Name: Ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Aprende ablación láser con microscopio confocal para estudiar la regeneración de células interneuromas en peces cebra Danio rerio. Este método permite monitorear progenitores de células ciliadas con precisión y mínimo daño colateral.

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Este trabajo fue financiado por la subvención NIH R15 1R15DC015352-01A1 y las fuentes de financiación interna de la Universidad Pace. Las líneas de pescado fueron cortesía de Vladimir Korzh14, Katie Kindt15,16, y el laboratorio de A. James Hudspeth. Nos gustaría agradecer a A. James Hudspeth y a los miembros de su grupo por sus comentarios sobre estos experimentos, y a sus colegas de la Universidad Pace por su apoyo. El análisis de regresión logística en RStudio fue ayudado en particular por nuestro colega Matthew Aiello-Lammens.

Todo el trabajo animal fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pace bajo el protocolo 2018-1.
1. Preparación de larvas de pez cebra
<ol><li>Configurar el apareamiento 3-5 días antes de llevar a cabo el experimento, de tal manera que las larvas serán 2 días después de la fertilización (dpf) a 4 dpf en edad cuando se montan para la ablación láser. NOTA: La línea de trampa potenciador Et(krt4:EGFP)sqEt20 (abreviada como ET20), en la que las células interneuromast están claramente etiquetadas con proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), permite una identificación celular relativamente fácil y la ablación11,14. Para la confirmación de la especificidad y flexibilidad de la ablación láser, los peces ET20 se crían con peces Tg(neuroD:tdTomato),en los que el nervio de línea lateral está etiquetado con proteína fluorescente roja o con Tg(myo6b:-actin-GFP) para etiquetar las células del cabello sensorial con GFP15,16.</li>
	<li>Después de la recolección de embriones al día siguiente, incubar embriones a 28,5 oC en un medio E3 que contenga 0,0001% de azul de metileno hasta que estén listos para anestesiar y montar.</li>
</ol>2. Preparación de soluciones de agarosa y tricaína de baja gelificación
<ol><li>A un matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml, añadir 48 ml de 1x E3 medio, 2 ml de solución de material de tricaina de 15 mM y 0,5 g de agarosa de baja fusión.</li>
	<li>Microonda la solución en alto durante 30 s y remolino (usando guantes de protección contra el calor) para disolver la agarosa. Repita los ciclos de calentamiento de 30 s hasta que la agarosa se disuelva por completo.</li>
	<li>Conservar la agarosa en una incubadora calentada a 42oC hasta que esté lista para su uso.</li>
</ol>3. Anestesización de larvas de pez cebra
<ol><li>A un tubo cónico de 50 ml, añadir 24 ml de 1x E3 medio y 1 ml de solución de material de tricaína (15 mM) a una concentración final de 600 m. Swirl para mezclar.</li>
	<li>Cargue uno de los seis pocillos de una placa de cultivo celular de fondo plano con 8 ml de E3 que contenga 600 m de tricaína.</li>
	<li>Utilice una pipeta de transferencia para mover larvas de pez cebra en un inserto de transferencia con fondo de malla de 74 m.</li>
	<li>Transfiera el inserto con fondo de malla en el pozo de la placa de seis pozos que contiene la solución de tricaína E3 +. Permita que las larvas permanezcan en el pozo durante un mínimo de 3 minutos o hasta que estén completamente anestesiadas. Pruebe la anestesia tocando el inserto. Las larvas no deben sobresolizar y nadar en respuesta al grifo.</li>
</ol>4. Examen fluorescente de larvas de peces cebra anestesiadas
<ol><li>Pipetear una larva anestesiada por pozo en 12 toboganes bien recubiertos de hidrófobos para su cribado. Asegúrese de que haya una curvatura mínima del menisco formado en cada pozo de la diapositiva para reducir la distorsión óptica al cribado. Esto se puede hacer mediante la eliminación de un pequeño volumen de E3 de cada pozo después de colocar las larvas.</li>
	<li>Bajo un objetivo 10x en un microscopio vertical (equipado con una lámpara de arco de mercurio, lámpara de halogenuros metálicos, o fuente de luz LED y un cubo de filtro apropiado), pantalla para larvas que expresan eGFP en los neuromastos y las células interneuromas del sistema de línea lateral.<ol>
