Name: Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a aislar fibroblastos cardíacos y miofibroblastos de corazones de ratón sanos e injuriados con alta pureza mediante técnicas de inmunofluorescencia, PCR y clasificación celular. Este método flexible permite estudiar la reparación tisular y la fibrosis.

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Los autores quieren dar las gracias al Dr. Ivo Kalajzic por los ratones de la SMA-GFP. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el Número de Premio R01GM118300 (S.S.), Instituto Nacional de Imagen Biomédica y Bioingeniería del NIH bajo el Número de Premio R21EB019509 (P.P.Y.), y la Beca de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón bajo el Premio Número 17SDG33630187 (S.S.). Los análisis de citometría de flujo se realizaron en el recurso compartido de citometría de flujo VUMC, que cuenta con el apoyo del Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) y el Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

<ol><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%3A+From+Inflammation+to+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt1%2Fbetacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li>
<li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+myocardial+infarction%3A+a+role+in+inflammation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li>
<li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((View+from+the+heart%3A+cardiac+fibroblasts+in+development%2C+scarring+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li>
<li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li>
<li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Fibrosis%3A+The+Fibroblast+Awakens%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts%3A+implications+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li>
<li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+fibroblasts+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li>
<li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li>
<li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li>
<li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+fibroblast%3A+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los fibroblastos son un grupo heterogéneo de células, identificado por un conjunto diverso de marcadores. Los marcadores proteicos que se han utilizado para identificar fibroblastos son el receptor 2 de dominio de discoidina (DDR2), la fibronectina, la vimentina, el colágeno I y III, y El Thy115,,16,17,18,19,20. Mientras que ...

