Name: Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a purificar oligodendrocitos y producir medio condicionado para experimentos de cocultura con neuronas. Este método eficiente permite estudiar los mecanismos de mielinización y diferenciación celular en neurociencia.

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Los autores quieren agradecer a Rémi Ronzano por su sabio consejo en la edición de manuscritos. Este trabajo fue financiado por iCM, INSERM, la fundación ARSEP a NSF, y el precio Bouvet-Labruyére.

El cuidado y uso de ratas en este experimento se ajusta a las políticas y directrices institucionales (UPMC, INSERM y la Directiva 86/609/CEE del Consejo de la Comunidad Europea). El siguiente protocolo se establece para una camada estándar de 12 cachorros.
1. Preparación de los matraces (5 min)
NOTA: Realice los siguientes pasos el día antes de la disección en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
<ol><li>Recubrir los matraces de 150 cm2 (T150) con tapa de filtro (1 matraz para 2 cachorros) utilizando 5 ml de polietilenimina (PEI, 100 mg/L, ver protocolo en el archivo suplementario 1).</li>
	<li>Almacene los matraces a 4oC durante la noche.</li>
	<li>Enjuague los matraces recubiertos 3 veces con agua destilada estéril el día de la disección.</li>
</ol>2. Preparación de medios (10 min)
NOTA: Realice los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
<ol><li>Preparar 500 ml de medio de cultivo, compuesto por el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con el 10% del suero fetal de la pantorrilla (FCS) y la penicilina-estreptomicina (100 UI/ml).</li>
	<li>Preparar 20,6 ml del medio de digestión enzimática en un tubo de 50 ml, que consiste en 20 ml de DMEM, 200 ml de DNase (50 g/ml), 200 ml de papaína (30 U/ml) y 200 ml de L-cisteína (0,24 mg/ml).</li>
	<li>Filtrar-esterilizar el medio utilizando un filtro de 0,22 m.</li>
	<li>Mantenga el medio en la campana de flujo laminar a temperatura ambiente (RT) hasta la disección.</li>
</ol>3. Preparación para la disección (10 min)
NOTA: Realice los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
<ol><li>Preparar 100 ml de solución salina con fosfato sin calcio y magnesio (PBS; 1x). Filtrar-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 m.</li>
	<li>Preparar 50 ml de solución de PS p.PBS 1x en frío suplementada con 750 ml de glucosa al 45%. Filtrar-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 m.</li>
	<li>Llene una placa Petri de 100 mm con 1 x PBS para instrumentos de limpieza y tres platos Petri de 60 mm con PBS-glucosa helada para la cosecha de tejidos. Ponga los platos de petri en hielo hasta la disección.</li>
</ol>4. Disección
NOTA: La disección se realiza a partir de cachorros de ratas Wistar masculinos y femeninos en el día postnatal (P) 2.
<ol><li>Con el fin de proporcionar un ambiente estéril, asegúrese de limpiar el banco con 100% etanol. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas con 100% de etanol.</li>
	<li>Rocíe suavemente el cuello del cachorro con un 70% de etanol.</li>
	<li>Use tijeras quirúrgicas grandes para decapitar al animal y colocar la cabeza en un plato Petri de 100 mm que contenga PBS-glucosa helada.</li>
	<li>Utilice fórceps curvos para mantener la cabeza del animal a nivel de los ojos. Use pequeñas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión en la base del cráneo y cortar el cráneo siguiendo la línea media del cerebro.</li>
	<li>Usa fórceps para despegar suavemente las dos partes del cráneo de la línea media.</li>
	<li>Use una cuchara quirúrgica pequeña para extraer el cerebro de la cavidad de la cabeza. Ponga el cerebro en un plato Petri de 60 mm que contenga PBS-glucosa helada en hielo.</li>
	<li>Viendo bajo un esterosmicroscopio, usa fórceps finos para eliminar el cerebelo, el tronco encefálico y los bulbos olfativos de los hemisferios cerebrales.</li>
