Name: Observación microscópica multifotópica de vasos en el tejido hepático del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprende a visualizar vasos sanguíneos en el hígado de ratón mediante microscopía multifotónica con Rhodamine B isothiocyanate–dextran. Esta técnica permite observar estructuras tridimensionales en tejido vivo.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81772133, 81902444), el Fondo de Ciencias Naturales de Guangdong (2020A1515010269, 2020A1515011367), el Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología de la Salud Ciudadana de Guangzhou (201803010034, 201903010072) y el Proyecto militar de innovación médica (17CXZ008).

Todos los cuidados y procedimientos de los animales se ajustaban a las políticas del Hospital Nanfang de China para la salud y el bienestar (aplicación No: NFYY-2019-73).
1. Preparación del ratón
<ol><li>Anestesia el ratón.<ol>
<li>Preparar pentobarbital sódico (50 mg/kg) en una jeringa.</li>
		<li>Coge el ratón (macho de 8 semanas C57BL/6) con la mano izquierda para que su vientre esté mirando hacia arriba y su cabeza sea más baja que su cola. Desinfectar la piel abdominal con un 75% de alcohol.</li>
		<li>Sosteniendo la jeringa en la mano derecha, perfore la línea blanca del abdomen con la aguja ligeramente hacia el lado derecho de la piel por 3-5 mm. Asegúrese de que la aguja de la jeringa y la piel estén en un ángulo de 45°, inyecte el pentobarbital lentamente en la cavidad abdominal.  Después del afeitado, desinfecta alrededor del sitio de incisión del ratón 3 veces alternativamente con 75% de alcohol y solución de clorhexidina.</li>
		<li>Compruebe si la anestesia tuvo éxito por la falta de un reflejo corrector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyectar rhodamina B isoticianato-dextrano en la vena caudal.<ol>
<li>Preparar 100 μL de 10 mg/ml de isoticianato-dextrano de ródamina B en una jeringa.</li>
		<li>Limpie la cola del ratón con un 75% de alcohol.</li>
		<li>Sujete la cola con la mano izquierda, sostenga la jeringa en la mano derecha con la aguja paralela a la vena e inyecte el tinte de 100 μL.</li>
		<li>Detenga el sangrado con un hisopo de algodón después de la inyección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remoje el pelaje abdominal del ratón con gasa mojada con agua estéril y afeite el abdomen del ratón con una navaja, haciendo trazos en la dirección del pelaje. Después del afeitado, desinfecta alrededor del sitio de incisión del ratón 3 veces alternativamente con 75% de alcohol y solución de clorhexidina.</li>
	<li>Después de limpiar una almohadilla de calefacción con un 75% de alcohol, abra la almohadilla de calefacción y coloque el ratón sobre su espalda en la almohadilla de calefacción para mantener su temperatura corporal a 37 °C.</li>
</ol>2. Fijación del hígado del ratón con el marco de imágenes del órgano corporal
NOTA: El marco comercial de imágenes de órganos aún no se ha lanzado.
<ol><li>Coloque una ventosa limpia en una posición fija.</li>
	<li>Instale un accesorio de imagen de órgano(Figura Suplementaria 1)y limpie la almohadilla de calefacción y la ventosa con un 75% de alcohol.</li>
	<li>Conecte la ventosa (5 mm de diámetro) a la manguera de la bomba de vacío y encienda la bomba de vacío.</li>
	<li>En una mesa estéril esterilizada con un 75% de alcohol, desinfecta alrededor del sitio de incisión del ratón 3 veces alternativamente con 75% de alcohol y solución chlorhexidina, luego desinfecta alrededor del sitio de incisión del ratón 3 veces alternativamente con 75% de alcohol y solución chlorhexidina, luego use tijeras quirúrgicas para cortar 2 cm de piel del borde inferior del esternón del ratón y exponer el hígado.</li>
	<li>Coloque el ratón junto con la almohadilla de calefacción en la base del soporte.</li>
	<li>Ajuste el accesorio de imágenes de órganos para que la ventosa contenga el hígado. A continuación, utilice una presión negativa de 30-35 kPa para la succión para que el hígado se une a la ventosa (Figura suplementaria 2).</li>
</ol>3. Ajuste del microscopio de escaneo láser multifotófonos
<ol><li>Encienda el microscopio multifotón y seleccione el objetivo de 60x/1.00 W.</li>
	<li>Corrija el marco y el ratón debajo de la lente objetiva.</li>
	<li>Añade una gota de solución salina normal que pueda cubrir toda la lente, que es el centro de la ventosa, y ajusta la lente objetivo para tocar la solución salina normal.</li>
	<li>Haga doble clic en el icono del ordenador para activar el software láser y encender el interruptor. A continuación, mantenga pulsado el botón de encendido y el obturador durante 3 s.</li>
	<li>Ajuste la longitud de onda a 800 nm.</li>
	<li>Inicie el software operativo del microscopio con el ordenador.</li>
	<li>Para la configuración de adquisición, establezca Láser 800.</li>
