Name: Autoensamble de membranas lipídicas híbridas dopadas con moléculas orgánicas hidrófobas en la interfaz agua/aire (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprende a fabricar membranas lipídicas híbridas dopadas con ftalocianina de cobre mediante autoensamble en la interfaz agua/aire. Este método simple permite crear estructuras estables para dispositivos de estado sólido y sensores.

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Este trabajo fue apoyado por el programa CREST de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnología (JPMJCR14F3) y Grant in-Aids de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (19H00846 y 18K14120). Este trabajo se llevó a cabo en parte en el Laboratorio de Nanoelectrónica y Spintronics, Instituto de Investigación de Comunicación Eléctrica, Universidad tohoku.

1. Preparación de una solución híbrida
<ol><li>Lavar cuatro viales de vidrio desechables de 4 ml y tapones de tornillo (con sellos recubiertos de PTFE) en un baño ultrasónico durante 10 minutos en agua destilada (purificada con un sistema de filtración), seguida de etanol y cloroformo, respectivamente. Seque los viales y tapas de vidrio en una corriente de gas nitrógeno.</li>
	<li>En una guantera anaeróbica, prepare una solución de cuPc (10 mg/ml) en un vial de vidrio lavado disolviendo CuPc en polvo en cloroformo.</li>
	<li>Filtrar la solución de CuPc a través de una membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,2 m.</li>
	<li>Conservar la solución filtrada en un vial de vidrio lavado lleno de nitrógeno y sellar el vial con parafilm.</li>
	<li>Sacar la solución de cloroformo de 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) comprada (25 mg/ml) del refrigerador de -80 oC y dejar que se caliente a temperatura ambiente.</li>
	<li>Revuelva la solución DPhPC utilizando un mezclador de vórtice a 2300 rpm durante 10 s.</li>
	<li>Enjuague una micro-jeringa de vidrio con cloroformo durante 5 veces.</li>
	<li>Transfiera 200 l de la solución de cloroformo DPhPC a un vial de vidrio prelavado utilizando la jeringa lavada. Evaporar el disolvente en el vial con una corriente suave de nitrógeno.</li>
	<li>Enjuague una micro-jeringa de vidrio 5 veces con cloroformo.</li>
	<li>Añadir 202,6 l de cloroformo al vial de vidrio con DPhPC utilizando la jeringa limpia.</li>
	<li>Agregue 47,4 l de solución filtrada de CuPc de 10 mg/ml a la solución DPhPC. La relación molar de DPhPC a CuPc debe ser 10:1.</li>
	<li>Enjuague la micro-jeringa de vidrio 5 veces con cloroformo.</li>
	<li>Añadir 250 l de hexano a la solución utilizando la jeringa. La concentración final de la solución debe ser de 10 mg/ml.</li>
	<li>Mezclar la solución preparada con un mezclador de vórtice a 2300 rpm durante 10 s.</li>
	<li>Filtrar la solución de CuPc a través de una membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,2 m.</li>
	<li>Selle el vial de vidrio con parafilm. Colóquelo en una bolsa sellada con agarre lleno de nitrógeno y coloque la bolsa sellada con agarre en un congelador a -20 oC. NOTA: Después del paso 1.13, el DPhPC y el CuPc se disolvieron en un disolvente mixto, que estaba compuesto de cloroformo y hexano (relación de volumen de 1:1). Además, la relación molar de DPhPC a CuPc no se limita a 10:1. Con una concentración constante de lípidos (10 mg/ml), se pueden utilizar diferentes proporciones molares. Según resultados experimentales anteriores, se prefiere un rango de 10:1 a 3:1 para formar una membrana lipídica híbrida de alta calidad.</li>
</ol>2. Formación de una membrana híbrida en la interfaz agua/aire
<ol><li>Corte los sustratos de Si (3 cm x 3 cm) de una oblea Si.</li>
	<li>Limpie los sustratos de Si de 3 cm x 3 cm en un baño ultrasónico durante 10 minutos en agua purificada, seguido de etanol y luego cloroformo. Tratar el sustrato de Si con un plasma O2 durante 5 minutos para eliminar los materiales orgánicos adsorbidos de la superficie y mejorar la hidrofilia.</li>
	<li>Lavar un vaso de precipitados de teflón con un diámetro interior de 7,5 cm con agua purificada que fluye durante 3 min.</li>
	<li>Coloque el sustrato de Si limpio en el vaso de precipitados de PTFE lavado. El sustrato se inclina en un ángulo de 30o a la horizontal.</li>
	<li>Vierta una cantidad suficiente de agua purificada en el vaso de precipitados de teflón hasta que todo el sustrato de Si esté sumergido.</li>
	<li>Saque la solución híbrida preparada del congelador y deje que se caliente a temperatura ambiente.</li>
	<li>Revuelva la solución híbrida utilizando un mezclador de vórtice a 2300 rpm durante 15 s.</li>
	<li>Enjuague una micro-jeringa de vidrio (50 l) 5 veces con cloroformo.</li>
	<li>Suelte 3-5 l de la solución híbrida sobre la superficie del agua utilizando la jeringa para formar una membrana lipídica híbrida flotante. NOTA: Cuando se cae la solución, es importante mantener la gota cerca de (menos de 1 cm) de la superficie del agua. También debe tenerse en cuenta que una membrana híbrida de una sola capa no es visible a simple vista, pero la membrana híbrida multicapa aparece como película delgada de color azul. Para transferir la membrana híbrida multicapa al sustrato De, es importante dejar caer la solución mixta lo más cerca posible del sustrato De Si.</li>
</ol>3. Transferencia de la membrana a un sustrato Si
<ol><li>Después de la evaporación del disolvente orgánico (tomará menos de 2 segundos), bajar el nivel de agua a una velocidad de 3 mm / min mediante el bombeo del agua a través de un tubo de goma que es impulsado por una bomba peristáltica, para transferir la membrana híbrida flotante en el sustrato De.</li>
	<li>Una vez completado el proceso de transferencia (alrededor de 5 min), coloque el sustrato De en un limpiaparabrisas y deje que todo el agua residual se evapore. NOTA: Bajar el nivel del agua a una velocidad tan baja sirve para minimizar la turbulencia del agua y para proteger la membrana.</li>
</ol>

