Un método de detección para la identificación de medicamentos que promueven la heterocromatina utilizando Drosophila
12 de marzo de 2020
Drosophila es un modelo experimental ampliamente utilizado adecuado para la detección de medicamentos con posibles aplicaciones para la terapia oncológica. Aquí, describimos el uso de fenotipos de color ocular variegados Drosophila como un método para el cribado de compuestos de moléculas pequeñas que promueven la formación de heterocromatina.
Actualmente no hay fármacos que están bien establecidos en la promoción de la formación de heterocromotina. Aquí presentamos un método simple y eficiente para identificar compuestos de moléculas pequeñas que promueven este proceso. Nuestro protocolo de cribado proporciona un sistema in vivo simple, económico y fácil de seguir para la identificación de fármacos que promueven la heterocromtina.
La identificación de compuestos que promueven la formación de heterocromtina puede conducir al descubrimiento de mecanismos de cáncer que la reparación y la terapia contra el cáncer. Este costo efectivo se ha medido para identificar compuestos que promueven la heterocromattina en Drosophila también podría utilizarse para contar los impactos de la forma, ya que es una medida preventiva para un grupo celular más alto de cribado celular. Nuestro protocolo de cribado también podría ser útil para las pantallas piloto rápidas, ya que este sistema Drosophila TranSheet produce un fenotipo de color ocular variado que está inversamente correlacionado con la cantidad de heterocromatina presente en la mosca.
Ayudando a demostrar el procedimiento será Kenny Dao, un estudiante de grado de nuestro laboratorio. Después de identificar y preparar una biblioteca de medicamentos para un cribado utilizando un disolvente adecuado, y la concentración deseada, cruce tres moscas macho con tres o más moscas hembra vírgenes en un vial de alimento de 25 por 95 milímetros. Con nueve milímetros de medio alimenticio Drosophila estándar.
Configure tres viales de réplica para cada medicamento. Agregue un vial de control para la pantalla. Y deje que las moscas pongan huevos durante dos días a temperatura ambiente.
En el segundo día de la cruz, anestesia a las moscas con una breve ráfaga de dióxido de carbono. Y deseche las moscas madre en una botella que contenga 70% de etanol. A continuación, diluir cada compuesto de fármaco de la población inicial para asistir a la concentración final micro molar en 33%DMSO en agua.
Y añadir 60 microlitros de la droga, o el control 33%DMSO solo, encima de la mosca de alimentos. A continuación, confirme que no hay moscas madre presentes dentro de los viales. Y añadir la solución de drogas a los viales apropiados.
Dos días después de la llegada de las moscas F1, transfiera moscas anestesiadas de un vial a la vez a una almohadilla de disección porosa con dióxido de carbono filtrando desde debajo del papel de filtro. Bajo un microscopio diseccionado, examine cada mosca entera, identificando a todos los machos heterocigotos por su falta del fenotipo rizado de ala rizada con o-dominante. Puntuar el color de los ojos de cada macho heterocigoto en una escala de uno a cinco.
Con una puntuación asignada a una superficie total de ojo disperso menos del 5% rojo. Añade una puntuación de dos a las moscas con una superficie total de ojo manchado de 6 a 25% rojo. Un tres a las moscas con una superficie total de ojo manchado de 26 a 50% rojo.
Un cuatro a las moscas con una superficie total de ojo manchado 51 a 75%rojo. Y un cinco vuela con una superficie total de ojo manchado superior al 75%. A continuación, calcule el índice de color medio de todos los machos de cada vial puntuado en triplicado.
Para confirmar que los compuestos de hecho promueven la formación de heterocromtina, se puede realizar una técnica de validación diferente, como la hinchazón occidental. En este experimento representativo, una biblioteca de fármacos de moléculas pequeñas, el conjunto de oncología 3, que se compone de 97 medicamentos oncológicos autorizados por la FDA, se probó utilizando la cepa DX1 de Drosophila Melanogaster. Según el ensayo de cribado, el metotrexato, codificado como E7 en la biblioteca, causó la mayor variación dentro de la cepa Dx1.
Sugiriendo que el metotrexato podría ser el fármaco más prometedor que promueve la heterocromattina para la futura terapia dirigida al cáncer. Para confirmar aún más que este compuesto promueve la transformación de la heterocromtina, se realizaron datos de manchas occidentales. Demostrar la regulación hacia arriba de la proteína asociada a la formatina heterocromática, la trimetilación H3K9 y validar los resultados del cribado.
El paso crítico es anotar el color de los ojos de cada uno de los moscas macho heterocigotas blancas 11-18 DX1 en una escala de uno a cinco según una ruta de estudio predeterminada. Podemos usar manchas occidentales o inmunosuchación para confirmar los impactos. El descubrimiento de compuestos que se sospecha que promueven la formación de heterocromíntina también puede conducir al descubrimiento del mecanismo genético IV del desarrollo del cáncer y ensayos clínicos en pacientes humanos.
