Identificación de campo de Matricaria chamomilla utilizando un sistema qPCR portátil

La práctica de usar productos botánicos para mejorar la salud se remonta a miles de años atrás. Recientemente, el aumento de la demanda, junto con las prácticas de cosecha insostenibles y el cambio climático, han puesto un énfasis en la cadena de suministro. Debido a esto, la adulteración botánica se está convirtiendo en una preocupación creciente, haciendo de la identificación botánica una parte cada vez más esencial del control de calidad.

Idealmente, la identificación se realiza lo más cerca posible de la fuente, por lo que los recursos se pueden asignar eficientemente al material de identidad correcta. Hay una serie de enfoques para la identificación botánica. Tradicionalmente, la identificación botánica se realiza a través de la evaluación morfológica y métodos analíticos químicos.

La identificación morfológica se basa en las diferencias en las características macroscópicas y microscópicas de los materiales vegetales. Sin embargo, requiere un botánico bien entrenado y su aplicación a materiales botánicos en polvo es limitada. Los métodos analíticos químicos se utilizan ampliamente en farmacopeas y laboratorios, pero no son ideales para pruebas de campo debido al tamaño de los instrumentos y los requisitos ambientales.

Recientemente, los métodos genómicos han surgido como una técnica alternativa para la identificación de especies botánicas debido a la alta fidelidad y especificidad de la información genómica en los materiales vegetales. Con las herramientas de diagnóstico molecular ahora disponibles en forma de dispositivos portátiles, este enfoque se hace posible para la aplicación de campo. El objetivo de este protocolo es introducir un método de identificación botánica en situaciones en las que el acceso al equipo de laboratorio y la experiencia es limitado, como la granja que suministra el material botánico, utilizando un sistema portátil qPCR.

Matricaria chamomilla, comúnmente conocida como manzanilla alemana, se ha utilizado como un medicamento herbario para promover la salud durante siglos. Para demostrar la especificidad del método actual, se incluye para la comparación la diferenciación de la manzanilla alemana de otra flor de manzanilla de uso común, conocida como manzanilla romana. El procedimiento de identificación de campo se demuestra en medio de una granja de manzanilla alemana.

Configure un área de prueba en el campo con una superficie plana y horizontal. Identificar una planta representativa que refleje las características de la mayoría de las plantas en el campo de flores de manzanilla. Escoja una cabeza de flor de la planta representativa con guantes estériles.

Coloque la muestra en un tubo de recogida de 2,0 mililitros. Repita y recoja un prospecto de aproximadamente 0,5 a 0,7 centímetros de largo de la misma planta. Precalienta la incubadora de baño seco a 95 grados centígrados.

A cada tubo de recogida, añada 100 microlitros de la solución de extracción del kit de extracción de ADN vegetal. Para una mejor eficiencia de extracción de ADN, muele la muestra usando un tejido de pestle. Cierre el tubo.

Asegúrese de que el tejido botánico esté cubierto por la solución de extracción durante todo el proceso de extracción. Coloque los tubos de recogida en una incubadora de baño seco precalentada e incubar los tubos de recogida a 95 grados centígrados durante 10 minutos Después de 10 minutos, saque los tubos de la incubadora de baño seco. Añadir 100 microlitros de la solución de dilución del kit de extracción de ADN y mezclar la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Repita el mismo paso para la extracción de prospectos. Agitar para mezclar la solución aún más. El problema de la planta generalmente no parece estar degradado después de este tratamiento.

El color líquido puede cambiar y volverse turbio. Configure las condiciones de termociclismo del instrumento qPCR según la tabla uno, que comienza con un paso de temperatura constante para la desnaturalización inicial, seguido de 25 ciclos de amplificación y termina con rampa de temperatura para obtener una curva de fusión de alta resolución. Descongele la mezcla maestra qPCR y las imprimaciones enumeradas en la tabla dos a temperatura ambiente antes de su uso.

Planifique la reacción que se cargará en cada pozo. Pozos que contienen controles positivos con las especies objetivo, controles positivos con especies no objetivo, muestras y controles negativos. En este ejemplo, se utilizan 10 pozos, cinco para la prueba de identificación de la manzanilla alemana y otros cinco para la prueba de identificación de la manzanilla romana.

Para cada tipo de prueba de identificación de especies, un pozo contiene un control positivo con ADN extraído del material de referencia de especies objetivo, un pozo contiene un control positivo con ADN extraído de material de referencia de especies no dirigidas, dos pozos están llenos de muestras de ADN de flores y hojas extraídas del campo, y un pozo se asigna para un control negativo. La tabla tres describe cada tipo de pozo. Preparar una mezcla maestra de reacción de acuerdo con la tabla cuatro para cada prueba de identificación de especies botánicas.

