Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura

Describimos un método eficiente de purificación y cultivo de células de linaje oligodendroglial. Esto permite abordar los mecanismos moleculares que controlan la diferenciación de oligodendrocitos y sus interacciones con las neuronas durante el proceso de mielinización. Esta técnica de agitación no es costosa y es óptima para obtener una gran cantidad de oligodendrocitos.

Tales cultivos permiten la producción de medios condicionados con oligodendrocitos y co-cultivos de oligodendrocitos con neuronas. La esclerosis múltiple es una enfermedad causada por la des mielinización focal en el sistema nervioso central, secundaria a la pérdida de oligodendrocitos. La cultura de los oligodendrocitos proporciona una herramienta para entender mejor cómo promover la ree mielización.

Sólo el cultivo celular oligodendroglial podría proporcionar información sobre los mecanismos intrínsecos que regulan los desarrollos y la biología de los oligodendrocitos. Los co-cultivos con las neuronas permiten obtener información sobre sus impactos en la fisiología neuronal. Para empezar, utilice fórceps curvos para mantener la cabeza del animal a nivel de los ojos.

Usa pequeñas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión en la base del cráneo y corta el cráneo siguiendo la línea media del cerebro. Use fórceps para despegar suavemente las dos partes del cráneo de la línea media. Usa una cuchara quirúrgica pequeña para extraer el cerebro de la cavidad de la cabeza.

Ponga el cerebro en un plato de Petri de 60 milímetros que contenga glucosa PBS helada en el hielo. Viendo bajo un microscopio estéreo, utilizar fórceps finos para eliminar el cerebelo, el tallo cerebral, y los bulbos olfativos de los hemisferios cerebrales. Utilice fórceps finos para separar los dos hemisferios cerebrales.

Usa fórceps finos para despegar las meninges. Ponga los cortices cerebrales en un plato de Petri de 60 milímetros sobre hielo. En una capucha de flujo laminar, usa un bisturí afilado para cortar finamente los cortices cerebrales.

Transfiera el tejido picado a un tubo de 50 mililitros que contenga un medio de digestión enzimático. Incubar durante 30 minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Después de eso, utilice una pipeta para eliminar suavemente el medio de digestión enzimática mientras se asegura de que el tejido cortical permanezca en la parte inferior del tubo.

Utilice una micropipeta P1000 para añadir un mililitro de sémolo de becerro 10%fetal DMEM y triturar suavemente el tejido. Utilice un filtro de 70 micras y el pistón de una jeringa de un mililitro para filtrar el tejido cortical en un tubo de 50 mililitros. Enjuague el tejido residual en la pared interna del tubo del tubo de 50 mililitros varias veces con suero de pantorrilla DMEM 10%fetal.

Llene el tubo de 50 mililitros con suero de ternera DMEM 10%fetal. Centrifugar a 423 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspendir el pellet celular con dos mililitros de suero de ternera DMEM 10%fetal.

Triturar suavemente el pellet celular con la micropipeta P1000 y luego, con la micropipeta P200. Diluir la suspensión celular con el volumen adecuado de suero de ternera 10%fetal DMEM. Placa cinco mililitros de la suspensión celular en un matraz T-150 a una densidad de uno por 10 a las quintas células por centímetro cuadrado.

Añadir 20 mililitros de sérico becerro dmEM 10% fetal en cada matraz T-150. Incubar en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Después de agitar la muestra durante la noche a 250 rpm y 37 grados Celsius, cosechar el sobrenadante en el matraz que contiene principalmente células de linaje de oligodendrocitos, pero también, algunas células microgliales, y encubrir en platos Petri no recubiertos de 100 milímetros.

Incubar los platos de Petri durante 15 minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Esto permite la eliminación de células microgliales a través de la adhesión rápida diferencial en la superficie de la antena. Mientras tanto, llene cada matraz T-150 con 25 mililitros de medio de cultivo caliente recién preparado e incubar en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono hasta el segundo temblor.

A continuación, transfiera el sobrenadante de los platos petri a nuevos platos Petri no recubiertos de 100 milímetros para permitir la adhesión de células microgliales residuales. Incubar los platos de Petri durante 15 minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono. Retire el sobrenadante de cada dos platos de Petri, que contienen células de linaje de oligodendrocitos no adherentes, y transfiéralo a un tubo de 50 mililitros.

Deseche los platos de Petri chapados con microglia. Centrifugar los tubos durante cinco minutos a 423 veces g. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resusppend el pellet celular con un mililitro de medio Bottenstein-Sato.

Agrupa todos los pellets en un tubo común de 50 mililitros y ajusta el volumen a 20 o 30 mililitros dependiendo de la densidad celular con el medio Bottenstein-Sato. Plato dos o tres platos Petri precapotados de 100 milímetros con 10 mililitros de la suspensión celular. Incubar en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono.

Dos horas más tarde, despeje los escombros de los platos de Petri refrescando todo el medio Bottenstein-Sato. Incubar durante dos días en el medio en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Después de dos días, examine el cultivo bajo un microscopio.

En una campana de flujo laminar, en condiciones estériles, renueve el medio de cultivo con 10 mililitros de mpB-27 medio cálido bajo. Incubar durante dos días en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Para cosechar la OCM, recoja el sobrenadante que contiene oligodendrocitos factores secretados.

El filtro esteriliza el OCM usando un filtro de 0,22 micras. En este protocolo, las células de linaje de oligodendrocitos fueron purificadas de cultivos gliales sacudiendo los astrocitos y la microglia. El análisis de la expresión de diferentes marcadores indicó que los cultivos de oligodendrocitos eran en su mayoría pre-oligodendrocitos con 90 más o menos 4% de células positivas de O4, 85 células positivas más o menos 7%NG2, y 4,7 más o menos 2,1% de células positivas PLP, mientras que 7,2 más o menos 2,5% de las células eran astroteocitos positivos GF.

OCM producido a partir de tales cultivos se añadieron a los tres días in vitro a los cultivos purificados de neuronas hipocampales. Este tratamiento promueve la agrupación de proteínas notales. La mielinización de las neuronas del hipocampo se estudió mediante la adición de oligodendroctyes a los 14 días in vitro.

De 20 a 24 días in vitro, la inmuno tinción de marcadores de mielina, como la proteína básica de mielina, permitió la visualización de los segmentos y nodos de mielina de Ranvier. El núcleo PBS es importante para la eliminación de meninges. El aclaramiento rápido es fundamental para la viabilidad de los oligodendroctyes y la realización de las fortalezas del flujo aplicado con la pipeta.

El medio condicionado con oligodendrocitos se puede agregar a las culturas neuronales para obtener información sobre el impacto de los oligodendrotidos secretos factores en la fisiología neuronal. También se pueden realizar co-cultivos de oligodendroctyes con neuronas para estudiar el proceso de mielinización.