Los fibroblastos cardíacos, células de origen mesenquimal, desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la conducción eléctrica y las fuerzas mecánicas en el corazón, además del mantenimiento de la arquitectura cardíaca durante la homeostasis1. Después de la lesión, estas células se activan, se expanden y producen proteínas de matriz extracelular (ECM)2. Muchos estudios preclínicos han revelado fibroblastos como reguladores celulares críticos que mantienen la integridad estructural de un corazón lesionado3, así como las principales células efectoras responsables de la producción y deposición sin control de proteínas ECM, lo que resulta en la formación de cicatrices rígidas y la insuficiencia cardíaca4. Los fibroblastos son un grupo heterogéneo de células, lo que hace difícil diseccionar su función reparadora de las propiedades de la maladaptiveificación profibrosca. Recientemente, se ha definido la heterogeneidad funcional de dos subtipos de fibroblastos distintos después de una lesión miocárdica, lo que indica la posibilidad de aislar diferentes subtipos de fibroblastos y estudiar su papel en la cicatrización de heridas5.
La obtención de una población de fibroblastos puros es crucial para delinear su papel funcional en la reparación y la fibrosis. Sin embargo, la presencia de múltiples marcadores de fibroblastos que reconocen otros tipos de células hacen que sea difícil aislar a una población de fibroblastos sustancialmente pura6. Varios estudios elegantes han ideado formas inteligentes de aislar fibroblastos cardíacos de miocardio no lesionado y lesionado. El método más popular y bien establecido de fibroblastos enriquecedores es a través de la adhesión selectiva después de la digestión del tejido enzimático7.
Además, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de fibroblastos a base de antígenos de superficie celular se ha descrito con éxito8. En el estudio, después de la digestión enzimática, las células mesenquimales se clasificaron como negativos de linaje (Lin: Ter119-CD45-CD31)y gp38-positivo (gp38+) de los corazones del ratón. Se confirmó que las células Gp38+ve eran fibroblastos en función de su coexpresión de col1-1 y otros marcadores mesenquimales. Aunque la mayoría de la digestión tisular se completa después de disección del ventrículo en una placa de Petri, un estudio reciente ha investigado el uso de una perfusión directa de la enzima aguja del ventrículo izquierdo para aislar los miocitos y los no miocitos que incluyen fibroblastos9. Los fibroblastos fueron aislados por adhesión selectiva en este caso.
Este protocolo describe el aislamiento y el enriquecimiento de los fibroblastos utilizando tres métodos. El primero es un método ya establecido que implica la adhesión selectiva de fibroblastos después de la digestión enzimática. El segundo método se utiliza para aislar principalmente el músculo liso alfa inducido por lesiones que expresa miofibroblastos. El tercer método consiste en el agotamiento secuencial y magnético de una suspensión celular cardíaca digerida enzimática de células hematopoyéticas y endoteliales. Tras el agotamiento, los fibroblastos/miofibroblastos se aíslan en función de la presencia del antígeno MEFSK4 utilizando perlas magnéticas. Recientemente, MEFSK4 ha sido descrito como un antígeno presente en fibroblastos inactivos y activados, por lo que es un marcador adecuado para la identificación y aislamiento de fibroblastos. Naturalmente, todos los métodos descritos aquí tienen limitaciones únicas. Por lo tanto, es muy recomendable comprobar la pureza de la población celular aislada mediante análisis de flujo, inmunomanchay y PCR semicuantitativo en tiempo real. Sin embargo, estas metodologías se pueden ampliar, y se pueden agregar marcadores adicionales con el fin de excluir otras poblaciones contaminantes antes de utilizar las poblaciones de fibroblastos y miofibroblastos para experimentos cruciales.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes> </acetona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> fuerte> <tr><td>antifúngico (anfotericina B-solubilizada; Fungizone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9528</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de serio bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro</td><td></td><td></td><td></td>de calcio</tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>citrato Mezcla de colagenasa (Liberase Blendzyme 3 TH)</td><td>Roche Applied Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDI agua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Agua <td></td><td></td><td></td><td>desionizada</td></tr><tr><td>DMEM-F12 con L-Glutamina y tecnologías HEPES</td><td>Life</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I(20U/mL)</td><td>BioRad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (dPBS) de Dulbecco sin Ca2+ y Mg2+</td><td>Gibco</td><td>13190-144</td><td></td></tr> Bloqueador de FC de <tr><td>etanol</td><td></td><td></td><td></td>al 70%</tr> (<tr><td>purificado anti-ratón CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Tecnologías de vida</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Suero</td><td></td><td></td><td></td>de cabra al 10%</tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con Ca2+ y Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-Ci</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit Polvo tampón</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Medios</td><td></td> <td>de montaje de desvanecimiento lento</td><td></td></tr><tr><td>Azida de</td><td></td><td></td><td></td>sodio</tr><tr><td>Bicarbonato</td><td></td><td></td><td></td>de sodio</tr><tr><td>TGF&beta;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinción de azul de tripano (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr>Colágeno <td></td><td></td><td></td>de<td>rata tipo 1</td></tr><tr><td><Anticuerpos fuertes></fuerte></td>7AAD (stock: solución de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mg/ml en DMSO)</td><td>Sondas moleculares</td><td>Dilución A1310</td><td>= 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>CD45-APC</td><td>BD Bioscience</td><td>559864</td><td>dilución = 1:200; RRID = AB_398672</td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>553373</td><td>dilución = 1:200; RRID = AB_394819</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>dilución = 1:250; RRID = AB_394816</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>553076</td><td>dilución = 1:250; RRID = AB_394606</td></tr><tr><td>COL 1&alfa; 1</td><td>dilución</td><td>203002</td> MD Bioproducts <td>= 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>Tinte fantasma violeta 510 (Formulación: 1 uL/prueba en DMSO)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870</td><td>dilución = 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>Sondas moleculares</td> <td>Alexa Fluor 488 antiratón de cabra</td><td>A11029</td><td>dilución = 1:200; RRID = AB_138404</td></tr><tr><td>Dilución anti-conejo-Cy3</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>= 1:200; RRID = AB_2795952</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo-FITC</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td><td>711-165-152</td><td>dilución = 1:200; RRID = AB_2307443</td></tr><tr><td>Sondas moleculares anti-ratas Alexa Fluor 488</td><td></td><td>A11006</td><td>de cabra dilución = 1:200; RRID = AB_2534074</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratas Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A21247</td><td>dilución = 1:200; RRID = AB_141778</td></tr><tr><td>Periostina</td><td>Santa Cruz</td><td>SC67233</td><td>dilución = 1:100; RRID = AB_2166650</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2258</td><td>dilución = 1:200; RRID = AB_261856</td></tr><tr><td>&alfa;-actina de músculo liso (&alpha;SMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td>dilución = 1:1000; RRID = AB_476701</td></tr><tr><td>Proteína específica de fibroblastos 1 (FSP1)</td><td>Millipore 07-2274</td>, <td>07-2274</td><td>dilución = 1:100; RRID = AB_10807552</td></tr><tr><td>CD45 Perlas Magnéticas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Perlas Magnéticas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-087-418</td><td></td></tr><tr><td>Celdas antialimentadoras-APC (MEFSK4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-900</td><td>dilución = 1:100; RRID = AB_2660619</td></tr><tr><td>perlas anti-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-034</td><td>dilución = 1:100; RRID = AB_2661598</td></tr><tr><td>Donkey anti-rata Alexa Fluor405</td><td>Abcam</td><td>ab175670</td><td>dilución = 1:100</td></tr><tr><td>anti-AN2/NG2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-455</td><td>dilución = 1:11; RRID = AB_2651235</td></tr><tr><td><fuerte>Otros materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m Filtro</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>10 cm2 Placa de cultivo celular</td><td>Corning 430167</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Filtro de celdas</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico</td><td>Falcon</td><td>352070</td> Placa de 6 pocillos <td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de citometría de flujo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balancín</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de un solo filo</td><td>PAL</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-&alpha;SMA Ratones</td><td></td><td></td><td></td>reporteros</tr><tr><td>Separador MACS Campo magnético</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS Separación de columnas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qaigen Rneasy Mini Kit</td><td>Qaigen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Ambion RNAqueous Micro Kit de Aislamiento Total</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td><td></td>de 48 pocillos</tr><tr><td>30G Aguja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 Máquina de citometría de flujo láser (BD LSRFortessa)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 Laser Flow Máquina de citometría (BD FACSAria III)</td>BD <td>Biosciences Software de adquisición de datos de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flujo (BD FACSDiva Software v8.0a)</td><td>BD Biosciences Software de análisis de datos de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flujo (FlowJo Software)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

