Name: Imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del Arabidopsis Shoot Apical Meristem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Aprende a realizar imágenes de células vivas del citoesqueleto de microtúbulos en el meristemo apical caulinar de Arabidopsis. Este método permite analizar cuantitativamente las respuestas mecánicas en plantas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Crecimiento de la planta
<ol><li>Cerda semillas de Arabidopsis que expresan el dominio de unión a microtúbulos fusionado con proteína fluorescente verde (MBD-GFP)10 en el suelo y mantener en largo día (16 h día /8 h noche), condiciones de 20 oC/6 oC durante 1 semana para la germinación.</li>
	<li>Después de la germinación, transfiera las plántulas a nuevas macetas con suficiente espacio de crecimiento para permitir un crecimiento vegetativo robusto. Mantener las plantas en día corto (8 h día /16 h noche), 20 oC/16 oC condiciones durante 3-5 semanas.</li>
	<li>Transferir las plantas a un día largo (16 h día /8 h noche), condiciones de 20 oC/16 oC y mantener hasta que las plantas se atornillen (2-3 semanas). Deje que la inflorescencia crezca hasta 2-5 cm de largo.</li>
</ol>2. Preparación media
<ol><li>Preparar los platos diseccionados llenando pequeños platos de Petri (aproximadamente 5,5 cm de ancho, 1,5 cm de profundidad) a aproximadamente la mitad de su profundidad con 2% de agarosa. Los platos diseccionados también se pueden utilizar para imágenes de punto de tiempo único.</li>
	<li>Preparar el medio de crecimiento.<ol>
<li>Preparar 50 ml de una solución de 1.000x de vitaminas con 5 g de myo-inositol, 0,05 g de ácido nicotínico, 0,05 g de clorhidrato de piridoxina, 0,5 g de clorhidrato de tiamina y 0,1 g de glicina.</li>
		<li>Preparar el medio de crecimiento, compuesto por 1/2 Murashige y Skoog medio, 1% sacarosa, 1,6% de agar, 1x vitaminas, pH a 5,8. Autoclave y dejar que se enfríe.</li>
		<li>En un banco estéril y limpio, esteriliza las cajas de plástico con bisagras (aproximadamente 5,2 cm x 5,2 cm x 3 cm) sumergiendo en etanol al 70% durante 15 min.</li>
		<li>En un banco estéril y limpio, una vez que el medio esté a calor soportable, agregue N6-benzyladenine a una concentración final de 200 nM, y 1/1,000 PPM (mezcla conservante vegetal) y mezcle bien. Llene las cajas estériles hasta aproximadamente la mitad de su profundidad con el medio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Disección del SAM
<ol><li>Cortar la inflorescencia y eliminar los brotes de flores más antiguos con fórceps afilados pelando las flores en la base de los pedúnculos hasta que sea difícil verlos a simple vista.</li>
	<li>Crea una hendidura en la agaria en el plato diseccionado con fórceps y planta la base de inflorescencia en el agar grueso. Esto proporciona un buen soporte sólido para una mayor disección fina de flores más jóvenes para exponer el SAM.</li>
	<li>Retire los cogollos de flores restantes empujándolos hacia abajo con los fórceps comenzando con los más antiguos y avanzando secuencialmente a las etapas más jóvenes bajo un microscopio diseccionante hasta que el SAM sea visible. El SAM generalmente se expone cuando se retiran flores más viejas hasta la etapa 6 a 7. Una vez expuesto el SAM, evite la deshidratación de la muestra moviéndose rápidamente al siguiente paso.</li>
</ol>4. Transferencia y crecimiento de SAM cultivados
<ol><li>Plantar la muestra recién diseccionada como se detalla en la sección 1 en el medio de crecimiento en la caja de cultivo con bisagras de plástico rectangular con el SAM justo expuesto por encima de la superficie media. Agregue unas gotas de agua estéril desionizada a los bordes de las cajas de cultivo y cierre la tapa para mantener la humedad dentro de la caja. Asegúrese de que el agua añadida no cubra el SAM.</li>
	<li>Cierre la tapa y envuelva la caja con cinta adhesiva de microprés. Colocar la caja de crecimiento en condiciones de día largo o continuo a 22oC y crecer durante 12-24 h para permitir que el SAM se recupere del procedimiento de disección y se adapte a las condiciones de cultivo.</li>
</ol>5. Imágenes del SAM
<ol><li>Llene la caja de cultivo que contiene el SAM con agua desionizada estéril para cubrir la muestra. Compruebe bajo el microscopio de disección y retire cualquier burbuja de aire pulverizando con fuerza el agua dirigida a la muestra con una pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Coloque la caja de cultivo en una etapa vertical del microscopio confocal. Tenga cuidado de que la caja de cultivo no se ponga en contacto con los objetivos del microscopio. Utilice una lente de inmersión de agua de larga distancia de 40x o 60x de apertura numérica 0.8-1 que sea óptima para la toma de imágenes sin un cristal de cubierta.</li>