</ol>4. Observación utilizando microscopio de escaneo láser multifotófonos
<ol><li>En Control de adquisición deimágenes, haga clic en el conmutador Fluorescent.</li>
	<li>Asegúrese de que las luces de la habitación y del equipo estén apagadas. Para reducir los niveles de ruido, utilice el microscopio en un entorno oscurecido.</li>
	<li>Abra el obturador de la trayectoria de la luz en el microscopio.</li>
	<li>Gire el filtro de fluorescencia a la cuarta marcha y tire de las dos palancas del interruptor óptico.</li>
	<li>Mirando a través del ocular, utilice los quasispirals de enfoque grueso y fino para ajustar la distancia focal, y utilice los ejes X/Y para ajustar el campo de visión para encontrar el área objetivo.</li>
</ol>5. Micrografía de escaneo láser multifotófono
<ol><li>Apague el interruptor fluorescente del software, cambie el filtro fluorescente a la segunda marcha (el segundo engranaje es RXD1) y empuje las dos palancas del interruptor óptico.</li>
	<li>Haga clic en Centrar ×2 para obtener una vista previa del área de destino y ajustar la configuración de adquisición y los parámetros de control de adquisición de imágenes (resolución de imagen: 1024).</li>
	<li>Pulse Control + C y ajuste el alto voltaje, ganancia y desplazamiento (para reducir los niveles de ruido).</li>
	<li>Haga clic en Detener para detener la vista previa, haga clic en el botón XY para escanear en dos dimensiones y guárdelo después de la finalización (Figura 1).</li>
	<li>Seleccione una región, haga clic en Profundidady, a continuación, vista previa para seleccionar el conjunto final y el conjunto de inicio (consulte la parte completa requerida del vaso sanguíneo) en el ajuste Microscopio. Escanear imágenes 3D y guardar después de la finalización (Figura 2).</li>
	<li>Seleccione una región, haga clic en Tiempoy ajuste otros parámetros de configuración de adquisición y control de adquisición de imágenes (Tamaño del paso: 1 μm; Rodajas: 10; Número de escaneo de tiempo: 40). Escanee diferentes sectores y guarde después de la finalización para obtener imágenes en movimiento (Vídeo 1). NOTA: Pida a alguien que cuide a los ratones durante el análisis y agregue anestesia en consecuencia.</li>
	<li>Sacrificar el ratón por disección del cuello.</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li>
<li>Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+mass-forming+cholangiocarcinoma+growing+in+a+giant+hepatic+hemangioma%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report.</a> Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410(2019).</li>
<li>Werkmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+for+blood+vessel+imaging%3A+new+non-invasive+tools+%28Spectral+SHG%2C+FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM).</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+optical+microangiography+provide+accurate+imaging+of+capillary+vessels%3F%3A+validation+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).</li>
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<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Vogt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+multiphoton+imaging+of+the+whole+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatic multiphoton imaging of the whole brain.</a> Nature Methods. 16 (6), 459(2019).</li>
<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+amyloid-%CE%B2+deposits+in+brains+of+living+mice+permits+direct+observation+of+clearance+of+plaques+with+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy.</a> Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).</li>
<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Deep-Brain+Structural+and+Hemodynamic+Multiphoton+Microscopy+Enabled+by+Quantum+Dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots.</a> Nano Letters. , (2019).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Shear, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peer+Reviewed%3A+Multiphoton-Excited+Fluorescence+in+Bioanalytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry.</a> Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+fully+human+anti-TEM1+scFv+in+models+of+solid+tumor+imaging+and+immunotoxin-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).</li>
<li>Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in biological research.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Observar un tejido vivo específico es un medio eficaz para comprender los cambios, la localización y los efectos biológicos del material dentro del tejido17. En este experimento, los pasos importantes son la fijación del hígado con un accesorio de imágenes de órganos, que puede resolver el problema de los artefactos de movimiento debido a la respiración y los latidos del corazón, y el uso de un microscopio multifotófonos para la observación. Utilizando este método, los tejidos internos del hígado ...