La fibrosis cardíaca en respuesta a una lesión es una respuesta fisiológica a la cicatrización de heridas. Se han hecho esfuerzos para estudiar y atacar los subtipos de fibroblastos que mitigan la fibrosis. Sin embargo, la investigación de fibroblastos se ha visto obstaculizada debido a la falta de marcadores de fibroblastos universalmente aceptables para identificar fibroblastos en reposo y activados. Los fibroblastos son una población de células heterogéneas, lo que dificulta su aislamiento y caracterización. El protocolo presentado describe tres métodos diferentes para enriquecer los fibroblastos y los miofibroblastos de los corazones de ratón no lesionados y heridos. El uso de un protocolo estándar y fiable para aislar los fibroblastos permitirá el estudio de sus funciones en la homeostasis, así como la modulación de la fibrosis.

Esquema de medición de flujo que demuestra el aislamiento de miofibroblastos utilizando ratones reportero de la SMA-GFP Los corazones no lesionados no mostraron células GFP+ detectables en el modelo de ratón de reportero de la SMA-GFP; por lo tanto, se utilizaron para establecer una puerta para la señal de fondo de la post-compensación del canal GFP(Figura 2). Las células de la AMA+ se clasificaron en función de la presencia de la expresión de GFP de...

La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Este protocolo nos permite aislar poblaciones de fibroblastos activados tanto en reposo como por lesiones con una pureza significativa. La principal ventaja de esta técnica es su flexibilidad para la improvisación. Para el flujo, así como el aislamiento basado en cuentas, se pueden incorporar anticuerpos contra las células contaminantes para excluirlos de las células diana aisladas.Esta técnica se utiliza principalmente para el aislamiento de fibroblastos cardíacos. Sin embargo, se puede utilizar para aislar fibroblastos de otros tejidos. Demostrar este procedimiento será Meiling Melzer, un pasante de pregrado, y David Beier, un asistente de investigación de mi laboratorio.Para preparar una placa de seis pocillos para almacenar seis corazones durante la disección, prescinda dos mililitros de KHB frío en cada pozo y coloque la placa sobre hielo. Rocíe el cuerpo con 70%etanol. Orientarlo para que el lado ventral esté frente al experimentador.Ancle los apéndices para evitar interferencias. Sin perforar el hígado, abrir la piel abdominal y el músculo. Corte verticalmente hacia el esternón, abriendo cuidadosamente el tórax sin perforar el corazón.A continuación, continúe cortando a través de la caja torácica para exponer el corazón. Usando fórceps, levante suavemente el corazón del pecho, cortando cualquier pulmón o exceso de tejido unido al exterior del corazón. Separe el ventrículo izquierdo.Para cada disección, coloque el ventrículo en un pozo separado de la placa de seis pocillos. En primer lugar, utilice fórceps para exprimir y agitar repetidamente el ventrículo en KHB para eliminar el exceso de sangre. Transfiera el ventrículo a una placa limpia, estéril de 10 centímetros cuadrados.A continuación, usando una hoja de un solo filo, picar rápidamente el ventrículo en trozos pequeños. Añadir un mililitro de cóctel de digestión de colagenasa, y continuar la picadura. Cuando las piezas sean lo suficientemente pequeñas como para transferirlas con una micropipeta de un mililitro, transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros.Lave el plato dos veces con dos mililitros de cóctel y transfiera el lavado al tubo. Incubar el tubo durante 30 minutos, y resuspender las células como se describe en el manuscrito utilizando una pipeta de cinco mililitros. Después de la resuspensión inicial, incubar las células durante 15 minutos y resuspend de nuevo usando una pipeta de 10 mililitros.Luego, coloca un colador celular de 40 micrómetros encima de un nuevo tubo cónico de 50 mililitros, y prepara el colador mojándolo con uno o dos mililitros de KHB. Añadir 25 mililitros de KHB a la suspensión de digestión, y resuspend. Filtrar la suspensión a través del colador, reemplazando el colador según sea necesario.Centrifugar el filtrado a 400 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en tampón de lisis 1x RBC usando cinco mililitros de tampón por corazón. Después de incubar la suspensión durante dos minutos a temperatura ambiente, centrifugar la suspensión a 400 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente.Retire el sobrenadante, y luego resuspender el pellet en un mililitro de KHB. A continuación, agregue nueve mililitros de KHB a la suspensión. Filtre la suspensión a través de un colador celular cebado de 40 micrómetros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.Centrifugar el tubo cónico a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, retire el sobrenadante, y resuspendir el pellet en un mililitro de medios de fibroblastos o PBS. Una vez determinado el número de célula, los fibroblastos pueden aislarse de la suspensión mediante tres métodos diferentes descritos en el manuscrito.Para comenzar el aislamiento