<ol><li>Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+self-assembly+of+lipid+bilayers+and+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).</li>
<li>Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+simulations+of+a+lipid+bilayer+and+of+hexadecane%3A+an+investigation+of+membrane+fluidity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity.</a> Science. 262 (5131), 223-226 (1993).</li>
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<li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+bilayer+formation+by+contacting+monolayers+in+a+microfluidic+device+for+membrane+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis.</a> Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).</li>
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<li>Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+simulations+of+carbon+nanotube+porins+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers.</a> Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).</li>
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<li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-induced+orientation+control+of+CuPc+molecules+for+the+epitaxial+growth+of+highly+ordered+organic+crystals+on+graphene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).</li>
<li>Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+characterization+of+air-stable+lipid+bilayer+membranes+incorporated+with+phthalocyanine+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).</li>
<li>Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+diffraction+study+of+lipid+bilayer+membranes+interacting+with+amphiphilic+helical+peptides%3A+diphytanoyl+phosphatidylcholine+with+alamethicin+at+low+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).</li>
<li>Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+film-forming+behavior+of+soluble+tetra-3-nitro-substituted+copper+phthalocyanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine.</a> ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).</li>
<li>Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+growth+of+copper+phthalocyanine+aggregates+deposited+from+solution+on+planar+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces.</a> Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En la solución precursora de la membrana híbrida, se utiliza un disolvente orgánico mezclado (cloroformo y hexano) en lugar de cloroformo puro para disolver los lípidos y cuPc. Si se utiliza cloroformo puro, la densidad de la solución precursora sería mayor que el agua. Por lo tanto, es muy probable que la solución se hunda en el fondo del agua en lugar de extenderse sobre la superficie del agua. La adición de hexano, un disolvente de baja densidad, a la solución precursora, garantiza que la solución flotará en la superf...

