Realización de biopsias de pellizcar guiadas por colonoscópicas en ratones y evaluación de cambios de tejido posteriores

Este método proporciona un enfoque ideal para estudiar la cicatrización de heridas en colones y los cambios moleculares e histológicos que se producen después de la lesión. Este método también puede arrojar luz sobre la patogénesis de la EII. La principal ventaja de esta técnica es controlar con precisión la ubicación de la lesión y el momento del proceso de curación de la herida.

Individuos que realizan este método por primera vez pueden tener dificultades para insertar el colonoscopio en el colon del ratón y crear heridas consistentes. La práctica repetitiva de estas técnicas debe superar estos problemas. Dados los múltiples pasos coordinados y matices implicados con este procedimiento, la demostración visual de este método es fundamental.

Antes de comenzar el procedimiento, inserte un endoscopio de agujero rígido de 1,9 milímetros en una vala de endoscopio. Y conecte el endoscopio ensamblado a la fuente de luz y al dispositivo de imágenes de vídeo siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice el tubo proporcionado para conectar la bomba de aire a la válvula de gas en el lado izquierdo de la vaina junto al canal de trabajo.

Asegúrese de que el canal de trabajo esté en posición abierta e inserte tres fórceps de biopsia franceses a través del canal de trabajo. Avanza las fórceps hasta el final de la eslata sin sobresalir de la eslatada. A continuación, coloque el ratón anestesiado en una plataforma de ensayo endoscópica en su lado ventral y confirme el nivel adecuado de sedación por falta de respuesta al reflejo del pedal.

Después de aplicar ungüento ocular, llene una jeringa de tres mililitros con una aguja de gavage de rata conectada con PBS a temperatura ambiente. E inserte la aguja aproximadamente un centímetro en el ano del ratón. Infunda suavemente con PBS hasta que el material fecal haya sido borrado.

Varios pellets fecales deben salir del ratón junto con el PBS que se infundió. Inserte el endoscopio ensamblado 0,5 centímetros en el ano y avance los fórceps de biopsia en el lúmenes despejados del recto hasta que las mandíbulas completas de los fórceps estén más allá del final de la vaina. Gire las fórceps 90 grados para que las mandíbulas se abran en una orientación este-oeste y abran las puntas y avancen las fórceps aproximadamente un centímetro, cerrando y retraen las fórceps en un movimiento suave y rápido para cosechar la biopsia.

Para evitar insuflar completamente el colon mientras realiza la biopsia, deje el lado derecho de la válvula de gas abierta. Inmediatamente después de la biopsia, deprima el pedal conectado al dispositivo de grabación del colonoscopio para iniciar la grabación de vídeo. Y presione firmemente un dedo índice contra el lado derecho de la válvula de gas para cubrir completamente la abertura, forzando el aire en el endoscopio y así en el colon.

Retire las fórceps de nuevo de la vaina y en el lúmenes rectales mientras está en la posición cerrada. Y coloque los fórceps contra la pared rectal inmediatamente por encima de la herida hasta que la base de las mandíbulas esté alineada con el borde superior del campo de visión. Continúe insuflando completamente el colon hasta que se pueda observar una vista clara de la herida.

Para obtener las mejores mediciones de la lecho de la herida, tenga paciencia y luego coloque el colonoscopio en un ángulo preciso para que obtenga su mejor imagen del lecho de la herida. Abra el vídeo en un programa de software adecuado y avance el vídeo a un fotograma que muestre un punto en el tiempo en el que la cama de la herida se puede visualizar fácilmente. Y en el que los fórceps cerrados están por encima del lecho de la herida y contra la pared rectal, y la pared está tensa.

En cada momento, obtenga una instantánea de este marco y codúe el nombre del archivo para asegurarse de que las mediciones de los lechos de las heridas se llevan a cabo de forma cegada. Para cuantificar el tamaño del lecho de la herida, abra las imágenes en ImageJ y utilice la herramienta Selecciones de mano libre para dibujar un perímetro alrededor de la herida. En Analizar, seleccione Medir.

Y el valor de esa medición se rellenará automáticamente en la ventana Resultados. Cuando se hayan adquirido todas las mediciones, calcule el tamaño de la herida en los días posteriores en relación con el tamaño del día cero en una hoja de cálculo. En el punto final experimental adecuado, abra la piel y las capas musculares abdominales para exponer la cavidad corporal del animal experimental y colocar fórceps cerrados debajo del colon.

Levante suavemente el colon para liberarlo del mesenterio subyacente y corte el tejido en su punto medio y en el ano para recogerlo del ratón. Utilice una jeringa de 20 mililitros llena de PBS helada y equipada con una aguja de gavage de rata para eliminar el contenido fecal. Y coloque el colon despejado en un pedazo de papel filtrante.

Abra el colon longitudinalmente, teniendo cuidado de que el lado mesenterico esté boca abajo contra el papel filtrante. Y usa una pipeta Pasteur para cubrir la mucosa con un 0,2% de azul metileno. Después de unos segundos, escurra el exceso de mancha y vea el colon debajo de un microscopio diseccionador para localizar el lecho de la herida.

Utilice tijeras Micro Iris de cuatro pulgadas para cortar alrededor del borde de la cama, teniendo cuidado de no cortar en la capa muscular. Y utilice pinzas de punto fino para transferir el tejido diseccionado a un tubo para congelar y almacenar. En el punto final experimental adecuado, abra el colon cosechado longitudinalmente en un pedazo de papel filtrante, lado mesenterico hacia abajo.

Cubra suavemente el tejido con su fijador de elección. Cubra el tejido con parafilm en un recipiente sellado durante 4 a 6 horas antes de su almacenamiento en un 70% de etanol. El día del procesamiento, retire el parafilm y agregue un 0,2% de color azul metileno al tejido, como se ha demostrado.

Después de drenar el exceso de mancha, coloque el tejido debajo de un microscopio diseccionador para localizar el lecho de la herida. Usando un bisturí con una hoja número 10, cortar directamente a través del centro del lecho de la herida y continuar cortando el resto del colon en línea recta, de tal manera que el colon se corta por la mitad a lo largo. Para la criosección, incrustar las piezas de colon de tal manera que el lado que fue cortado por el bisturí está boca abajo en un molde base medio lleno de tejido medio de congelación.

Asegure el tejido en su lugar con pinzas finas y coloque el molde base en una placa de metal o papel de aluminio grueso en la parte superior del hielo seco para endurecer el medio de congelación. Una vez congelada la parte inferior del medio, llene el volumen restante del molde base con medio de congelación a temperatura ambiente. Y devolver el moho al hielo seco hasta que todo el bloque de tejido esté congelado.

Luego, transfiera el molde a un congelador celsius de 80 grados hasta que se seccione. Aquí se muestran imágenes representativas de vistas aceptables de la cama de la herida para una cuantificación precisa del tamaño del lecho de la herida y la tasa de cierre de la herida. En esta vista ex vivo de un lecho de herida, se pueden observar indicadores del perímetro del lecho de la herida y dónde cortar el tejido para permitir la visualización del lecho de la herida al seccionarse.

En esta imagen representativa, se puede observar claramente una sección de manchas H y E de una lecho de herida. Es importante adquirir imágenes instantáneas del lecho de la herida en todo momento para asegurar una evaluación precisa de la tasa de curación de heridas. Después de la biopsia de pellizcar, diferentes agentes de interés se pueden inyectar en el lecho de la herida para probar sus efectos en la tasa de curación de la herida.