<li>Seleccione larvas con una expresión más fuerte dando como resultado un eGFP más brillante, que presumiblemente son homocigotos para el transgén. NOTA: En la línea ET20, eGFP se expresa en un anillo de células del manto que rodea cada neuromast, así como la tira estrecha de células interneuromas que conectan estos órganos. Una expresión eGFP más fuerte (fluorescencia más brillante) contribuye a una ablación más eficaz.</li>
		<li>Para examinar la especificidad de la ablación, utilice larvas transgénicas dobles con los transgenes ET20 y Tg(neuroD:tdTomato). Si examina los portadores de Tg(neuroD:tdTomato), utilice el conjunto de cubos de filtro RFP para identificar un parche rojo brillante justo después de la oreja que representa el ganglio posterior de la línea lateral.</li>
		<li>Para ablar las células pilosas en los neuromastas de línea lateral, utilice la línea transgénica Tg(myo6b:-actin-GFP) y la pantalla para la localización de la GFP en el centro de cada neuromast.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione larvas con espaciado estereotipado de los neuromastas. Las diferencias en el espaciado entre los neuromastas pueden indicar una deposición neuromast anormal durante el desarrollo, lo que sugiere un comportamiento migratorio defectuoso o proliferación celular en la línea lateral primordium17. Estos defectos también pueden afectar el comportamiento migratorio o regenerativo de los INMCs después de la ablación. NOTA: Los defectos comunes en el espaciado incluyen una distancia inusualmente grande entre el neuromasta anterior más fuerte depositado por el primer primorreso migratorio (prim1L1) y el segundo neuromasta depositado por el mismo primordium (prim1L2), a menudo asociado con el hacinamiento de los neuromastos más posteriores.</li>
</ol>5. Montaje de larvas para la ablación láser y la toma de imágenes
<ol><li>Pipetear 3 - 4 larvas anestesiadas en una pequeña gota de E3/tricaína solución en el centro de una cubierta de fondo deslizante (plato de 35 mm con un número de 14 mm 1,5 cubreobjencia). Retire el exceso de solución para que las larvas permanezcan en una gota pequeña, lo suficientemente grande como para contenerlas.</li>
	<li>Transfiera el plato a la etapa de un microscopio estereomático binocular y manipule el zoom y el enfoque para que todas las larvas estén en el campo de visión.</li>
	<li>Retire el matraz Erlenmeyer que contiene la baja agarosa del punto de fusión de la incubadora calentada. Utilice una pipeta de transferencia para transferir la solución de agarosa a la corredera de la cubierta para producir una capa delgada. Saca el exceso de agarosa hasta que el líquido llene el pozo en la parte inferior del plato, teniendo cuidado de no aspirar ninguna larva.</li>
	<li>Coloca rápidamente las larvas en la solución de agarosa usando un cuchillo para el cabello o un lazo para el cabello para que estén alineadas entre sí y orientadas con rostral a la izquierda.</li>
	<li>Presione suavemente las larvas contra el vidrio con el cuchillo de pelo, de manera que se acuestan con los lados derecho hacia abajo. Las larvas de más de 3 dpf tienden a flotar debido a sus vejigas de baño infladas, por lo que es posible que deban ser presionadas repetidamente contra el vidrio hasta que la agarosa comienza a gelear.</li>
	<li>Después de unos 60 s la agarosa comenzará a solidificarse, y las larvas no podrán ser reorientadas. Deje aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente para que la agarosa en el resbalón de la cubierta se solidifique por completo. Una vez que la agarosa se haya solidificado, utilice una pipeta de transferencia para llenar el plato a mitad de camino con E3 que contiene 1x tricaína.</li>
</ol>6. Localización de objetivos prospectivos e imágenes previas a la ablación
<ol><li>Encienda la alimentación del sistema de microscopía confocal de escaneo láser e inicialícelo a través del software de imágenes integrado. Seleccione el objetivo de inmersión de aceite Plan-Apochromat 63x (apertura numérica 1.40) o similar. Aplicar aceite de inmersión y asegurar el plato en una etapa circular inserto de tal manera que las larvas se enfrenten con su aspecto rostral a la izquierda.</li>