Como marcos esenciales de las membranas celulares, el interior de las células se separa del exterior por un sistema de bicapas lipídicas. Este sistema consiste en fosfolípidos anfifílicos, que se componen de éster fosfórico hidrófilo "cabezas" y ácidos grasos hidrófobos "colas". Debido a la notable fluidez y capacidad de autoensamblaje de las bicapas de lípidos en ambiente acuoso1,2, bicapas de lípidos artificiales se pueden formar utilizando métodos simples3,4. Varios tipos de proteínas de membrana, como canales iónicos, receptores de membrana y enzimas, se han incorporado a la bicapo de lípidos artificiales para imitar y estudiar las funciones de las membranas celulares5,6. Más recientemente, las bicapas lipídicas han sido dopadas con nanomateriales (por ejemplo, nanopartículas metálicas, grafeno y nanotubos de carbono) para formar membranas híbridas funcionales7,8,9,10,11,12,13. Un método ampliamente utilizado para la formación de tales membranas híbridas implica la formación de vesículas lipídicas dopadas, que contienen materiales hidrófobos como Au-nanopartículas modificadas7 o nanotubos de carbono11,y las vesículas resultantes se fusionan en bicapas de lípidos compatibles planares. Sin embargo, este enfoque es complejo y requiere mucho tiempo, lo que limita los usos potenciales de tales membranas híbridas.
En este trabajo, las membranas lipídicas se dopadan con moléculas orgánicas para producir membranas lipídicas híbridas que se formaron en la interfaz agua/aire por autoensamble. Este protocolo implica tres pasos: preparación de la solución mixta, formación de una membrana híbrida en la interfaz agua/aire, y la transferencia de la membrana a un sustrato De. En comparación con otros métodos notificados anteriormente, el método descrito aquí es más simple y no requiere instrumentación sofisticada. Usando este método, las membranas lipídicas híbridas estables al aire con un área más grande se pueden formar en un tiempo más corto. El nanomaterial utilizado en este estudio es una molécula orgánica semiconductora, cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (CuPc), que es ampliamente utilizado en una serie de aplicaciones, incluyendo células solares, fotodetectores, sensores de gas y catálisis14,15. CuPc, una pequeña molécula orgánica con una estructura plana, tiene una alta afinidad por las "colas" del dúo de fosfolípidos con sus características hidrofóbicas. Otros grupos han informado de que las moléculas de CuPc pueden autoensamblarse en superficies de un solo cristal con la formación de estructuras altamente ordenadas16,17. Por lo tanto, es muy posible que las moléculas de CuPc podrían ser incorporadas en las bicapas de lípidos a través del autoensamble.
Proporcionamos una descripción detallada de los procedimientos utilizados para formar membranas y proporcionamos algunas sugerencias para implementar sin problemas este procedimiento. Además, presentamos algunos resultados presentativos de las membranas lipídicas híbridas, y discutimos posibles aplicaciones de este método.

<table><tbody><tr><td>Cloroformo</td><td>Wako&nbsp; Productos químicos</td><td>033-08631</td><td></td></tr><tr><td>CuPc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423165</td><td></td></tr><tr><td>DPhPc</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>Viales de vidrio con tapón de rosca</td><td>Nichiden-Rike Glass Co., Ltd</td><td>6-29801</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Wako&nbsp; Productos químicos</td><td>084-03421</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de membrana</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td></td><td></td>R8CA42836</tr><tr><td>Microjeringa</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Tokyo Rikakikai Co., Ltd.</td><td></td><td></td>11914199</tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-0286</td><td></td></tr></tbody></table>

autoensamble de membranas lipídicas híbridas dopadas con moléculas orgánicas hidrófobas en la interfaz agua/aire

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Debido a sus propiedades únicas, incluyendo un espesor ultrafino (3-4 nm), resistencia ultra alta, fluidez y capacidad de autoensamblaje, las bicapas de lípidos se pueden funcionalizar fácilmente y se han utilizado en diversas aplicaciones como biosensores y biodispositivos. En este estudio, introdujimos una molécula orgánica plana: cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-fthalocyanine (CuPc) a las membranas lipídicas de droga. La membrana híbrida CuPc/lipid se forma en la interfaz agua/aire por autoensamble. En esta membrana, las moléculas hidrofóbicas de CuPc se encuentran entre las colas hidrófobas de las moléculas de lípidos, formando una estructura sándwich de lípidos/CuPc/lípidos. Curiosamente, una bicala de lípidos híbridos estable al aire se puede formar fácilmente mediante la transferencia de la membrana híbrida a un sustrato de Si. Informamos de un método sencillo para incorporar nanomateriales en un sistema de bicapas de lípidos, que representa una nueva metodología para la fabricación de biosensores y biodispositivos.

La membrana formada tiene un color azul claro uniforme debido a la presencia de moléculas de CuPc. El área de la membrana de color es normalmente varios centímetros cuadrados. En la Figura 1A y Figura 1B,mostramos una imagen microscópica y una imagen del microscopio de fuerza atómica (AFM) (incluyendo un perfil de altura) de la membrana lipídica híbrida en un sustrato de Si. En la imagen AFM, la membrana en la parte superior izquierda es gruesa, con un espesor d...

Reportamos un protocolo para producir una membrana lipídica híbrida en la interfaz agua/aire dopando la bicapa lipídica con moléculas de cobre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc). La membrana lipídica híbrida resultante tiene una estructura sándwich de lípidos/CuPc/lípidos. Este protocolo también se puede aplicar a la formación de otros nanomateriales funcionales.