	<li>Usa fórceps finos para separar los dos hemisferios cerebrales. Usa fórceps finos para despegar las meninges. Ponga los córtices cerebrales en un plato de 60 mm-petri sobre hielo. NOTA: El PBS helado es fundamental para la eliminación correcta de las meninges.</li>
</ol>5. Disociación de tejidos
NOTA: Realice los pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
<ol><li>Usa un bisturí afilado para cortar finamente los córticos cerebrales. Transfiera el tejido picado a un tubo de 50 ml que contenga un medio de digestión enzimática.</li>
	<li>Incubar durante 30 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% co2.</li>
	<li>Utilice una micropipeta p1000 para eliminar suavemente el medio de digestión enzimática mientras se asegura de que el tejido cortical permanezca en la parte inferior del tubo de 50 ml.</li>
	<li>Utilice un micropita p1000 para agregar 1 ml de DMEM-10% FCS y triturar suavemente el tejido.</li>
	<li>Utilice un filtro de 70 m y un pistón de una jeringa de 1 ml para filtrar el tejido cortical en un tubo de 50 ml. NOTA: Se puede enjuagar el tejido residual en la pared del tubo interno varias veces con DMEM-10% FCS.</li>
	<li>Llene el tubo de 50 ml con DMEM-10%FCS. Centrífuga a 423 x g durante 5 min en RT. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 2 ml de DMEM-10%FCS.</li>
	<li>Triturar suavemente el pellet celular con un micropita p1000 y luego con un micropita p200. Diluir la suspensión celular con el volumen adecuado de DMEM-10%FCS. NOTA: Dos cerebros, uno, uno, uno, 5 ml de DMEM-10%FCS.</li>
	<li>Placa 5 ml de la suspensión celular en un T150 a una densidad de 1 x 105 células/cm2. Agregue 20 mL de DMEM caliente-10%FCS a cada T150. Incubar en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.</li>
	<li>Renovar la mitad del medio de cultivo después de 6 días in vitro (DIV) con cálido DMEM-10%FCS.</li>
</ol>6. Preparación de agitación
<ol><li>Realice la preparación de agitación el día antes de agitar en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.</li>
	<li>Renovar la mitad del medio de cultivo añadiendo un medio de cultivo fresco y cálido al matraz e incubar a 37oC por debajo del 5% deCO2.</li>
</ol>7. Temblor
<ol><li>Recubrir tres platos Petri de 100 mm con PEI. Guárdelos a 4oC durante la noche.</li>
	<li>Cubra la tapa de los frascos con película de parafina y coloque los matraces en una bolsa de plástico. Agitar los matraces que contengan células gliales durante la noche a 250 rpm a 37 oC. NOTA: El primer temblor se realiza a 8 DIV y se pueden realizar hasta tres temblores diferentes (consulte la figura 1 para la sincronización).</li>
</ol>8. Células de linaje OL cosechay cultivo
NOTA: Estos pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
<ol><li>El día después del temblor, preparar el medio Bottenstein-Sato (BS) según la Tabla 1.</li>
	<li>Enjuague los platos Petri recubiertos 3 veces con agua destilada estéril.</li>
	<li>El sobrenadante de los matraces de cosecha que contiene principalmente células de linaje OL, pero también algunas células microgliales y lo clomanan en platos Petri de 100 mm no recubiertos. NOTA: Este paso permite la eliminación de células microgliales a través de una adhesión rápida diferencial en la superficie del plato.</li>
	<li>Incubar los platos de Petri durante 15 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.</li>
	<li>Llenar cada matraz T150 con 25 ml de medio de cultivo recién preparado y incubar en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2 hasta el segundo temblor.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante de los platos Petri a nuevos platos Petri de 100 mm no recubiertos para permitir la adhesión de células microgliales residuales.</li>
	<li>Incubar los platos de Petri durante 15 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.</li>