	<li>En iluminación de contraste de interferencia diferencial o de campo brillante, seleccione una de las larvas montadas para la toma de imágenes. Ajuste el enfoque con la perilla de enfoque de tal manera que la piel en el lado del pez más cercano al cubreobjetos esté enfocada, reconocible por el patrón similar a la huella digital de las células de periderm.</li>
	<li>Una vez en foco, cambie a la iluminación epifluorescente en el canal GFP. Localice la línea lateral posterior mediante la expresión GFP a lo largo del mioseptum horizontal. Los anillos de células fluorescentes indican células del manto neuromast, y las hebras alargadas de las células son células interneuromas.</li>
	<li>Comenzando con el neuromasta primIL1, generalmente ubicado sólo dorsal a la yema, utilice el joystick de control de escenario u otro control de movimiento de la etapa para escanear visualmente caudalmente a lo largo del mioseptum horizontal.<ol>
<li>Siga la cadena de células interneuromas hasta llegar a la región entre los neuromastas primIL3 y primIL4 (L3 y L4) (Figura 1A). NOTA: Otras regiones también pueden ser objetivo, pero esta sección del tronco y la cola tiende a ser más cercana al vidrio de la cubierta y, por lo tanto, más susceptible a la ablación.</li>
		<li>Si toma imágenes de varias larvas, establezca la primera posición de la etapa y, a continuación, desactive la opción de varias posiciones de etapa anulando la selección de la casilla de verificación adecuada.</li>
		<li>Repita los pasos 6.4.1–6.4.2. para cada posición de etapa deseada (cada larva).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez identificados los cuerpos celulares de la región L3-L4, cambie al modo de adquisición.<ol>
<li>Active una pista de imágenes GFP con el láser de 488 nm o 491 nm.</li>
		<li>Agregue un canal de luz transmitida (tubo fotomultiplicador de luz transmitida o T-PMT) a la pista láser de 488 nm activada activando la casilla de verificación T-PMT en el menú desplegable"Configuración de imágenes".</li>
		<li>Establezca la potencia del láser en 6%, el tamaño del agujero en 1 unidad airy equivalente y la ganancia digital en 750 para la toma de imágenes de larvas ET20. La ganancia exacta y la potencia del láser pueden variar para cualquier larva dada, dependiendo de lo cerca que estén montadas en el resbalón de la cubierta y del brillo de la fluorescencia. Ajuste la ganancia de tal manera que los cuerpos celulares estén saturados para capturar proyecciones tenues y filipodia.</li>
		<li>Ajuste los parámetros a un tamaño de fotograma de 1024 píxeles x 1024 píxeles, zoom digital de 0,7 (145,2 m x 145,2 mm de tamaño de imagen). Establezca un promedio de 2 para mejorar la calidad de la imagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Marque la casilla z-stack para abrir el menú desplegable de la posición z. Mientras exploras rápidamente, concéntrate hasta que las células interneuromas estén desenfocadas. Establezca la primera rebanada y, a continuación, concéntrese en la muestra hasta que las células interneuromas estén desenfocadas una vez más. Establezca el último sector. Asegúrese de que abarca una pila z de aproximadamente 25 m. Establezca el intervalo de imágenes en 1 m.</li>
	<li>Inicie el experimento para capturar una pila z de preablación (Figura 1B). Si se han añadido posiciones de etapa, desactive la opción de posiciones para que solo se imagine la posición actual. Guarde el archivo una vez capturado.</li>
</ol>7. Ablación láser de cuerpos celulares
<ol><li>Haga clic en"Mostrar todas las herramientas". Esta opción se encuentra en la parte superior de la interfaz de adquisición.</li>
	<li>Haga clic en el menú desplegable para "Configuración de imágenes". En "Configuración de imágenes", haga clic en "Añadir una nueva pista" (representado como "+").</li>
	<li>En "Configuración de imágenes", haga clic en el menú desplegable para "Tinte". Seleccione DAPI como tinte.</li>
	<li>Haga clic en el menú desplegable de"Canales"y anule la selección de todas las demás pistas haciendo clic en sus respectivas casillas de verificación. Asegúrese de que solo está seleccionada la pista DAPI.</li>