Autoensamble de membranas lipídicas híbridas dopadas con moléculas orgánicas hidrófobas en la interfaz agua/aire

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Nuestro protocolo demuestra un método simple para fabricar membranas lipídicas híbridas dopadas de moléculas orgánicas. La propiedad estable del aire de la membrana puede extender la aplicación de la estructura bicapida de lípidos a los dispositivos de estado sólido. Utilizamos un proceso de autoensamble para formar membranas lipídicas híbridas con un espesor de varios nanómetros.Este protocolo es simple y fácil de seguir y no requiere equipos complicados. Este método se puede utilizar para fabricar otras mismas membranas lipídicas biohíbridas y se puede adoptar fácilmente tanto a los sensores como a otros dispositivos de detección. Trabajando en una guantera anaeróbica, disolver la ftoocyanina de cobre en cloroformo dentro de un vial de vidrio lavado para preparar una solución de material de ftalocyanina de cobre de 10 miligramos por mililitro.Filtrar la solución a través de una membrana de PTFE de 0,2 micrómetros. Mezcle la solución DPHPC con un mezclador de vórtice a 2, 300 RPM durante 10 segundos. A continuación, enjuague una microen jeringa de vidrio con cloroformo cinco veces y utilícela para transferir 200 microlitros de la solución a un vial de vidrio prelavado.Evaporar el

self-assembly-hybrid-lipid-membranes-doped-with-hydrophobic-organic

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Bicapas lipídicas soportadas y partículas de membrana naturales son sistemas convenientes que pueden aproximarse a las propiedades de las membranas celulares y ser incorporadas en una gran variedad de estrategias de análisis. Aquí se demuestra un método para preparar compuestos de microarrays de soportados de lípidos de la bicapa recubiertos de SiO 2 perlas, vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales.

Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

Se presenta un protocolo experimental para formar una bicapa lipídica apoyado sobre soportes sólidos sin usar vesículas lipídicas. Se demuestra un método de un solo paso para formar una bicapa lipídica en dióxido de silicio y oro, así como membranas soportadas con dominio enriquecida en colesterol para diversas aplicaciones biológicas.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

Informamos sobre una aplicación inteligente de nanotubos de carbono para la estabilización cinética de partículas lipídicas que contienen nanoestructuras autoensambladas en sus núcleos. La preparación de partículas lipídicas requiere concentraciones bastante bajas de nanotubos de carbono, lo que permite su uso en aplicaciones biomédicas, como la administración de fármacos.

Preparación fácil del ensamblado autónomos Internamente Lípidos Las partículas estabilizadas por nanotubos de carbono

Demostramos un sistema almacenable, transportable lípidos formación de bicapa. Una membrana de bicapa lipídica se puede formar dentro de 1 h con tasa de éxito más del 80% cuando un precursor de membrana congelada se llevó a temperatura ambiente. Este sistema reducirá los procesos laboriosos y conocimientos asociados a los canales iónicos.

Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

Proporcionamos un protocolo para in vitro ensayos de autoorganización de la mente y la mía en una bicapa lipídica apoyado en una cámara abierta. Además, se describe cómo adjuntar el ensayo en lípido-clad PDMS microcompartments imitar en vivo condiciones de confinamiento de la reacción.

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

Este protocolo detalla el uso de un sistema de calentamiento de temperatura controlada de retroalimentación para promover el ensamblaje de monocapas lipídicas y la formación de bicapas de interfaz de gotitas para lípidos con temperaturas de fusión elevadas, y mediciones de capacitancia para caracterizar los cambios impulsados por la temperatura en la membrana.

Montaje con temperatura controlada y caracterización de una bicapa de interfaz de gota

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

El presente protocolo describe el ensamblaje de liposomas asistido por octanol (OLA), una técnica microfluídica para generar liposomas biocompatibles. OLA produce liposomas monodispersos de tamaño micrométrico con encapsulación eficiente, lo que permite la experimentación inmediata en chip. Se prevé que este protocolo sea particularmente adecuado para la biología sintética y la investigación de células sintéticas.

Conjunto de liposomas asistido por octanol en chip para bioingeniería

La diversidad lipídica de la membrana en estructura y composición es un importante contribuyente a los procesos celulares y puede ser un marcador de enfermedad. Las simulaciones de dinámica molecular nos permiten estudiar las membranas y sus interacciones con biomoléculas a resolución atomística. Aquí, proporcionamos un protocolo para construir, ejecutar y analizar sistemas de membranas complejos.

Modelado realista de membranas utilizando mezclas lipídicas complejas en estudios de simulación

Aprende a fabricar membranas lipídicas híbridas dopadas con ftalocianina de cobre mediante autoensamble en la interfaz agua/aire. Este método simple permite crear estructuras estables para dispositivos de estado sólido y sensores.

Autoensamble de membranas lipídicas híbridas dopadas con moléculas orgánicas hidrófobas en la interfaz agua/aire

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