por revestimiento diferencial, prepare una placa de seis pozos añadiendo dos mililitros de medios de fibroblastos a cada pozo. Gire la placa para cubrir los fondos de los pozos. Si las células cardíacas del ratón están suspendidas en PBS, centrifugarlas y resuspenderlas en un mililitro de medios de fibroblastos por corazón.Añadir un mililitro de suspensión celular, el equivalente de un corazón, a cada pozo. Gire la placa para distribuir uniformemente las células. Agregue de uno a dos mililitros adicionales de medios de fibroblastos por pozo para un volumen total de hasta cuatro mililitros por pozo.Incubar a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Debido a que los fibroblastos se adhieren selectivamente a los pozos, se pueden aislar mediante la eliminación y descarte de los medios. Lave las células unidas restantes con dos mililitros de PBS, y luego agregue dos a cuatro mililitros de medios de fibroblastos estériles por pozo.Incubar a 37 grados hasta confluencia, cambiando los medios cada dos a cuatro días. Para comenzar el etiquetado magnético y la separación de las células hematopoyéticas CD45 positivas, centrifugar una suspensión de las células cardíacas del ratón a 500 veces g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular en un mililitro de tampón de equilibrio.Cuente las células usando un hemocicómetro. Después de centrifugar las células de nuevo, resuspender el pellet celular en el tampón de equilibrio. Agregue perlas magnéticas CD45 positivas y mezcle bien.Incubar durante al menos 15 minutos a cuatro grados centígrados. Lave las células añadiendo tampón de equilibrio y centrifugando a 500 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y cuente las células usando un hemociclomekil.Resuspender el pellet en el tampón de equilibrio. Pase la suspensión a través de un filtro de 40 micrómetros para evitar que las agregaciones celulares obstruyan la columna de separación. A continuación, coloque una columna de separación en el campo magnético de un separador adecuado y equilibre la columna con al menos tres mililitros de PBS.Vierta la suspensión celular a través de la columna, y recoja el flujo a través, que contendrá las células sin etiquetar, en un tubo cónico de 15 mililitros. Lave la columna tres veces con tres mililitros de tampón de equilibrio y combine los lavados con el flujo a través. Retire la columna del separador y coloque la columna en un tubo cónico de 15 mililitros.Para eluir las celdas CD45 positivas etiquetadas, pipetee cinco mililitros de búfer de equilibrio en la columna y sumerja la columna firmemente. Centrifugar el tubo de eluyente y el tubo de flujo a través a 500 veces g. Cuente las células usando un hemocicómetro.Para completar el aislamiento, siga los protocolos del manuscrito para las células endoteliales CD31 positivas y los fibroblastos positivos MEFSK4, que son similares al protocolo para las células CD45 positivas. La clasificación de células activada por fluorescencia se realizó en células individuales aisladas de corazones de ratón alfa-SMA-GFP después del infarto de miocardio. Un esquema representativo de medición demuestra células positivas de la GFP que co-expresan CD31, CD45 o AN2.En los corazones lesionados del ratón, un pequeño porcentaje de células endoteliales y células hematopoyéticas expresaron GFP. Sin embargo, las células GFP-positivas/CD31-negativas/CD45-negativas no expresaron AN2, un marcador de pericito. Células GFP positivas expresaron alfa-SMA, colágeno uno alfa, periostina, y vimentina.Los fibroblastos no lesionados aislados por adhesión selectiva expresaron vimentina, pero no demostraron la expresión de alfa-SMA, periostina o colágeno uno alfa. Tanto los fibroblastos no lesionados como los activados expresaron el antígeno MEFSK4. Tanto los fibroblastos no lesionados, aislados por adherencia selectiva, como los miofibroblastos, aislados y clasificados de ratones alfa-SMA-GFP, demostraron una capacidad para contraer colágeno.Es importante picar el tejido a fondo antes de la incubación. Antes de la separación basada en cuentas, es importante pasar la suspensión a través de un filtro de 40 micrómetros para evitar agregaciones celulares. Las células purificadas por este método podrían purificarse aún más utilizando perlas magnéticas asociadas con anticuerpos específicos de pericitos para asegurar un alto nivel de pureza.Con la disponibilidad de nuevos anticuerpos conjugados con cuentas, así como ratones transgénicos reporteros, uno puede utilizar estas técnicas para aislar y estudiar poblaciones celulares distintas, no sólo fibroblastos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Adultos miocitos cardíacos son las células primarias que pueden ser aisladas de corazones de animales y se cultivan durante varios días. Dentro de este período de la cultura de transferencia génica adenoviral pueden ser utilizadas para expresar biosensores genéticamente codificados (GEBS) o proteínas fluorescentes de fusión. Ambos enfoques permiten investigaciones celulares por medio de microscopía confocal.