Los vasos sanguíneos pueden proporcionar nutrientes para varios tejidos de órganos del cuerpo humano, e intercambiar sustancias. Al mismo tiempo, muchas citoquinas, hormonas, medicamentos y células también funcionan a través del transporte vascular a lugares específicos. Observar los cambios vasculares en el tejido hepático puede ayudar a entender la distribución del flujo sanguíneo en el tejido hepático y el transporte de sustancias, y ayudar en el análisis de ciertas enfermedades relacionadas con la vascular1,2.
Hay muchas maneras de observar los vasos sanguíneos del hígado en ratones. Entre ellos, la microscopía óptica tiene muchas limitaciones en la observación del tejido vascular opaco3. Microscopía multifotónica se puede utilizar para imagen de los vasos sanguíneos de hígados vivos con alta resolución no invasiva4. No sólo se pueden obtener imágenes tridimensionales de los vasos sanguíneos, sino que la técnica también se puede utilizar para ayudar a organizar el tejido para observar los efectos biológicos en los mismo; además, todo el tejido se puede imaginar en lugar de sólo los microvessels como en la tomografía computarizada y la resonancia magnética5.
Microscopía multifotónica se puede utilizar para detectar eficazmente señales fluorescentes dispersas en tejido vivo profundo, con menos fototoxicidad6. Por lo tanto, la actividad del tejido vivo se puede asegurar, y la cantidad de daño se puede reducir. La microscopía multifotónica tiene mejor potencia penetrante que la microscopía confocal, lo que permite observar capas más profundas7,proporcionando imágenes 3D únicas. La microscopía multifotónica se utiliza ahora a menudo en los nervios craneales por imágenes8 y se ha extendido al estudio de la dinámica neuronal en ratones vivos9,10,11.
En este experimento, después del etiquetado fluorescente de los vasos sanguíneos de ratón, el hígado se fija en un marco, y la dinámica de los vasos sanguíneos en el tejido hepático vivo se puede ver utilizando microscopía multifotónica. Este experimento demuestra cómo marcar sustancias específicas, utilizar microscopía multifotónica para ayudar a observar una ubicación dentro del tejido, observar eventos celulares en el tejido intercelular, hacer mediciones fotoquímicas12,13,14,y observar la dinámica del material dentro del tejido vivo15. Por ejemplo, el marcador endotelial tumoral 1 (TEM1) ha sido identificado como un nuevo marcador de superficie regulado en los vasos sanguíneos y el estroma en muchos tumores sólidos, marcando el fragmento variable de una sola cadena (scFv) 78 contra TEM1, y luego la microscopía multifotona se puede utilizar para la localización y evaluación del hemangioma del ratón16.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL x 2</td><td>Hunan Pinan Medical Devices Technology</td><td>YA0551</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica de 5 W</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td></td></tr><tr><td>75% etanol absoluto</td><td>Guangdong Guanghua Sci-Tech</td><td>1.17113.023</td><td></td></tr><tr><td>Bola de algodón absorbente</td><td>Healthy Sanitation Kingdom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse instrumento quirúrgico</td><td>RWD Life Science</td><td>SP0001-G</td><td>Incluyendo tijeras y pinzas</td></tr><tr><td>Microscopía multifotónica</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de imagen de órganos</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td>Incluye ventosa, manguera, bomba de presión negativa y soporte</td></tr><tr><td>de isotiocianato de rodamina B; Dextran</td><td>Sigma</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>Afeitadora</td><td>Lei Wa</td><td>RE-3201</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Sigma</td><td>P3761-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

