Name: Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende a purificar fibroblastos y células de Schwann de nervios sensoriales y motores mediante digestión diferencial y adherencia selectiva. Este protocolo eficiente obtiene cultivos con más del 90% de pureza celular para investigar regeneración nerviosa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Grant No. 2017YFA0104703), la Fundación Natural Nacional de China (Grant No. 31500927).

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las Directrices Institucionales de Cuidado animal de la Universidad de Nantong. Todos los procedimientos, incluidos los sujetos animales, fueron aprobados éticamente por el Comité de Administración de Animales Experimentales, provincia de Jiangsu, China.
1. Aislamiento y cultivo de fibroblastos nerviosos motores y sensoriales y SCs
<ol><li>Utilice ratas Sprague-Dawley (SD) de siete días de edad (n-4) proporcionadas por el Centro Animal Experimental de la Universidad de Nantong de China. Colocar las ratas en un tanque que contenga 5% de isoflurano durante 2-3 minutos, permitir que los animales respiren lentamente y no tengan actividad independiente, y luego desinfectar usando 75% de etanol antes de la decapitación.</li>
	<li>Use tijeras para cortar la piel posterior durante unos 3 cm y retire la columna vertebral. Abra el canal vertebral cuidadosamente para exponer la médula espinal.</li>
	<li>Mantener la médula espinal en un plato Petri de 60 mm con 2-3 ml de solución de sal equilibrada de D-Hanks (HBSS).</li>
	<li>Basado en la estructura anatómica, extirpar la raíz ventral (nervio motor) y luego la raíz dorsal (nervio sensorial) bajo un microscopio diseccionado. A continuación, colóquelos en una solución de sal equilibrada (HBSS) de D-Hanks helada.</li>
	<li>Después de retirar el HBSS, cortar los nervios en trozos de 3-5 mm con tijeras y digerir con 1 ml de 0.25% (p/v) tripina a 37 oC durante 18-20 min. A continuación, suplemento con 3-4 ml de DMEM que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) para detener la digestión.</li>
	<li>Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo suavemente unas 10 veces y centrifugar a 800 x g durante 5 min. Después de eso, desechar el sobrenadante y suspender el precipitado en 2-3 mL de DMEM complementado con 10% FBS.</li>
	<li>Filtrar la suspensión celular usando un filtro de malla 400, y luego inocular las células en plato Petri de 60 mm y cultivo a 37 oC en presencia de 5% CO2. Después de 4-5 días de cultivo, aísle el paso 0 (p0) fibroblastos y SCs después de alcanzar el 90% de confluencia.</li>
	<li>Aislamiento y cultura de SCs (Figura 1)<ol>
<li>Lave las células una vez usando 1x PBS. Añadir 1 ml de 0,25% (p/v) de trippsina (37 oC) por plato de Petri de 60 mm para digerir las células durante 8-10 s a temperatura ambiente. Después de eso, añadir 3 mL de DMEM complementado con 10% FBS para detener la digestión.</li>
		<li>Sople suavemente la mezcla para separar los SCs con una pipeta. A continuación, recoger y centrifugar los SCs a 800 x g durante 5 min.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y suspender el precipitado en 3 mL de DMEM con 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, forskoline de 2 m y 10 ng/mL HRG, y luego inocular las células en un plato de Petri de 60 mm sin recubrimiento. Después de cultivar a 37 oC durante 30-45 min, los fibroblastos (un número de fibroblastos se digieren con SCs) se unen a la parte inferior del plato.</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante (incluidos los SCs) a otro plato mediano recubierto de poli-L-lisina (PLL) y el cultivo a 37 oC durante 2 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento y cultivo de fibroblastos (Figura 1)<ol>
<li>Después de retirar los SCs (como se muestra en el paso 1.8), lave los fibroblastos restantes en los platos con 1x PBS y luego agregue 1 ml de 0.25% (p/v) de trippsina para digerir los fibroblastos durante 2 min a 37 oC.</li>
		<li>Añadir DMEM complementado con 10% FBS para terminar la digestión. Soplar los fibroblastos con una pipeta, y luego recogerlos y centrifugarlos a 800 x g durante 5 min.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante, suspender el precipitado con 2 ml de DMEM que contiene 10% FBS, y luego inocular las células en un plato petri de 60 mm sin recubrimiento. Los fibroblastos después del cultivo durante 30-45 min a 37 oC se unen a la parte inferior del plato. Deseche el sobrenadante (incluyendo algunos números de SCs). A continuación, añadir 3 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS en el plato de fibroblastos y cultivo a 37 oC durante 2 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pasar las células p1 hasta que alcanzaron el 90% de confluencia. A continuación, purificarlos por digestión diferencial y adherencia diferencial de nuevo como se describe en las secciones 1.8 y 1.9.</li>
	<li>Digerir los fibroblastos p2 y SCs después de cultivar durante 2 días, y luego recoger las células, contar e inocular en 1 x 105 números/bien en diapositivas recubiertas de PLL para inmunocitoquímica (ICC).</li>
</ol>2. ICC para la identificación de la pureza celular
<ol><li>Cultivo de las células durante 24 h a 37 oC y realizar tinción ICC después de la digestión diferencial y adherencia diferencial de fibroblastos motores y sensoriales y SCs.</li>
	<li>Lavar los fibroblastos motores y sensoriales y los SCs con 1x PBS y fijarlos en 200 l/pozo de 4% de paraformaldehído (pH 7.4) durante 18 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Bloquear los SCs de muestra con tampón de bloqueo (0,1% Tritón X-100 en 0,01 M PBS que contiene un 5% de suero de cabra) y bloquear los fibroblastos de la muestra con tampón de bloqueo (0,01 M PBS que contiene 5% de suero de cabra) durante 45 minutos a 37 oC después de lavarlos con PBS tres veces.</li>
	<li>Retire el tampón de bloqueo e incubar con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo anti-CD90 monoclonal de ratón (un marcador específico para fibroblastos) (1:1000) para fibroblastos y anticuerpos anti-S100 de ratón (un marcador específico para SCs) (1:400) para SCs a 4 oC durante la noche.</li>
	<li>Deseche los anticuerpos primarios, lávelos con PBS tres veces e incubar con los siguientes anticuerpos secundarios: IgG antiratón de cabra Alexa Fluor 594 (1:400) para fibroblastos y IgG antiratón de cabra conjugado con 488 (1:400) para SCs a temperatura ambiente durante 1,5 h.</li>
	<li>Lave las muestras tres veces con PBS y manche los núcleos con un tinte Hoechst 33342 de 5 g/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave la muestra con 1 veces PBS tres veces y móntela utilizando el medio de montaje (20 l/deslizamiento) en el portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Tome las fotografías celulares mediante un microscopio de escaneo láser confocal en tres campos aleatorios para cada pozo. Evalúe el número total de núcleos y células cd90 positivas, células S100 positivas y luego calcule el porcentaje de células CD90 positivas y células S100 positivas, respectivamente. Realizar la tinción por triplicado.</li>
</ol>3. Análisis de citometría de flujo (FCA) para la identificación de la pureza celular
<ol><li>Evaluar la pureza de los fibroblastos y SCs motores y sensoriales como se describió anteriormente por FCA16. En resumen, digiere los fibroblastos motores y sensoriales p2 y los SCs con 0,25% (p/v) de tripina, resuspendi los gránulos celulares y incubarlos en medio de fijación a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
	<li>Incubar las células con medio de permeabilización y sonda utilizando anticuerpos anti-CD90 monoclonales de ratón (0,1 g/106 células, 200 l) para fibroblastos y anticuerpos anti-S100 de ratón (1:400, 200 l) para SCs a temperatura ambiente durante 30 min, respectivamente.</li>
	<li>Incubar las células con 488-conjugado de cabra anti-ratón IgG durante 30 min. Utilice el calibre FACS para realizar la citometría de flujo, y analizar los datos utilizando el software Cell Quest.</li>
	<li>Incubar las células sólo con 488-conjugados de cabra anti-ratón IgG (Grupo de fibroblastos) y ratón IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Control de isotipo (grupo SCs), que sirve como control negativo.</li>
</ol>4. Análisis estadístico
<ol><li>Evaluar las diferencias estadísticas en los datos mediante la prueba tno parís con GraphPad Prism 6.0. Establezca la significancia estadística en p<0.05. Realizar todos los ensayos en triplicado.</li>
</ol>