	<li>Retire el sobrenadante, que contiene células de linaje OL no adherentes, y transfieralo a tubos de 50 ml (sobrenadante de 2 platos De Petri para un tubo de 50 ml). Deseche los platos de Petri chapados con microglia.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante durante 5 min a 423 x g. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular con 1 ml de medio de BS. Piscina todos los pellets en un tubo común de 50 ml y ajuste el volumen a 10 ml con medio BS.</li>
	<li>Determinar la densidad celular contando células bajo un microscopio. NOTA: Se debe obtener una densidad de celda entre 3 x 105/mL y 5 x 105/mL.</li>
	<li>Agregue 20 ml de BS si la densidad de celda es mayor o igual que 4 x 105/mL para obtener un volumen final de 30 ml, o agregue solo 10 ml de BS si la densidad de celda es inferior a 4 x 105/mL para obtener un volumen final de 20 ml.</li>
	<li>Placa dos o tres platos Petri pre-revestidos de 100 mm con 10 ml de suspensión celular. Incubar en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.</li>
	<li>Limpie los escombros de los platos de Petri refrescando todo el medio BS 2 h más tarde. NOTA: Examine el cultivo bajo el microscopio antes y después de limpiar para verificar la densidad celular y la eficiencia de la eliminación de escombros.</li>
	<li>Incubar durante 2 días en soporte bis en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2. NOTA: Examine el cultivo bajo el microscopio. La confluencia debe ser del 70% al 80%.</li>
</ol>9. Producción de OCM
NOTA: Realice estos pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
<ol><li>Preparar el medio NB-B27low según el Cuadro 2.</li>
	<li>Renovar medio de cultivo con 10 mL de medio cálido NB-B27low. Incubar durante 2 días en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5% deCO2.</li>
	<li>Cosecha el OCM, es decir, sobrenadante que contiene factores secretos de OL. Filtrar-esterilizar OCM utilizando un filtro de 0,22 m. NOTA: Almacene OCM a 4oC durante un máximo de 2 meses.</li>
</ol>10. Adición de OCM
NOTA: Los pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles. OCM se puede añadir a cultivos de neuronas hipocampales purificadas preparados de acuerdo con el siguiente protocolo14,y obtenido según la adición, 24 h después del aislamiento, los agentes antimitóticos uridina y 5- fluorodeoxiruridina (5 m) durante 36 h.
<ol><li>A 3 DIV, retire todo el medio de cultivo de neuronas que contenga agentes antimitoticos y agregue 500 l de OCM caliente fresco.</li>
	<li>Renueva la mitad del medio cada 3 días con el nB-B27 recién hecho y caliente. NOTA: Estas culturas se pueden mantener hasta 21 DIV.</li>
</ol>11. Adición de OL al cultivo purificado de neuronas hipocampales
NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana de flujo laminar en condiciones estériles. Los OLs se pueden añadir a los cultivos de hipocampo purificados obtenidos de la misma manera que se describió anteriormente.
<ol><li>Preparar el medio de cocultivo según la Tabla 3.</li>
	<li>Recupere la cultura de OL al 70% a 80% de confluencia. Enjuagar con 2 ml de 1x PBS caliente.</li>
	<li>Para separar las células, agregue 2 ml de trippsina al 0,25% a una placa Petri de 100 mm.</li>
	<li>Incubar durante 5 min en una incubadora humidificada a 37oC por debajo del 5%co2.</li>
	<li>Añadir 2 mL de DMEM-10% FCS para bloquear la reacción enzimática. Cosecha el sobrenadante que contiene células de linaje OL.</li>
	<li>Centrífuga a 423 x g durante 5 min en RT. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cocultivo cálido para obtener una concentración de 1,25 x 105 células/ml.</li>
	<li>Agregue OL al cultivo purificado de neuronas del hipocampo eliminando 200 éL de medio de cultivo de neuronas y agregando 200 s de suspensión celular por pozo (2,5 x 104 células/pozo) de una placa de 24 pocillos.</li>
	<li>Refrescar la mitad del medio de cocultura cada 2-3 días. NOTA: Los cocultivos se pueden mantener hasta 24 DIV.</li>
</ol>