observación microscópica multifotópica de vasos en el tejido hepático del ratón

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

Observar la dinámica intravascular del tejido hepático del ratón nos permite realizar observaciones y estudios más profundos sobre las enfermedades relacionadas con los tejidos del hígado del ratón. Un ratón se inyecta con un tinte que puede manchar los vasos sanguíneos. Para observar el hígado del ratón in vivo, se expone y fija en un marco. Las imágenes bidimensionales y tridimensionales de los vasos sanguíneos del tejido hepático se obtienen utilizando un microscopio multifotófonos. Las imágenes de los tejidos en los sitios seleccionados se adquieren continuamente para observar cambios a largo plazo; también se observan los cambios dinámicos de los vasos sanguíneos en los tejidos hepáticos. La microscopía multifotónica es un método para observar la función celular y celular en secciones u órganos de tejido profundo. La microscopía multifotónica tiene sensibilidad a la microestructura tisular y permite la toma de imágenes de tejidos biológicos a alta resolución espacial in vivo, proporcionando la capacidad de capturar la información bioquímica de la organización. Microscopía multifoto se utiliza para observar parte del hígado, pero arreglar el hígado para hacer la imagen más estable es problemático. En este experimento, se utiliza una ventosa de vacío especial para arreglar el hígado y obtener una imagen más estable del hígado bajo el microscopio. Además, este método se puede utilizar para observar cambios dinámicos de sustancias específicas en el hígado marcando tales sustancias con colorantes.

La distribución de los vasos sanguíneos en el hígado se puede ver en la Figura 1,obtenida utilizando microscopía multifotónica. El vaso sanguíneo se divide en una pluralidad de ramas que emanan de un tronco y se distribuyen al espacio circundante. La circunferencia externa del vaso sanguíneo es roja, la cavidad interna es oscura y hay muchas cosas dentro. Cuanto más clara sea la imagen, más cerca del plano de observación será. También hay algunas manchas rojas alrededor, probablemente porque...

En este experimento, un ratón se inyecta en su vena trasera con isoticianato-dextrano Rhodamine B que puede manchar los vasos sanguíneos. Después de que el hígado está expuesto y fijo, una parte específica del hígado se puede seleccionar para observar el tejido profundo en el cuerpo vivo utilizando microscopía multifotónica.