<ol><li>Stierli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+homeostasis+and+regeneration+of+peripheral+nerve+is+distinct+from+the+CNS+and+independent+of+a+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28The+Company+of+Biologists%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population.</a> Development (The Company of Biologists). , (2018).</li>
<li>Schubert, T., Friede, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoneurial+fibroblasts+in+myelin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).</li>
<li>Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibroblast+impact+on+Schwann+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).</li>
<li>Lavdas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+engineered+to+express+the+cell+adhesion+molecule+L1+accelerate+myelination+and+motor+recovery+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143 (1), 145-155 (2010).</li>
<li>Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Controls+the+Long-Term+Survival+and+Phenotype+of+Repair+Schwann+Cells+during+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration.</a> Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).</li>
<li>Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+neuron-glial+cell+interaction+and+pathogenesis+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).</li>
<li>Hoke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+express+motor+and+sensory+phenotypes+that+regulate+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration.</a> Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).</li>
<li>Brushart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+phenotype+is+regulated+by+axon+modality+and+central-peripheral+location%2C+and+persists+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro.</a> Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Gene+Expression+in+Primary+Cultured+Sensory+and+Motor+Nerve+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).</li>
<li>Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeinstein%2C+DE+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22">Current Protocols in Neuroscience</a>. , (2001).</li>
<li>Palomo Irigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Primary+Rodent+Schwann+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).</li>
<li>Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+promotes+Schwann+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation.</a> Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).</li>
<li>Pannunzio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+selecting+Schwann+cells+from+adult+mouse+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve.</a> Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).</li>
<li>Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+Schwann+cells+based+on+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting.</a> Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).</li>
<li>He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+in+the+biological+characteristics+between+primary+cultured+sensory+and+motor+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells.</a> Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).</li>
<li>Weiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+transcriptomics+of+peripheral+nerve+tissue+and+cells+unravel+new+aspects+of+the+human+Schwann+cell+repair+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype.</a> Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las dos principales poblaciones celulares de los nervios periféricos incluían CC y fibroblastos. Los fibroblastos y SCs cultivados principalmente pueden ayudar con precisión a modelar la fisiología de fibroblastos y CC durante el desarrollo y la regeneración de los nervios periféricos. El estudio mostró que las células nerviosas ciáticas de rata P7 contenían alrededor del 85% de S100-positivas SCs, 13% de fibroblastos OX7 positivos y sólo 1.5% de macrófagos OX42 positivos13. Aunque el número de fi...