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</ol>

Ninguno de los autores tiene intereses en conflicto o en conflicto.

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para obtener cultivos celulares de linaje oligodendroglial altamente enriquecidos a partir de cultivos glialmixtos, adaptados a partir de un método publicado previamente16,y la posterior producción de medio condicionado por OL. Esta técnica de agitación no es costosa, se puede repetir tres veces y es óptima para obtener una gran cantidad de obsturas purificadas, ya que proliferan las células cultivadas en el medio Bottenstein-Sato (BS) que contiene PDGF....

Los oligodendrocitos (OL) son células gliales del sistema nervioso central (SNC) que generan envoltura de mielina alrededor de los axones. Los OL s originan a partir de células precursoras de oligodendrocitos (OPO) que proliferan dentro de las zonas ventriculares del SNC embrionario y luego migran y diferencian en OLs completamente maduras (es decir, células formadoras de mielina)1. Los OPO son abundantes durante el desarrollo temprano, pero también persisten en el cerebro adulto donde representan la mayor población celular proliferativa2. Un solo OL envuelve múltiples axones en secciones no excitables (es decir, internodos), y el borde de cada bucle de mielina se une al axón formando el dominio paranodal que es crucial para las propiedades aislantes de la mielina1,3. Entre los paranodos hay pequeños huecos no mielinizados llamados los nodos de Ranvier. Estos nodos son ricos en canales de sodio (Nav) cerrados por voltaje, lo que permite la regeneración y rápida propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria4. Esta estrecha interacción también permite el apoyo de la energía axonal a través de la toma neuronal de lactato de OLs5,6.
La maduración de las células de linaje oligodendroglial y el proceso de mielinización están estrechamente regulados por sus interacciones con las neuronas7. De hecho, los OL y los OPO, también llamados células NG2, expresan una serie de receptores de neurotransmisores, y pueden recibir información de las neuronas excitatorias e inhibitorias, lo que les permite sentir la actividad neuronal que puede desencadenar su proliferación y / o diferenciación en las células mielinizadoras2. A su vez, los OPO/OLs secretan microvesículas y proteínas en el espacio extracelular que solo o sinérgicamente median las funciones neuromoduladoras y neuroprotectoras8,9,10,11,12. Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan los múltiples modos de interacciones entre las células de linaje oligodendroglial y las neuronas aún no se han descifrado completamente.
Por otra parte, en varias condiciones patológicas del SNC, los OLs se ven afectados principalmente, lo que perturba su interacción con las neuronas. Por ejemplo, en la Esclerosis Múltiple (EP), la disfunción neurológica es causada por la desmielinización focal en el SNC, secundaria a la pérdida de OLs que puede conducir a daño axonal y acumulación de discapacidad relacionada. La remielinización puede tener lugar, aunque insuficientemente en la mayoría de los casos13. Los progresos en la última década, debido al desarrollo de inmunoterapias, han reducido la tasa de recaídas, pero la promoción de la remielinización sigue siendo hasta la fecha una necesidad insatisfecha. Como tal, una mejor comprensión del papel, las funciones y las influencias de los ostales es de particular interés para el desarrollo de nuevas terapias para un amplio espectro de condiciones del SNC.
Aquí, describimos los métodos de purificación y cultivo de OLs. Esto permite un examen preciso de los mecanismos intrínsecos que regulan su desarrollo y biología. Además, estos cultivos de OLs altamente enriquecidos permiten la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM), que se puede agregar a los cultivos de neuronas purificadas para obtener información sobre el impacto de los factores secretos por OLs en la fisiología neuronal y la conectividad. Además, describimos cómo implementar un sistema de cocultivo in vitro donde se combinan oligodendrocitos y neuronas purificados, lo que permite abordar los mecanismos que regulan (re)mielinización.

<table><tbody><tr><td>5-fluorodesoxiuridina</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>suplemento ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>solución de D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNasa (desoxirribonucleasa I)</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100% </td><td>Sigma</td><td>32221-M Etanol</td><td></td></tr><tr><td>70%</td><td>VWR Chemicals</td><td>83801.360</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternera</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher 21103049</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina (PEI)</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato decahidratado</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Bottenstein-Sato (BS) media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin humano</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albúmina sérica bovina)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Pincrédulo de putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Triyodo-L-tironina sal de sodio)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>T4 ( L-tiroxina)</td><td>Sigma</td><td>T1775</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Medios de cocultivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrina humana</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albúmina sérica bovina)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Ceruloplasmina</td><td>Sigma</td><td>239799</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>CNTF humano recombinante</td><td>Sigma</td><td>450-13</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Triyodo-L-tironina sal de sodio)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m filtro</td><td>Sartorius</td><td>514-7010</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>Terumo</td><td>1611127</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de Petri</td><td>Dutscher</td><td>193100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1867</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1869</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Dutscher 067003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 & micro; m filter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binocular</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas grandes</td><td>Fine Science Tools</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Swann-morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas pequeñas Fine</td><td>Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Cuchara quirúrgica pequeña</td><td>Bar Naor Ltd</td><td>BN2706</td><td></td></tr><tr><td>T150 cm2 matraz con tapón de filtro</td><td>Dutscher</td><td>190151</td><td></td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Wistar </td><td>rata Janvier</td><td>RjHAn:WI</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