Observación microscópica multifotópica de vasos en el tejido hepático del ratón

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

Este método puede ayudarnos a visualizar los movimientos de los vasos sanguíneos dentro del hígado del ratón a lo largo de la evolución de la dinámica del hígado en múltiples dimensiones. Usando este método, podemos visualizar la dinámica de los vasos sanguíneos dentro del hígado en tres dimensiones. Hemos demostrado el uso de tinte vascular, pero puede realizar la tinción del vaso con su sustancia de interés antes de la visualización microscópica.Después de confirmar la falta de reflejo de derecha en un macho anestesiado de ocho semanas de edad C 57 negro seis ratón. Limpie la cola del ratón con un 75% de alcohol y use una jeringa de un microlitro equipada con una aguja de calibre 30 para inyectar 10 miligramos por mililitro de ródamina B isotiocyanato-dextrano recién preparado en 100 microlitros de Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran en la vena de cola caudal. Cuando se haya entregado toda la solución, utilice un hisopo de algodón para aplicar presión al lugar de la punción y use gasa húmeda con agua estéril para remojar el pelaje abdominal.Usa una maquinilla de afeitar para afeitar el abdomen, haciendo golpes en la dirección del pelaje, y coloca el ratón en una almohadilla de calentamiento desinfectada de 37 grados Celsius, alcohol. Para arreglar el hígado del ratón con un marco de imágenes de órganos corporales, primero coloque una ventosa limpia de cinco milímetros de diámetro en una posición fija y limpie la almohadilla de calefacción y la ventosa con un 75% de alcohol. Conecte la ventosa a la manguera de la bomba de vacío y encienda la bomba.En una mesa esterilizada 75% alcohol use tijeras quirúrgicas para cortar dos centímetros de piel del borde inferior del esternón del ratón y exponer el hígado. Coloque el ratón y la almohadilla de calentamiento en la base del soporte del marco del cuerpo y ajuste el accesorio de imágenes de órganos para que la ventosa pueda sostener el hígado. A continuación, utilice una presión negativa de 30 a 35 kilopascales para succión para que el hígado se adhieran a la taza.Para configurar el microscopio de escaneo láser multifotófono, encienda el microscopio y seleccione el objetivo 60 X. Fije el marco y el ratón debajo del objetivo y agregue una gota de solución salina normal a la taza lo suficientemente grande como para cubrir la lente. Ajuste el objetivo para que la lente toque la solución salina normal y encienda el software láser.Encienda el láser y mantenga pulsado el botón de encendido y el obturador durante tres segundos. A continuación, inicie el software operativo del microscopio y ajuste el láser a 800 nanómetros. Para configurar el control de adquisición de imágenes, haga clic en el interruptor fluorescente y apague las luces de la habitación y del equipo.Abra el obturador de la trayectoria de luz en el microscopio y gire el filtro de fluorescencia a la cuarta marcha. Tire de las dos palancas del interruptor óptico y mirando a través de la pieza del ojo, utilice el curso y las cuasi espirales de enfoque fino para ajustar la distancia focal. A continuación, utilice los ejes X Y para ajustar el campo de visión para localizar el área de destino.Para obtener imágenes, apague el interruptor fluorescente del software y cambie el filtro fluorescente a la segunda marcha. Empuje las dos palancas del interruptor óptico y haga clic en los tiempos de enfoque dos para obtener una vista previa del área objetivo ajustar la configuración de adquisición y los parámetros de control de adquisición de imagen y presionar el control más C para ajustar la ganancia y el desplazamiento de alto voltaje. Haga clic en Detener para detener la vista previa, haga clic en el botón X Y para escanear en dos dimensiones y haga clic en Guardar.Seleccione una región y haga clic en profundidad y vista previa para seleccionar los conjuntos de finalización e inicio en la configuración del microscopio. Escanea imágenes 3D y guarda. Después de escanear, seleccione una región haga clic en el tiempo y ajuste la otra configuración de adquisición y los parámetros controlados por adquisición de imágenes.A continuación, escanee los diferentes sectores y guárdelo para obtener la película de imagen resultante. Aquí se puede observar la visualización de la distribución de vasos sanguíneos dentro del hígado utilizando microscopía de múltiples fotones como se ha demostrado. Este vaso sanguíneo se divide en una pluralidad de ramas que emanan de un tronco y se distribuyen en el espacio circundante.La circunferencia externa del vaso sanguíneo se puede observar en rojo, mientras que la cavidad interna es oscura, como se observa en el video los objetos no rojos que se mueven dentro de los vasos podrían ser células. La oscuridad del tejido observado en este video es probable debido a que el hígado no se ha fijado bien con el tiempo. Es importante recordar que cómo se fija el hígado sin cicatrices, afecta la estabilidad de la imagen.Esta metodología también se puede aplicar a la posición de otras estructuras dentro del hígado para la observación directa de la distribución o cambios en estructuras laborales específicas de interés.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un sistema óptico fue desarrollado para visualizar la microcirculación hepática con eritrocitos de FITC-etiquetados y para medir la presión parcial de oxígeno en los microvasos con asistida por láser fosforimetría. Este método puede ser utilizado para investigar los mecanismos fisiológicos y patológicos mediante el análisis de la estructura microvascular, el diámetro, la velocidad del flujo de sangre, y la tensión de oxígeno.