En el sistema nervioso periférico, las fibras nerviosas consisten principalmente en axones, células Schwann (SCs) y fibroblastos, y también contiene un pequeño número de macrófagos, células endoteliales microvasculares, y células inmunitarias1. Los SCs envuelven los axones en una proporción de 1:1 y están encerrados por una capa de tejido conectivo llamada endoneurium. Los axones se agrupan para formar grupos llamados fascículos, y cada fascículo se envuelve en una capa de tejido conectivo conocida como perineurium. Finalmente, toda la fibra nerviosa se envuelve en una capa de tejido conectivo, que se denomina epineurio. En el endoneurium, toda la población celular se compone de 48% DE SCs, y una porción sustancial de las células restantes involucra fibroblastos2. Además, los fibroblastos son componentes importantes de todos los compartimentos nerviosos, incluyendo el epineurium, el perineurium y el endoneurium3. Muchos estudios han indicado que los SCs y los fibroblastos desempeñan un papel crucial en el proceso de regeneración después de las lesiones del nervio periférico4,,5,6. Después de la transección del nervio periférico, los fibroblastos perineuriales regulan la clasificación celular a través de la vía de señalización de ephrin-B/EphB2 entre SCs y fibroblastos, guiando aún más el recrecimiento axonal a través de las heridas5. Los fibroblastos nerviosos periféricos secretan la proteína tenascina-C y mejoran la migración de los SCs durante la regeneración nerviosa a través de la vía de señalización de 1-integrina7. Sin embargo, los SCs y fibroblastos utilizados en los estudios anteriores se derivaron del nervio ciático, que incluye los nervios sensoriales y motores.
En el sistema nervioso periférico, los nervios sensoriales (nervios aferentes) llevan a cabo la señalización sensorial desde los receptores al sistema nervioso central (SNC), mientras que los nervios motores (nervios eferentes) conducen señales desde el SNC hasta los músculos. Estudios previos han indicado que los SCs expresan fenotipos motores y sensoriales distintos y secretan factores neurotróficos para apoyar la regeneración de los nervios periféricos8,,9. Según un estudio reciente, los fibroblastos también expresan diferentes fenotipos motores y sensoriales y afectan la migración de SCs10. Así, la exploración de las diferencias entre los fibroblastos/SC motores y nerviosos sensoriales nos permite estudiar los complicados mecanismos moleculares subyacentes de la regeneración específica del nervio periférico.
En la actualidad, existen muchas formas de purificar los CC y los fibroblastos, incluida la aplicación de agentes antimitoticos, citolisis mediada por anticuerpos11,12, inmunopanning secuencial13 y sustrato de laminina14. Sin embargo, todos los métodos anteriores eliminan los fibroblastos y preservan sólo los SCs altamente purificados y los fibroblastos se pueden obtener mediante la tecnología de clasificación de citometría de flujo15,pero es una técnica lenta y costosa. Por lo tanto, en este estudio, se desarrolló un método simple de digestión diferencial y adherencia diferencial para purificar y aislar fibroblastos sensoriales y nerviosos y SCs con el fin de obtener un gran número de fibroblastos y SCs más rápidamente.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 Cabra Anti-Ratón IgG(H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td>Dilución: 1:400</td></tr><tr><td>CoraLite488-conjugado Affinipure Cabra Anti-Ratón IgG(H+L)</td><td>Proteintech</td><td>SA00013-1</td><td>Dilución: 1:400</td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Software Cell Quest</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de D-Hank</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZ2-ILST</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Medio de montaje</td><td>Abcam</td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>Medio de fijación/Medio de permeabilización</td><td>Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD</td><td>GAS005</td><td></td></tr><tr><td>Citometría de flujo</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Control de isotipo</td><td>Abcam</td><td>ab106163</td><td>Dilución: 1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-CD90 de ratón</td><td>Abcam</td><td>ab225</td><td>Dilución: 1:1000 para ICC, 0,1 y micro; g para células 106 para el</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-S100 de ratón</td> Flow Cyt <td>Abcam</td><td>ab212816</td><td>Dilución: 1:400</td></tr><tr><td>Polilisina (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 Proteína de dominio EGF R</td><td>& D Systems</td><td>396-HB-050</td><td></td></tr><tr><td>0.25% (p/v) tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación de fibroblastos y células schwann de los nervios sensoriales y motores en vitro