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Descripción general
Este estudio presenta un método para la selección de compuestos de bajo peso molecular que promueven la formación de heterocromatina utilizando Drosophila. El enfoque utiliza fenotipos de color de ojo variegado como indicador de los niveles de heterocromatina, proporcionando un sistema sencillo y eficiente in vivo para la identificación de fármacos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Selección de fármacos
- Genética
Antecedentes
- La heterocromatina desempeña un papel crucial en la regulación génica y la función celular.
- Los métodos actuales para promover la formación de heterocromatina son limitados.
- Drosophila sirve como un organismo modelo eficaz para estudios genéticos.
- Los fenotipos de color de ojo variegado pueden indicar los niveles de heterocromatina in vivo.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rentable para identificar compuestos que promuevan la formación de heterocromatina.
- Utilizar Drosophila como modelo para tamizar fármacos con potencial terapéutico contra el cáncer.
- Establecer un protocolo fácil de seguir y económico.
Métodos Utilizados
- Selección de compuestos de bajo peso molecular en Drosophila.
- Evaluación de los fenotipos de color de ojo como indicador de la presencia de heterocromatina.
- Implementación de un protocolo sencillo de cribado in vivo.
- Evaluación de la correlación entre el color del ojo y los niveles de heterocromatina.
Resultados principales
- El protocolo de cribado identificó con éxito compuestos que promueven la formación de heterocromatina.
- Los fenotipos de color de ojo variegado se correlacionaron con la cantidad de heterocromatina.
- El método resultó ser eficiente y rentable para la identificación de fármacos.
- Se discutieron las implicaciones potenciales para la terapia contra el cáncer.
Conclusiones
- Este estudio proporciona un enfoque novedoso para la selección de fármacos en la investigación del cáncer.
- Drosophila puede utilizarse eficazmente para identificar compuestos que promueven la heterocromatina.
- Los hallazgos podrían contribuir a comprender los mecanismos y tratamientos del cáncer.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método proporciona un sistema in vivo rentable para identificar compuestos que promueven la heterocromatina, abordando una laguna en el descubrimiento de fármacos epigenéticos para terapias contra el cáncer. Al aprovechar la variegación ocular de Drosophila como lectura cuantitativa, permite la validación temprana de dianas y la reducción del riesgo mecanicista de los mecanismos epigenéticos. El enfoque respalda la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes y la selección de carteras para programas de descubrimiento centrados en oncología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con la formación de heterocromatina y la regulación epigenética en el cáncer.
- Valor operativo: Proporciona un sistema sencillo y económico in vivo para la validación funcional de dianas de modificadores epigenéticos.
- Valor predictivo: Apoya la reducción del riesgo biológico al vincular los efectos del compuesto con cambios en proteínas asociadas a la heterocromatina, como la trimetilación de H3K9.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera puntuaciones cuantitativas del color de ojos (1–5) que se correlacionan con los niveles de heterocromatina para la priorización de compuestos.
- Valor operativo: Ofrece un protocolo estandarizado y reproducible que utiliza la puntuación en viales por triplicado y el cálculo del índice medio de color.
- Preparación del ensayo: Permite la evaluación confiable de compuestos en un sistema relevante a la enfermedad con infraestructura mínima.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor traslacional: Conecta los hallazgos en Drosophila con los mecanismos del cáncer humano mediante vías epigenéticas conservadas.
- Continuidad preclínica: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la validación de resultados con métodos ortogonales como el inmunotransferencia (western blotting).
- Reducción del riesgo mecanicista: Ayuda a elucidar los mecanismos epigenéticos del desarrollo del cáncer a través de compuestos promotores de heterocromatina identificados.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en las etapas iniciales de descubrimiento hasta la identificación de fármacos líderes, proporcionando datos de cribado epigenético que orientan el avance de compuestos activos hacia fármacos líderes en programas de oncología.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre dianas epigenéticas y la aclaración de vías mediante lecturas de formación de heterocromatina.
- Selección: Proporciona sistemas biológicos listos para ensayos con resultados cuantitativos y escalables para la evaluación de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Permite comparaciones basadas en datos mediante el índice medio de color y el análisis estadístico de los resultados de viales triplicados.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica al confirmar resultados positivos con biomarcadores de proteínas de heterocromatina.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de selección epigenética para múltiples clases de dianas en oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la regulación epigenética.
- Valor operativo: Proporciona estandarización, reproducibilidad y escalabilidad mediante puntuaciones simples in vivo y pruebas replicadas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción, la eficiencia del capital y reduce el riesgo biológico en fases tardías del descubrimiento de fármacos epigenéticos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de compuestos basados en su actividad promotora de heterocromatina.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en genética de Drosophila y manejo de compuestos para la preparación de bibliotecas.
- Necesita microscopía de disección estándar y herramientas de evaluación para la fenotipificación del color de ojos.
- Exige estandarización entre equipos para un montaje de viales, evaluación e interpretación de datos consistentes.
- Incluye consideraciones de adaptación al extenderse a otros sistemas modelo o clases de compuestos.
- Comprende limitaciones prácticas, como la subjetividad en la evaluación y la necesidad de validación ortogonal de los resultados positivos.