Visualización y análisis de flujo de la sangre y del consumo de oxígeno en la microcirculación hepática: Aplicación a un Modelo de cuadro de hepatitis aguda

Recientemente desarrollados utilizando técnicas de imagen de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF) puede ayudar a dilucidar el papel del sistema linfático juega en la metástasis del cáncer, la respuesta inmune, la reparación de heridas, y otras enfermedades asociadas linfático.

No invasiva imágenes ópticas de la vasculatura linfática de un ratón

Este video describe un procedimiento de imagen para observar y estudiar la dinámica intravascular de un tejido hepático de ratón utilizando microscopía multifotónica después de la estabilización del órgano. La microscopía multifotónica permite obtener imágenes de tejido biológico in vivo con alta resolución espacial.

Visualización vascular basada en microscopía multifotónica: una técnica de imagen asistida por dispositivo de estabilización para obtener imágenes multidimensionales de vasos sanguíneos en hígado de ratón

Este artículo informa sobre un método detallado para la medición dinámica y cuantificación de la velocidad del flujo sanguíneo dentro de los vasos sanguíneos individuales de la vasculatura hepática del ratón utilizando imágenes de microscopía intravital en combinación con una metodología específica para la adquisición y análisis de imágenes.

Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em&gt; Leishmania</em&gt; Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

La obtención de imágenes intravitales estables de alta resolución de las células inmunitarias en el hígado es un reto. Aquí proporcionamos un método altamente sensible y confiable para estudiar la migración y las interacciones célula-célula de las células inmunitarias en el hígado de ratón durante largos períodos (alrededor de 6 horas) mediante microscopía de escaneo láser multifotónico intravital en combinación con monitoreo de cuidados intensivos.

Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

Establecimos un protocolo quirúrgico novedoso para la proyección de imagen de dos fotones de hígado en ratones con la invasión mínima. Con esta técnica identificamos la estructura detallada del hígado durante la endotoxemia inducida por lipopolisacáridos. Esperamos que este método puede utilizarse para determinar la efectividad del tratamiento de reactivos diferentes a la migración de leucocitos hepáticos.

Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido

Aquí se presenta un protocolo para estudiar la microcirculación coronaria en el tejido cardíaco murino vivo mediante la monitorización ex vivo de la presión arterial perfusión y el flujo que mantiene la presión, así como componentes de árboles vasculares incluyendo los lechos capilares y pericitos, ya que la arteria septal está cánulada y presurizada.

Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

Aquí, describimos un protocolo simple y económico para realizar una cuantificación no sesgada de la densidad microvascular pulmonar para tejido pulmonar de ratones enteros utilizando la tinción única de Isolectin B4.

Cuantificación de la densidad microvascular pulmonar en ratones a través de los lóbulos

La ecografía Doppler ultrarrápida (UFUS) con alta resolución espacial (100 μm) y sensibilidad representa una modalidad de imagen no invasiva adecuada para obtener una visión cualitativa completa de la vasculatura hepática. UFUS también facilita las mediciones cuantitativas de la microvasculatura, con el objetivo de mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad vascular.

Imagen y cuantificación de la vasculatura hepática de ratones mediante ecografía Doppler ultrarrápida

Aprende a visualizar vasos sanguíneos en el hígado de ratón mediante microscopía multifotónica con Rhodamine B isothiocyanate–dextran. Esta técnica permite observar estructuras tridimensionales en tejido vivo.

Observación microscópica multifotópica de vasos en el tejido hepático del ratón

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