En el sistema nervioso central, los oligodendrocitos son bien conocidos por su papel en la mielinización de axón, que acelera la propagación de potenciales de acción a través de la conducción saltatoria. Por otra parte, un número creciente de informes sugieren que los oligodendrocitos interactúan con las neuronas más allá de la mielinización, en particular a través de la secreción de factores solubles. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite la purificación de células de linaje oligodendroglial de cultivos celulares gliales que también contienen astrocitos y células microgliales. El método se basa en el temblor nocturno a 37 oC, que permite el desprendimiento selectivo de las células oligodendrogliales y microglia superpuestas, y la eliminación de la microglia por adhesión diferencial. A continuación, describimos el cultivo de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM). También proporcionamos la cinética del tratamiento OCM u oligodendrocitos adición a las neuronas hipocampales purificadas en experimentos de cocultivo, estudiando interacciones oligodendrocitos-neuronas.

En este protocolo, las células de linaje OL se purifican de cultivos gliales sacudiendo astrocitos y microglia. La pureza y el examen fenotípico de los cultivos de OL se pueden evaluar mediante inmunomancha con marcadores gliales15. El análisis de la expresión de diferentes marcadores indicó que los cultivos de OL eran en su mayoría pre-OLs con 90% - 4% de O4+ células, 85% - 7% NG2+ células, y 4.7% a 2.1% de PLP+ células, mientras q...

En este documento, mostramos un método eficiente para la purificación de oligodendrocitos y la producción de medio condicionado por oligodendrocitos que se puede utilizar para experimentos de cocultivo.

Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Describimos un método eficiente de purificación y cultivo de células de linaje oligodendroglial. Esto permite abordar los mecanismos moleculares que controlan la diferenciación de oligodendrocitos y sus interacciones con las neuronas durante el proceso de mielinización. Esta técnica de agitación no es costosa y es óptima para obtener una gran cantidad de oligodendrocitos.Tales cultivos permiten la producción de medios condicionados con oligodendrocitos y co-cultivos de oligodendrocitos con neuronas. La esclerosis múltiple es una enfermedad causada por la des mielinización focal en el sistema nervioso central, secundaria a la pérdida de oligodendrocitos. La cultura de los oligodendrocitos proporciona una herramienta para entender mejor cómo promover la ree mielización.Sólo el cultivo celular oligodendroglial podría proporcionar información sobre los mecanismos intrínsecos que regulan los desarrollos y la biología de los oligodendrocitos. Los co-cultivos con las neuronas permiten obtener información sobre sus impactos en la fisiología neuronal. Para empezar, utilice fórceps curvos para mantener la cabeza del animal a nivel de los ojos.Usa pequeñas tijeras quirúrgicas para hacer una pequeña incisión en la base del cráneo y corta el cráneo siguiendo la línea media del cerebro. Use fórceps para despegar suavemente las dos partes del cráneo de la línea media. Usa una cuchara quirúrgica pequeña para extraer el cerebro de la cavidad de la cabeza.Ponga el cerebro en un plato de Petri de 60 milímetros que contenga glucosa PBS helada en el hielo. Viendo bajo un microscopio estéreo, utilizar fórceps finos para eliminar el cerebelo, el tallo cerebral, y los bulbos olfativos de los hemisferios cerebrales. Utilice fórceps finos para separar los dos hemisferios cerebrales.Usa fórceps finos para despegar las meninges. Ponga los cortices cerebrales en un plato de Petri de 60 milímetros sobre hielo. En una capucha de flujo laminar, usa un bisturí afilado para cortar finamente los cortices cerebrales.Transfiera el tejido picado a un tubo de 50 mililitros que contenga un medio de digestión enzimático. Incubar durante 30 minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Después de eso, utilice una pipeta para eliminar suavemente el medio de digestión enzimática mientras se asegura de que el tejido cortical permanezca en la parte inferior del tubo.Utilice una micropipeta P1000 para añadir un mililitro de sémolo de becerro 10%fetal DMEM y triturar suavemente el tejido. Utilice un filtro de 70 micras y el pistón de una jeringa de un mililitro para filtrar el tejido cortical en un tubo de 50 mililitros. Enjuague el tejido residual en la pared interna del tubo del tubo de 50 mililitros varias veces con suero de pantorrilla DMEM 10%fetal.Llene el tubo de 50 mililitros con suero de ternera DMEM 10%fetal. Centrifugar a 423 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspendir el pellet celular con dos mililitros de suero de ternera DMEM 10%fetal.Triturar suavemente el pellet celular con la micropipeta P1000 y luego, con la micropipeta P200. Diluir la suspensión celular con el volumen adecuado de suero de ternera 10%fetal DMEM. Placa cinco mililitros de la suspensión celular en un matraz T-150 a una densidad de uno por 10 a las quintas células por centímetro cuadrado.Añadir 20 mililitros de sérico becerro dmEM 10% fetal en cada matraz T-150. Incubar en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Después de agitar la muestra durante la noche a 250 rpm y 37 grados Celsius, cosechar el sobrenadante en el matraz que contiene principalmente células de linaje de oligodendrocitos, pero también, algunas células microgliales, y encubrir en platos Petri no recubiertos de 100 milímetros.Incubar los platos de Petri durante 15 minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono. Esto permite la eliminación de células microgliales a través de la adhesión rápida diferencial en la superficie de la antena. Mientras tanto, llene cada matraz T-150 con 25 mililitros de medio de cultivo caliente recién preparado e incubar en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono hasta el segundo temblor.A continuación, transfiera el sobrenadante de los platos petri a nuevos platos Petri no recubiertos de 100 milímetros para permitir la adhesión de células microgliales residuales. Incubar los platos de Petri durante 15 minutos en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono. Retire el sobrenadante de cada dos platos de Petri, que contienen células de linaje de oligodendrocitos no adherentes, y transfiéralo a un tubo de 50 mililitros.Deseche los platos de Petri chapados con microglia. Centrifugar los tubos durante cinco minutos a 423 veces g. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resusppend el pellet celular con un mililitro de medio Bottenstein-Sato.Agrupa todos los pellets en un tubo común de 50 mililitros y ajusta el volumen a 20 o 30 mililitros dependiendo de la densidad celular con el medio Bottenstein-Sato. Plato dos o tres platos Petri precapotados de 100 milímetros con 10 mililitros de la suspensión celular. Incubar en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono.Dos horas más tarde, despeje los escombros de los platos de Petri refrescando todo el medio Bottenstein-Sato. Incubar durante dos días en el medio en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Después de dos días, examine el cultivo bajo un microscopio.En una campana de flujo laminar, en condiciones estériles, renueve el medio de cultivo con 10 mililitros de mpB-27 medio cálido bajo. Incubar durante dos días en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Para cosechar la OCM, recoja el sobrenadante que contiene oligodendrocitos factores secretados.El filtro esteriliza el OCM usando un filtro de 0,22 micras. En este protocolo, las células de linaje de oligodendrocitos fueron purificadas de cultivos gliales sacudiendo los astrocitos y la microglia. El análisis de la expresión de diferentes marcadores indicó que los cultivos de oligodendrocitos eran en su mayoría pre-oligodendrocitos con 90 más o menos 4% de células positivas de O4, 85 células positivas más o menos 7%NG2, y 4,7 más o menos 2,1% de células positivas PLP, mientras que 7,2 más o menos 2,5% de las células eran astroteocitos positivos GF.OCM producido a partir de tales cultivos se añadieron a los tres días in vitro a los cultivos purificados de neuronas hipocampales. Este tratamiento promueve la agrupación de proteínas notales. La mielinización de las neuronas del hipocampo se estudió mediante la adición de oligodendroctyes a los 14 días in vitro.De 20 a 24 días in vitro, la inmuno tinción de marcadores de mielina, como la proteína básica de mielina, permitió la visualización de los segmentos y nodos de mielina de Ranvier. El núcleo PBS es importante para la eliminación de meninges. El aclaramiento rápido es fundamental para la viabilidad de los oligodendroctyes y la realización de las fortalezas del flujo aplicado con la pipeta.El medio condicionado con oligodendrocitos se puede agregar a las culturas neuronales para obtener información sobre el impacto de los oligodendrotidos secretos factores en la fisiología neuronal. También se pueden realizar co-cultivos de oligodendroctyes con neuronas para estudiar el proceso de mielinización.

generation-oligodendrocytes-oligodendrocyte-conditioned-medium-for-co

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este artículo se describen los métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos murinas (OPC) en cultivo primario, que se diferencian para producir oligodendrocitos maduros (MCO). Además, este informe se describen las técnicas para producir murino myelinating co-cultivos de siembra de los OPC del ratón sobre un lecho de neuritas de neuronas de ratón ganglio de la raíz dorsal (DRGNs).