	<li>Baje el objetivo en el agua y compruebe si hay burbujas de aire formadas en la lente frontal del objetivo. Retire cualquier burbuja bajando el escenario y limpiando suavemente la lente con un tejido óptico y añadiendo una pequeña cantidad de agua a la lente frontal del objetivo con una pipeta Pasteur antes de reimmersionar al agua.</li>
	<li>Con el filtro GFP y el módulo de epi-iluminación del microscopio confocal, ajuste el controlador XY para localizar la muestra. Ajustando la posición de los oculares, coloque el SAM directamente debajo de la fuente de luz y enfoque a lo largo del eje Z hasta que se encuentre el ápice. NOTA: No mire directamente a la luz ultravioleta.</li>
	<li>Una vez encontrada la muestra, iluminízla usando un láser capaz de hacer una GFP emocionante (es decir, una fuente láser de 488 nm o 496 nm). Ajuste el zoom óptico del microscopio para que todo el SAM y la etapa 1 primordia floral estén en el campo de visión. Ajuste aún más la potencia de la salida láser y los ajustes de ganancia para garantizar una relación señal-ruido óptima. NOTA: La alta intensidad del láser dará lugar al blanqueo fotográfico de la muestra. La paleta de subexposición y sobreexposición ayuda a garantizar un mejor ajuste de estos ajustes.</li>
	<li>Deje que la muestra se asiente durante 2-5 min. Adquiera pilas Z confocales de la muestra a intervalos de rodajas Z de 0,25 m-0,5 m a una resolución de aproximadamente 0,3 m de tamaño de píxel. Asegúrese de que el tiempo total de imágenes necesario para adquirir pilas Z para una muestra no exceda de 10 minutos desde el momento en que la muestra se sumerge en agua hasta la finalización de la adquisición.</li>
	<li>Retire inmediatamente el agua y transfiera la caja de cultivo de vuelta a la cámara de crecimiento. Mantener las muestras durante mucho tiempo bajo el agua influirá en el estado osmótico de las células.</li>
</ol>6. Perturbación micromecánica del SAM
<ol><li>Configure las condiciones de imagen como se describe en la sección 5 y adquiera pilas de imágenes de preablación de la organización de microtúbulos corticales.</li>
	<li>Decantar el agua en el plato de cultivo. Realice la ablación con una aguja de jeringa limpia (0,4 mm x 20 mm).<ol>
<li>Con un microscopio de disección, sostenga cuidadosamente la aguja y acérquese lentamente al SAM. NOTA: La respiración y el manejo de la aguja con un agarre relajado ayudan a evitar el temblor.</li>
		<li>Póngase en contacto brevemente con la cúpula de SAM con la punta de la aguja para confirmar que la ablación está hecha. Preferiblemente realizar la ablación en la periferia del SAM, que permite la visualización del comportamiento y la transición de microtúbulos corticales no organizados en la región central de la cúpula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rellene el plato de cultivo con agua estéril desionizada y añada propidium idodide (10 g/ml). Además de monitorear la señal de microtúbulo cortical GFP, visualizar el yoduro propidium utilizando un canal separado puede marcar claramente las regiones de las células abladas. El yoduro de propídium se ilumina utilizando el 561 nm o cualquier otro láser adecuado con emisión registrada entre 600-650 nm.</li>
	<li>Adquiera pilas de imágenes justo después de la ablación (ver sección 6) y repita el proceso de adquisición cada 2 h durante un período de 6 h. Devuelva el plato de cultivo junto con la muestra a la cámara de incubación después de cada punto de tiempo. Asegúrese de que quede algo de agua en los medios de cultivo y envuelva el plato de cultivo con cinta adhesiva de micropore para evitar la desicación.</li>
</ol>7. Visualización y cuantificación de datos
<ol><li>Genere proyecciones de superficie utilizando software de libre acceso como MORPHOGRAPHX11,FIJI12o macro SurfCut13.</li>
	<li>Realizar la extracción de anisotropía de microtúbulo cortical utilizando FibrilTool14 macro en FIJI. NOTA: Los protocolos detallados para el uso del software se pueden obtener de las respectivas citas.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
<li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li>
<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La evaluación de los eventos de transducción de señales mecánicas es crucial para identificar los reguladores moleculares involucrados en las vías de mecanoso-percepción y transducción. El protocolo descrito aquí proporciona una visión cuantitativa de tales eventos utilizando la respuesta de microtúbulo cortical como lectura para dicho proceso en los SAM de Arabidopsis. El procedimiento descrito aquí se utiliza habitualmente en varios estudios en diversos tipos de tejidos16,<su...