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Las principales células del sistema nervioso periférico son las células Schwann (SCs) y los fibroblastos. Ambas células expresan claramente los fenotipos sensoriales y motores implicados en diferentes patrones de expresión génica del factor neurotrófico y otros procesos biológicos, afectando la regeneración nerviosa. El presente estudio ha establecido un protocolo para obtener SCs y fibroblastos sensoriales y motores altamente purificados más rápidamente. La raíz ventral (nervio motor) y la raíz dorsal (nervio sensorial) de ratas neonatales (7 días de edad) se disociaron y las células se cultivaron durante 4-5 días, seguidos por el aislamiento de fibroblastos sensoriales y motores y CC mediante la combinación secuencial de digestión diferencial y adherencia diferencial. Los resultados de los análisis de inmunocitoquímica y citometría de flujo mostraron que la pureza de los CC y fibroblastos sensoriales y motores eran >90%. Este protocolo se puede utilizar para obtener un gran número de fibroblastos/SCs sensoriales y motores más rápidamente, contribuyendo a la exploración de la regeneración sensorial y nerviosa motora.

Observación microscópica de luz Los SCs y los fibroblastos son las dos poblaciones celulares principales obtenidas en el cultivo celular primario a partir de tejidos nerviosos. Después de la inoculación durante 1 h, la mayoría de las células se adhirieron a la parte inferior del plato, y la morfología celular cambió de redonda a ovalada. Después del cultivo durante 24 h, los SCs exhibieron una morfología bipolar o tripolar y la longitud de estos osciló entre 100 y 200 ...

Aquí, presentamos un método para purificar fibroblastos y células Schwann de nervios sensoriales y motores in vitro.

Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Este protocolo se puede utilizar para obtener un gran número de sensores y las células del fibroblasto motor y Schwann rápidamente. Las células obtenidas a través de este mensaje se pueden utilizar en el estudio de la regeneración nerviosa y enfermedades del sistema nervioso. Mostramos que la demostración puede representar lo experimental para controlar mejor el tiempo del paso digestivo diferencial y hacer que los pasos experimentales sean más fáciles de entender.Para estallar use tijeras para hacer una incisión de tres centímetros, en la piel de la espalda. Retire la columna vertebral. Abra cuidadosamente el canal vertebral para exponer la médula espinal.Encaje la médula espinal en una placa Petri de 60 milímetros, con tres a cuatro mililitros de solución de sal equilibrada D Hanks bajo un microscopio diseccionado, excediendo la raíz ventral y la raíz dorsal. Colóquelos en una solución de sal equilibrada de D Hanks helada. Después de retirar el HBSS, cortar los nervios en tres a cinco piezas milimétricas, con tijeras.Añadir un mililitro de 0,25% de trippsina y transferir las piezas nerviosas a tubos de centrífuga de cinco mililitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 18 a 2

purification-fibroblasts-schwann-cells-from-sensory-motor-nerves

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un procedimiento para aislar neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) de embriones de rata y co-cultivarlas con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann maduras. Los DRG aislados se procesan para aislar las neuronas y las células gliales. Las células aisladas se cultivan para purificar las neuronas, que luego se cultivan conjuntamente con células similares a las células de Schwann (SCLC) en un medio de cocultivo. La interacción con las neuronas...

