargadas y mapeadas al genoma humano.Después de descargar e instalar paquetes de R, genere la tabla de cuentas a partir de readspergene.out. tabulación y escribir un archivo de datos de ejemplo que contenga todos los nombres de archivo, el día de la diferenciación y otros datos de ejemplo relevantes. Consulte los archivos de codificación suplementarios para obtener un ejemplo.A continuación, utilice la tabla de recuento y los datos de ejemplo para generar un objeto deseq2 que contenga los datos contables y de ejemplo. Para la normalización de la expresión génica, normalice la tabla de recuento en el objeto deseq2 utilizando la normalización deseq2RLD o VST. Mientras que se prefiere la normalización RLD, la normalización VST es mucho más rápida.Utilice la función dist en R para trazar la distancia de la muestra en función de las intensidades de recuento de lectura normalizadas y, a continuación, realice la agrupación en clústeres hclust en función de la distancia de la muestra. A continuación, trace el mapa de calor utilizando la función pheatmap. Por último, genere un análisis de componentes de principio o una gráfica PCA de las intensidades de recuento de lectura normalizadas utilizando la función plotPCA de deseq2.PCA sirve como una herramienta en el análisis de datos exploratorios y se puede utilizar para visualizar la distancia y la conexión entre diferentes muestras. Realice análisis de expresión génica altamente variable con la función rowVars que extrae los 500 genes superiores altamente variables ordenando la varianza entre muestras de diferentes puntos de tiempo. Estos genes tienen la desviación estándar más alta de su intensidad normalizada a través de días de diferenciación.Realice la agrupación en clústeres k-means en los genes altamente variables para agruparlos mediante diferentes patrones de expresión. Visualice los genes en un mapa de calor con el paquete pheatmap. La intensidad trazada en el mapa de calor es la intensidad normalizada deseq2 con el valor medio restado.Generar una lista de genes de fondo expresados que incluye todos los genes con más de 10 recuentos en una sola muestra y hacer una lista con genes de cada grupo. Por último, realice el análisis de Gene Ontology con GOrilla. Utilice la lista de genes de fondo como conjunto de fondo y la lista de los genes altamente variables en clústeres como el conjunto de objetivos y, a continuación, haga clic en términos GO enriquecidos en la búsqueda.Como alternativa, los usuarios de R más avanzados pueden usar el paquete clusterProfiler para automatizar el análisis de enriquecimiento de términos GO. Las líneas de queratinocito derivadas de cinco individuos se utilizaron para la diferenciación en los análisis de ARN-seq. El análisis de componentes principales mostró que los queratinocitos sometidos a diferenciación tenían perfiles de expresión génica globales relacionados pero distintos.Los genes altamente variables se agruparon para visualizar la dinámica y los patrones de expresión génica durante la diferenciación. Cada grupo de genes estaba representado por los genes distintivos de la diferenciación de queratinocitos y la anotación Gene Ontology mostró una clara diferencia en las funciones genéticas. En el segundo experimento, se compararon las diferencias de morfología celular y expresión génica entre los queratinocitos de los controles sanos y las líneas celulares derivadas de pacientes portadores de mutaciones P63.El análisis de componentes principales mostró que las líneas celulares de control seguían claramente un patrón de diferenciación, pero el patrón de expresión génica de las células mutantes durante la diferenciación permanece en gran medida similar al de las células proliferantes o indiferenciadas. En el análisis de agrupación, los genes en el clúster uno fueron regulados hacia abajo en las células de control y parcialmente regulados en células de pacientes portadoras de mutaciones R204W y R279H, pero se mantuvieron altos en células portadoras de R304W. Es probable que estos genes desempeñe un papel en la proliferación celular, como lo muestra el análisis de Gene Ontology.Los dos genes del grupo se introdujeron por primera vez y posteriormente se regularon en las células de control. Es probable que estos genes participen en la diferenciación de queratinocitos, ya que las funciones de diferenciación epidérmica y queratinización se enriquecieron para este grupo. Los genes del grupo tres sólo fueron inducidos al final de la diferenciación en las células de control, lo que indica que pueden desempeñar un papel en la capa más externa de la epidermis.Al analizar los datos de ARN-seq, es importante saber de antemano qué esperar. Esto le ayudará tanto con la interpretación del control de calidad y la gráfica PCA y en la evaluación de si sus resultados tienen sentido. Nuestros métodos se pueden utilizar para estudiar la transcripción genética tanto en biología epidérmica como en otros sistemas biológicos.

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Research

Investigación

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Genetics

Genética

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