Una mezcla maestra de reacción típica contiene mezcla maestra universal de qPCR, dos veces, imprimaciones específicas de especies hacia adelante y hacia atrás, y agua libre de nucleasas. Mezcla exhaustiva de la mezcla maestra de reacción por pipeteo antes de su uso. Coloque el cartucho de reacción PCR boca arriba sobre una superficie plana y estable.

Cargue 18 microlitros de la mezcla maestra de reacción configurada en el paso anterior en los pozos de cartuchos de acuerdo con los pozos definidos aquí. Para esta demostración, agregue la mezcla maestra de reacción de prueba de identificación de manzanilla alemana en pozos etiquetados para la prueba GC, GCT en pozos uno, tres, cinco, siete, nueve, y la mezcla maestra de reacción de prueba de identificación de manzanilla romana en pozos etiquetados para prueba RC, RCT en pozos dos, cuatro, seis, ocho, 10. Transfiera dos microlitros de ADN de muestra del sobrenadante de los tubos de extracción de ADN y controles positivos de ADN preextraídos en pozos de cartucho precargados con mezcla maestra qPCR.

Después de agregar cada plantilla de ADN a la mezcla maestra qPCR, mezcle suavemente la solución pipeteando. Selle cuidadosamente el cartucho con película adhesiva. Cargue el cartucho en la cámara de termociclismo y ciérrelo.

Ajuste el instrumento qPCR para que se ejecute. En el protocolo actual, el tinte intercalante se utiliza para medir la amplificación de los fragmentos de destino en tiempo real. El valor Ct se define como el número de ciclos necesarios para que la señal fluorescente cruce el umbral predefinido.

Un valor de Ct inferior a 25 ciclos se consideró como amplificación positiva. En esta figura, el control positivo romano sólo se amplificó en la prueba de identificación de la manzanilla romana, pero no en la prueba de identificación de la manzanilla alemana. El control positivo de la manzanilla alemana y las muestras de campo sólo se amplificaron en la prueba de identificación de la manzanilla alemana, pero no en la prueba de identificación de la manzanilla romana.

El control negativo no se amplificó en ninguna de las pruebas. Para confirmar aún más la amplificación específica en controles y muestras positivas, fracciones de PCR y productos de cada pozo se ejecutaron con gel de agarosa al 2% en el laboratorio. Todos los pozos con un valor Ct inferior a 25 producen amplicons en sus tamaños esperados, que difieren entre la manzanilla alemana y la manzanilla romana.

El resto de los carriles no mostró ningún producto de amplificación específico, de acuerdo con la ausencia de señal fluorescente para estos pozos como se observa en las pruebas de campo. Después de la amplificación de PCR, se realizó un análisis de curva de fusión utilizando el mismo software que se utilizó para monitorear la señal fluorescente. Con el aumento de la temperatura, los amplicons de doble hebra comienzan a disociarse, lo que resulta en la disminución de la intensidad de la fluorescencia.

Los cambios en la intensidad de la fluorescencia se convirtieron aún más en curvas de pico de fusión para una mayor diferenciación de la manzanilla alemana de la manzanilla romana por sus característicos picos de fusión. En esta figura, el pico de fusión del control positivo de la manzanilla alemana es de 85,6 grados centígrados y es distinto del pico de fusión del control positivo de la manzanilla romana. Los amplicons PCR de muestras de campo producen picos de fusión cerca del control positivo de la manzanilla alemana.

La identidad de la muestra de campo se determina en función de la amplificación específica y la temperatura de fusión característica que coincide con los controles. En este ejemplo, tanto la flor como la hoja recogidas en el campo se identifican como Matricaria chamomilla, manzanilla alemana. Los resultados de las pruebas de manzanilla romana para estas dos muestras son negativos.

El protocolo demuestra la identificación de la manzanilla alemana en el campo utilizando un sistema portátil qPCR. Métodos similares podemos desarrollar para ampliar la cartera de botánicos que se pueden probar. Esperamos que este video proporcione valiosos materiales de capacitación para que los científicos, incluso los no expertos realicen la identificación botánica sobre el terreno o en un entorno con equipos de laboratorio limitados.

Las pruebas de identificación de campo basadas en ADN no solo producen resultados muy precisos que coinciden con el análisis de laboratorio, sino que también reducen el tiempo y los costos asociados con los métodos tradicionales realizados en un laboratorio.