Aislamiento de neuronas DRG y cocultivo con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann

Este video muestra un protocolo para aislar y cultivar células de Schwann de tejidos de dermis humana. La dermis humana contiene varios tipos de células, incluidos fibroblastos y células de Schwann. Después del aislamiento, las células se tratan con un agente antimitótico para eliminar los fibroblastos proliferantes, lo que da como resultado un cultivo puro de células de Schwann.

Aislamiento y cultivo de células primarias de Schwann a partir de una dermis humana

Este video describe el aislamiento y cultivo de células de Schwann de raíces espinales de ratón. A continuación, las células aisladas se cultivan en medios específicos. Las células de Schwann se aíslan mediante digestión diferencial y adherencia. Posteriormente se transfieren a cubreobjetos recubiertos de matriz extracelular para su fijación y proliferación.

Aislamiento de células de Schwann de raíces espinales de ratón

Este video muestra el modelo de coculturación de un explante de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann. En condiciones de cocultivo, el ácido ascórbico promueve la diferenciación de las células de Schwann en formas mielinizantes. Las células de Schwann mielinizantes envuelven los axones varias veces para crear una vaina de mielina, que es esencial para la función nerviosa.

Co-cultivo de un explante de ganglios de raíz dorsal con células de Schwann para la mielinización de neuronas

Este video muestra un método para aislar células de Schwann de fibras del nervio ciático de ratón.

Separación magnética de las células de Schwann de los nervios ciáticos de ratón

Fuente: Han, J., et.al. Regulación del crecimiento de células de Schwann mediante un campo eléctrico pulsado de nanosegundos para la regeneración de nervios periféricos in vitro. J. Vis. Exp. (2024)Este video demuestra la aplicación de la técnica de campo eléctrico pulsado de nanosegundos (nsPEF) para modular el crecimiento de células de Schwann (SC). Los pulsos eléctricos rápidos inducen nanoporos transitorios en las membranas SC, lo que facilita la entrada de calcio que activa las vías de...

Regulación del crecimiento de células de Schwann in vitro mediante la técnica de campo eléctrico pulsado de nanosegundos

Este artículo describe un sistema de cultivo neuronal que se puede utilizar para obtener grandes cantidades de muestras axonales puras para análisis bioquímicos e inmunocitoquímicos. Esta técnica permitirá una mejor comprensión de la fisiología axonal normal y de las vías de señalización que conducen a la neurodegeneración.

Producción y aislamiento de los axones de las neuronas sensoriales para el análisis bioquímico Usando porosos Filtros

Existen células del estroma de la médula (MSC) con potencial neural dentro de la médula ósea. Nuestro protocolo enriquece esta población de células a través de un preacondicionamiento hipóxico y luego las dirige a convertirse en células maduras de Schwann.

Precondicionamiento hipóxico de las células progenitoras derivadas de la médula como fuente para la generación de células maduras de Schwann

El estudio de la cicatrización de heridas asociada con la lesión musculoesquelética a menudo requiere la evaluación de las interacciones in vitro entre las células de Schwann (SC), los queratinocitos y los fibroblastos. Este protocolo describe el aislamiento, cultivo y caracterización de estas células primarias del prepucio humano.

Aislamiento, cultivo y caracterización de células primarias de Schwann, queratinocitos y fibroblastos del prepucio humano

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

Aquí, presentamos un protocolo para aplicar un campo eléctrico de pulso de nanosegundos (nsPEF) para estimular células de Schwann in vitro. La capacidad de síntesis y secreción de factores relevantes y los cambios en el comportamiento celular validaron el éxito de la estimulación con nsPEF. El estudio ofrece una visión positiva del método de regeneración de los nervios periféricos.

Regulación del crecimiento de las células de Schwann mediante un campo eléctrico pulsado de nanosegundos para la regeneración de nervios periféricos in vitro

Aprende a purificar fibroblastos y células de Schwann de nervios sensoriales y motores mediante digestión diferencial y adherencia selectiva. Este protocolo eficiente obtiene cultivos con más del 90% de pureza celular para investigar regeneración nerviosa.

Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro

Explorar más videos