Las células vegetales están rodeadas por una matriz extracelular de polisacáridos y glicoproteínas que se asemeja mecánicamente a un material compuesto reforzado con fibra capaz de cambiar dinámicamente sus propiedades mecánicas1. El crecimiento de las células vegetales es impulsado por la absorción de agua en la célula, lo que resulta en una acumulación concomitante de fuerzas de tracción en la pared celular. En respuesta a tales fuerzas, las modificaciones en el estado físico de la pared celular permiten la expansión de la célula. Las células con paredes primarias son capaces de experimentar un crecimiento rápido en comparación con la pared celular secundaria que contiene células principalmente debido a las diferencias en la composición química de los polisacáridos en su interior. Las células de la pared primaria se componen de celulosa, hemicelulosa y pectina además de glicoproteínas, y carecen de lignina, un componente que está presente en la pared celular secundaria2. La celulosa, un polímero de glucosa unido a través de enlaces β-1,4, es el componente principal de las paredes celulares. Se organiza en estructuras fibrilares que son capaces de soportar las fuerzas de alta tracción experimentadas durante el crecimiento celular3. Además de soportar las fuerzas de tracción, el refuerzo mecánico a lo largo de una dirección preferencial da como resultado una expansión impulsada por el turgor a lo largo de un eje perpendicular a la orientación neta de la microfibrilla de celulosa. La organización de las microfibrillas de celulosa está influenciada por el citoesqueleto de microtúbulo cortical, ya que guían el movimiento direccional de los complejos de celulosa-sintetización situados en la membrana plasmática4. Por lo tanto, el monitoreo de la organización de microtúbulos corticales utilizando una proteína o tubulina asociada a microtúbulos fusionada con una molécula fluorescente sirve como un proxy para la observación de patrones excesivos de celulosa en las células vegetales.
El patrón del citoesqueleto de microtúbulo cortical está bajo el control de las fuerzas mecánicas derivadas de la morfología celular y tisular. La organización de microtúbulos corticales no tiene ninguna organización preferencial a lo largo del tiempo en las células situadas en el ápice del SAM, mientras que las células de la periferia y el límite entre el SAM y el órgano emergente tienen una matriz supracelular estable y altamente organizada de microtúbulos corticales5. Se han desarrollado varios enfoques para perturbar físicamente el estado mecánico de las células. Los cambios en el estado osmótico, así como el tratamiento con compuestos farmacológicos y enzimáticos que influyen en la rigidez de la pared celular pueden dar lugar a cambios posteriores en las fuerzas de tracción experimentadas por la célula6,7. El uso de artilugios que permitan el aumento gradual de las fuerzas de compresión experimentadas por los tejidos es otra alternativa8. También se ha demostrado que la aplicación de fuerzas centrífugas influye en las fuerzas mecánicas sin ningún contacto físico con las células9. Sin embargo, los medios más utilizados para cambiar las fuerzas direccionales en un grupo de células aprovechan el hecho de que todas las células epidérmicas están bajo tensión y la ablación física de las células eliminará la presión del turgor localmente, así como la alteración de la adhesión de célula a célula, modificando así las fuerzas de tracción experimentadas por las células vecinas. Esto se realiza ya sea apuntando a un láser ultravioleta pulsado de alta potencia o por medio de una aguja fina.
Aquí profundizamos en el proceso de toma de imágenes y evaluación del comportamiento de los microtúbulos corticales para la perturbación mecánica en el SAM.