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Presentamos un protocolo para generar cultivos primarios de células estromales murinas y humanas con un fenotipo de miofibroblastos. Las células cultivadas tienen morfología fusiforme, expresan α-SMA y vimentina, y carecen de marcadores de superficie celular epiteliales, hematopoyéticos y endoteliales. Las células estromales caracterizadas se pueden utilizar en estudios funcionales de las interacciones epitelio-estromales.

Aislamiento de Miofibroblastos de Mouse y Esófago Humano

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Se han desarrollado y descrito varios protocolos para el aislamiento de diferentes tipos de células cardíacas de un corazón de rata. Aquí se describe un protocolo optimizado que permite el aislamiento de los principales tipos de células cardíacas de alta calidad (cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos) de una sola preparación, reduciendo los costos experimentales.

Aislamiento simultáneo de cardiomiocitos de alta calidad, células endoteliales y fibroblastos de un corazón de rata adulto

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ventriculares de rata adulta (ARVC). ARVC aislada puede utilizarse para el cultivo de corto y largo plazo. El aislamiento y cultivo de ARVC pueden desempeñar un papel clave en el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento para enfermedades cardíacas.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos de rata adulta

Aquí, describimos un procedimiento optimizado, a base de Langendorff para el aislamiento de cardiomiocitos la sola célula de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección conservada. Una regulación manual de la presión intraluminal de las cavidades cardiacas se implementa para obtener funcionalmente intacto miocitos adecuado para estudios de excitación-contracción-acoplamiento.

Aislamiento de cardiomiocitos auricular de un modelo de rata de la falta de corazón relacionados con el síndrome metabólico con fracción de eyección preservada

Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).

Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos

Se describe un método para el aislamiento simultáneo de micocitos y no miocitos tanto de las adriículas como de los ventrículos de un solo corazón de ratón adulto. Este protocolo da como resultado rendimientos consistentes de micocitos cardíacos altamente viables y no miocitos y detalla condiciones óptimas de cultivo específicos de células para fenotipado y análisis in vitro.

Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

Un método refinado de claro del tejido fue desarrollado y aplicado al corazón adulto del ratón. Este método fue diseñado para despejar el tejido cardiaco denso, autofluorescente, mientras que mantiene la fluorescencia etiquetada del fibroblasto atribuida a una estrategia genética del reportero.

Refinado CLARIDAD Basada En La Limpieza De Tejidos Para La Organización De Fibroblastos TridimensionalEs En Corazones De Ratón Sanos Y Lesionados

Aprenda a aislar fibroblastos cardíacos y miofibroblastos de corazones de ratón sanos e injuriados con alta pureza mediante técnicas de inmunofluorescencia, PCR y clasificación celular. Este método flexible permite estudiar la reparación tisular y la fibrosis.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

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