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

Primario, fetales humanos derivado del cerebro, células progenitoras multipotenciales...

Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

Este video muestra un protocolo detallado para aislar las paredes del ventrículo lateral del cerebro de ratón adulto y realizar la disociación enzimática del tejido para obtener células individuales. A continuación, estas células se someten a condiciones de cultivo específicas que potencian selectivamente la proliferación de células madre neurales y promueven su diferenciación en cocultivos de oligodendrocitos y astrocitos.

Obtención de un cultivo mixto de oligodendrocitos y astrocitos a partir de células madre neurales de ratón adulto

Este video demuestra el establecimiento de un cocultivo de neuronas inducidas humanas (iNs) y células precursoras de oligodendrocitos inducidos (iOPCs). Las iNs se mezclan con iOPCs en un co-cultivo y luego se incuban para apoyar la maduración de ambas iNs en neuronas y de iOPCs en oligodendrocitos. Las neuronas forman conexiones sinápticas con otras neuronas y oligodendrocitos, mientras que los oligodendrocitos desarrollan vainas de mielina alrededor de los axones de las neuronas.

Un método de cocultivo para modelar las interacciones neurona-oligodendrocito

El video muestra un protocolo para diferenciar células precursoras de oligodendrocitos (OPC) en oligodendrocitos e inducir mielinización en un cocultivo con neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG). Las OPC se transducen con vectores lentivirales que codifican una proteína de señalización que regula la mielinización. Las OPC transducidas se cocultivan con neuronas DRG para evaluar la diferenciación en oligodendrocitos y la mielinización inducida por proteínas de señalización.

Ensayo de mielinización inducida por transducción in vitro para células precursoras de oligodendrocitos

Este video demuestra la producción de medio condicionado por oligodendrocitos (OCM) a partir de células del linaje de oligodendrocitos estresándolas para mejorar su liberación molecular en el medio. Este medio, que es rico en factores de crecimiento, citocinas y otras moléculas bioactivas, se puede agregar a los cultivos de neuronas para obtener información sobre el impacto de los factores secretados por oligodendrocitos en la fisiología y la conectividad neuronal.

Un método para generar medio condicionado por oligodendrocitos

Este video muestra una técnica para aislar y cultivar células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) de la corteza cerebral de una cría de ratón.

Aislamiento y cultivo de células precursoras de oligodendrocitos de la corteza cerebral de cachorros de ratón

Las células globoides son una característica patológica definitoria de la enfermedad de Krabbe, una leucodistrofia que actualmente carece de una terapia efectiva a largo plazo. Hemos desarrollado un modelo de cultivo celular para estudiar la biología innata y el potencial patogénico de la microglía activada y su transformación en células globoides.

Un In Vitro Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

Aquí presentamos protocolos que ofrecen una base flexible y estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrocitos para sobreexpresar proteínas de interés con el fin de interrogar específicamente su papel en oligodendrocitos a través del modelo in vitro de mielinización del sistema nervioso central.

Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para In Vitro Ensayos de mielinización

Las interacciones neurona-glial en la neurodegeneración no se comprenden bien debido a herramientas y métodos inadecuados. Aquí, describimos protocolos optimizados para obtener neuronas inducidas, células precursoras de oligodendrocitos y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes humanas y proporcionamos ejemplos de los valores de estos métodos para comprender las contribuciones específicas del tipo de célula en la enfermedad de Alzheimer.

Generación de neuronas humanas y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes para modelar las interacciones neuronal-oligodendrocitos

Describimos la producción de cultivos mixtos de astrocitos y células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales fetales o adultas que se diferencian en oligodendrocitos maduros, y el modelado in vitro de estímulos nocivos. El acoplamiento con una técnica de detección de alto contenido basada en células construye un sistema de detección de drogas confiable y robusto.

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Aprende a purificar oligodendrocitos y producir medio condicionado para experimentos de cocultura con neuronas. Este método eficiente permite estudiar los mecanismos de mielinización y diferenciación celular en neurociencia.

Generación de oligodendrocitos y medio condicionado por oligodendrocitos para experimentos de cocultura

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