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td></tr><tr><td>glicina</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 microscopio confocal Leica</td><td></td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td></tr><tr><td>cinta de microporos</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>mio-inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-benciladenina</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>ácido nicotínico</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>caja con bisagras de plástico</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM (Mezcla de conservantes vegetales)</td><td>Tecnología de células</td> vegetales <td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de piridoxina</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>clorhidrato de tiamina</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del arabidopsis shoot apical meristem

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Comprender la regulación a nivel celular y tisular del crecimiento y la morfogénesis ha estado a la vanguardia de la investigación biológica durante muchas décadas. Los avances en tecnologías moleculares y de imagen nos permitieron obtener información sobre cómo las señales bioquímicas influyen en los eventos morfogenéticos. Sin embargo, es cada vez más evidente que aparte de las señales bioquímicas, las señales mecánicas también afectan a varios aspectos del crecimiento celular y tisular. El arabidopsis shoot apical meristem (SAM) es una estructura en forma de cúpula responsable de la generación de todos los órganos sobre el suelo. La organización del citoesqueleto de microtúbulo cortical que media la deposición de celulosa apoplástica en las células vegetales es espacialmente distinta. La visualización y evaluación cuantitativa de patrones de microtúbulos corticales son necesarias para comprender la naturaleza biofísica de las células en el SAM, ya que la celulosa es el componente más rígido de la pared celular de la planta. La forma estereotipada de la organización de microtúbulos corticales también es una consecuencia de las fuerzas físicas de todo el tejido existentes en el SAM. La perturbación de estas fuerzas físicas y el posterior seguimiento de la organización de microtúbulos corticales permite la identificación de proteínas candidatas implicadas en la mediación de la mecano-percepción y transducción. Aquí describimos un protocolo que ayuda a investigar tales procesos.

La Figura 1 muestra imágenes de proyección típicas obtenidas de líneas MBD-GFP con celdas en el centro de la cúpula que contienen microtúbulos corticales desorganizados, y celdas en la periferia que tienen una distribución circunferencial (Figura 1A,B), mientras que las celdas de dominio de límite contienen microtúbulos corticales alineados paralelos al eje largo de la célula. Estas observaciones muestran diferen...

Aquí describimos un protocolo para la toma de imágenes de células vivas del citoesqueleto de microtúbulo cortical en el brote de meristem apical y el seguimiento de su respuesta a los cambios en las fuerzas físicas.

Imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Este protocolo nos ayuda a entender cómo se produce el comportamiento del citoesqueleto de Microtúbulo en las plantas. Al mismo tiempo, también nos ayuda a entender cómo estos componentes estructurales que influyen en la forma celular y de los órganos, responden a los cambios en las fuerzas mecánicas. Aunque, este método requiere poca sofisticación, proporciona lectura robusta y cuantitativa, las diferencias de respuesta mecánica entre diferentes genotipos y condiciones.Comience por cultivar semillas de arabidopsis que expresen dominios de unión de microtúbulos fusionados con proteína fluorescente verde en el suelo, a 20 y 6 grados centígrados en condiciones de día largo durante una semana. Después de la germinación, transfiera las plántulas a nuevas macetas con suficiente espacio de crecimiento para permitir un crecimiento vegetativo robusto, y coloque las plantas en 20 y 16 grados centígrados en condiciones de día corto. Después de tres a cinco semanas, transfiera las plantas a condiciones de día largo a la misma temperatura hasta que las plantas se atornillen, permitiendo que la inflorescencia crezca hasta dos a cinco centímetros de largo.Para la disección Shoot Apical Meristem, putt la inflorescencia, y utilizar fórceps afilados para pelar las flores en la base de los pedúnculos, hasta que es difícil ver los pedúnculos a simple vista para eliminar los brotes de flores más antiguos. Utilice los fórceps para crear una hendidura en los agros en un plato diseccionador, y plantar la base de inflorescencia en el grueso Augur. Coloque el plato debajo de un microscopio de disección.Comenzando con el brote de flor más antiguo, empuje con los fórceps para eliminar el brote de la flor de la planta. El brote de meristem apical generalmente se expone cuando se retiran flores más viejas hasta la etapa seis a siete. Y usa los fórceps para empujar cada brote de flores hacia abajo hasta que el brote apical meristem sea visible.Tan pronto como se exponga el meristem apical de brote, deje que la muestra recién diseccionada en el medio de crecimiento en una caja de cultivo con bisagras de plástico rectangular esterilizado con etanol con el meristem apical de brote acaba de exponer por encima de la superficie media. Agregue unas gotas de agua estéril desionizada a los bordes de la caja de cultivo y cierre la tapa para mantener la humedad dentro de la caja. Envuelva la caja con cinta adhesiva de micropore y coloque la caja de crecimiento en condiciones diurnas largas o continuas a 22 grados Centígrados durante 12 a 24 horas.Cuando la planta se haya recuperado del procedimiento de disección, cubra la muestra con agua estéril desionizada y compruebe si hay burbujas de aire bajo el microscopio de disección. Transfiera la caja de cultivo a una etapa de microscopio confocal vertical y seleccione la lente de inmersión de agua 40 o 60X. Baje el objetivo en el agua y compruebe si hay burbujas de aire en la lente frontal del objeto.Para eliminar las burbujas, baje el escenario y limpie suavemente la lente con un tejido óptico. A continuación, utilice una pipeta Pasteur para añadir un pequeño volumen de agua a la lente frontal del objetivo antes de volver a sumergir la lente en el agua. A continuación, utilice el filtro GFP y el módulo de epi-iluminación del microscopio confocal para ajustar el controlador XY para localizar la muestra.Ajuste de la posición de los oculares, coloque el meristem apical de disparo directamente debajo de la fuente de luz y enfoque a lo largo del eje Z hasta que se encuentre el ápice. Utilice un láser capaz de emocionante GFP para iluminar la muestra, y ajustar el zoom óptico del microscopio, de modo que todo el brote apical meristem y la etapa una primordia floral están en el campo de visión. A continuación, ajuste la potencia de la salida láser y los ajustes de ganancia para obtener una relación señal-ruido óptima.Después de permitir que la muestra se asiente durante dos a cinco minutos, adquiera pilas Z confocales de la muestra a intervalos de rodajas Z de 0,25 a 0,5 micrómetros, añadiendo aproximadamente 0,3 micrometros de resolución de tamaño de píxeles. Al final de la adquisición, retire inmediatamente el agua y transfiera la caja de cultivo de vuelta a la cámara de crecimiento. Para Micromechanical Shoot Apical Meristem Perturbation, adquiera pilas de imágenes de preablación de la organización de microtúbulos corticales como acaba de demostrar, y descafeinar el agua de la caja de cultivo en un plato de cultivo.Transfiera el meristem apical de disparo bajo un microscopio diseccionado, y lentamente se acercó al meristem apical de brote con una aguja limpia de jeringa de 0,4 por 20 milímetros. Póngase en contacto brevemente con la periferia de la cúpula del meristem apical de disparo con la punta de la aguja para confirmar que se ha completado la ablación. Y rellene el plato de cultivo con agua estéril desionizada.A continuación, añadir 10 microgramos por mililitro de yoduro propidio al plato y adquirir inmediatamente pilas de imagen como se demuestra cada dos horas durante seis horas, devolviendo el plato de cultivo a la incubación entre cada punto de tiempo. Para el análisis de datos, genere proyecciones de superficie de las pilas de imágenes utilizando un programa de software de análisis de imágenes adecuado y realice la extracción de la anisotropía de microtúbulos corticales utilizando la macro de herramientas fibril en Fiji. Aquí, se pueden observar imágenes de proyección típicas obtenidas de líneas GFP de dominio de unión de microtúbulos con celdas en el centro de la cúpula que contienen microtúbulos corticales desorganizados, celdas en la periferia, que tienen una distribución circunferencial y celdas de dominio de límite que contienen microtúbulos corticales alineados en paralelo al eje largo de la célula.La imagen de lapso de tiempo, muestra la alineación de los microtúbulos corticales que cambia de una matriz altamente desordenada a una matriz más organizada dentro de las seis horas de la ablación. Los tensores podrían ser superpuestos en las imágenes de microtúbulos corticales, y la información extraída podría representarse trazando la anisotropía media a lo largo del tiempo. Al ajustar la potencia de salida del láser y los ajustes de ganancia, debemos asegurar la observación clara de los filamentos y tratar de evitar la sobreexposición, ya que sobre las señales saturadas podría sesgar la dirección de tracción en análisis posteriores.La microscopía de fuerza atómica también se puede realizar para evaluar cómo los cambios en las fuerzas mecánicas afectan realmente el estado físico de la pared celular.

live-cell-imaging-microtubule-cytoskeleton-micromechanical

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describe un protocolo utilizando portaobjetos de cámara y los medios para inmovilizar los cotiledones de la planta para la formación de imágenes confocal de la epidermis durante varios días de desarrollo, la documentación de diferenciación estomática. Proteínas marcadas con fluoróforo se puede seguir dinámicamente por la expresión y localización subcelular, mejorar la comprensión de sus posibles funciones durante la división celular y la diferenciación de células de tipo.

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

La señalización de Ca2 + regula diversos procesos biológicos en las plantas. Aquí presentamos los enfoques para el control de estrés abiótico inducida espacial y temporal Ca 2 + señales en las células y tejidos que usan las codificados genéticamente Ca 2 + indicadores Aequorina o Case12 Arabidopsis.

Medición Espacial y Temporal Ca 2 + Las señales en plantas de Arabidopsis

imagen confocal en vivo ofrece biólogos con una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la imagen confocal en vivo de flores en desarrollo de Arabidopsis.

Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

Este artículo muestra cómo cultivar plántulas de Arabidopsis thaliana en una plataforma de dos capas de microfluidos que confina la raíz principal y pelos de la raíz a un solo plano óptico. Esta plataforma puede utilizarse para imágenes ópticas en tiempo real de la morfología de la raíz fina, así en cuanto a la proyección de imagen de alta resolución por otros medios.

La morfología del pelo de la raíz de plántulas de Arabidopsis en una plataforma de microfluídica de dos capas de imagen

Divulgamos un método sencillo y versátil para realizar fluorescente live-proyección de imagen de hojas de Arabidopsis thaliana durante un período prolongado de tiempo. Utilizamos una planta Arabidopsis transgénica expresando un gen reportero fluorescente bajo el control de un promotor de inmunidad como un ejemplo para obtener comprensión espaciotemporal de inmunorespuestas de la planta.

Un método versátil para el montaje de Arabidopsis las hojas para la proyección de imagen de Time-lapse Intravital

Este protocolo presenta cómo viven la imagen y analizar los meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas mediante microscopía confocal de barrido láser.

Proyección de imagen confocal vivo de meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas

Aquí, describimos la generación y aplicación de un conjunto de transgénicas de Arabidopsis thaliana líneas de expresión inducible, tejidos específicos que en los tres principales meristemos, el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium.

Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación

Aquí, describimos una mejora del método semi-in vitro (SIV) para observar la guía y recepción del tubo polínico en Arabidopsis thaliana, lo que aumenta la receptividad de los óvulos. El método SIV cum septum de alto rendimiento puede combinarse con líneas marcadoras de gametofitos y biosensores codificados genéticamente para monitorear el proceso dinámico de fertilización.

Imágenes en vivo de la recepción del tubo polínico de Arabidopsis y la doble fertilización utilizando el método semi-in vitro cum septum

Aquí se introducen varios métodos de uso común para estudiar los eventos de tráfico de membrana de una quinasa receptora de membrana plasmática. Este manuscrito describe protocolos detallados que incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocales.

Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

El movimiento cromosómico durante la profase meiótica es un fenómeno poco conocido que es fundamental para la formación de esporas. Este protocolo describe un método para adquirir, analizar y cuantificar los movimientos del centrómero durante la profase meiótica en los meiocitos masculinos de Arabidopsis thaliana .

Caracterización por imágenes en vivo de los movimientos del centrómero durante la profase meiótica masculina en Arabidopsis thaliana

Este proceso utiliza microscopía confocal junto con un núcleo marcado fluorescentemente y una línea de marcadores de cromatina en Arabidopsis thaliana para registrar simultáneamente la dinámica del núcleo y la cromatina en raíces de Arabidopsis e investigar cambios en estas dinámicas en respuesta a señales de desarrollo y ambientales.

Imagen cuantitativa de células vivas de la forma nuclear y la dinámica de la cromatina durante el desarrollo y el estrés ambiental en la raíz de Arabidopsis thaliana

Aprende a realizar imágenes de células vivas del citoesqueleto de microtúbulos en el meristemo apical caulinar de Arabidopsis. Este método permite analizar cuantitativamente las respuestas mecánicas en plantas.

Imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Explorar más videos