	<li>En la pista DAPI, haga clic en 405 para el" Configuración láser". Aumente la potencia del láser al 75%. Haga clic en el canal DAPI para apagar el láser mientras busca cuerpos de celda candidatos para la ablación.</li>
	<li>Con el cuerpo de una celda interneuromast centrada en el campo de visión, haga zoom en el marco de escaneo a 20x–22x. Es posible que sea necesario ajustar la posición del marco para mantener el cuerpo de la celda en el centro a medida que se aplica el zoom. Detenga el escaneo en vivo tan pronto como el cuerpo de la celda llene el campo de visión. NOTA: El cuerpo de la celda debe ocupar todo el campo de visión. En este nivel de zoom, el GFP blanqueará rápidamente. Minimice el tiempo de exposición láser trabajando rápidamente. Utilice el zoom en lugar de seleccionar una región de interés para aumentar la distribución de energía láser en un área pequeña.</li>
	<li>Marque la caja del obturador láser de 405 nm para activar la pista. Ajuste la potencia del láser al 75%. Ajuste un temporizador para 45 s. Active el escaneo continuo e inicie el temporizador. Deje de escanear inmediatamente a 45 s.</li>
</ol>8. Imágenes posteriores a la ablación y microscopía de lapso de tiempo para estudiar la regeneración
<ol><li>Haga clic en el menú desplegable de "Canales". En los canales, desactive la pista "DAPI" para desactivar el láser de ablación. Haga clic en el menú desplegable para "Modo de adquisición".</li>
	<li>En el modo de adquisición, haga clic en"Zoom".</li>
	<li>Disminuya el zoom a 0.7 usando el control deslizante o escribiendo "0.7."<ol>
<li>Para garantizar una ablación celular exitosa, aumente la ganancia a 900 y escanee rápidamente el campo de visión. NOTA: Ningún GFP debe ser visible dentro de la celda o celdas de destino. Si todavía se observa fluorescencia, vuelva a los pasos 7.1–7.3.</li>
		<li>Utilizando la misma o similar configuración que las descritas para la creación de imágenes previas a la ablación, capture y guarde una imagen posterior a la ablación (Figura 1C). Si la imagen revela restos de células fluorescentes o cuerpos celulares adicionales que deben eliminarse, repita los pasos de ablación láser para crear un espacio visible en la cadena de células interneuromas.</li>
		<li>Inspeccione la imagen del canal T-PMT para confirmar aún más el daño celular. Las células dañadas tendrán un aspecto granular, y con frecuencia los núcleos se hinchan o se vuelven irregulares en su forma (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de capturar una imagen de preablación, ablar las celdas según sea necesario y capturar una imagen posterior a la ablación para cada posición de etapa individual, configure la microscopía de lapso de tiempo activando tanto la posición de la etapa como las opciones de tiempo para la captura de imágenes. Establezca los parámetros de tiempo en 24 h u otro punto final deseado y 15 minutos de intervalos. Inicie el experimento para adquirir imágenes y guardar el archivo resultante cuando se complete (al día siguiente).</li>
	<li>Si las larvas deben estudiarse o elevarse, retírelas cuidadosamente de la agarosa utilizando fórceps finos, luego transfiera al medio E3 sin tricaína para su recuperación. Si no se van a utilizar más, eutanasiar de acuerdo con el protocolo animal aprobado (la inmersión rápida y sostenida en un baño de hielo es un método común) y deshacerse de ellos según lo requiera la institución.</li>
</ol>9. Análisis de imagen
<ol><li>Abra un archivo z-stack posterior a la ablación en el software de procesamiento de imágenes preferido (Tabla de materiales). Divida los canales de forma que cada canal esté en un panel de visualización independiente.</li>
	<li>En la ventana del canal GFP, utilice la herramienta de línea para dibujar una línea recta entre las puntas de los INMC restantes. Esto puede ser ayudado por desplazarse hacia arriba y hacia abajo a través de la pila z o realizando una proyección de intensidad máxima antes de dibujar la línea.</li>
	<li>Utilice la herramienta"Medir"para obtener la distancia entre los extremos de INMC en los planos X e Y.</li>
	<li>Desplácese por los sectores z de la pila z original para determinar la distancia entre los INMC en el plano z.</li>
	<li>Calcular la distancia total entre los extremos de INMC utilizando el teorema de Pitágoras (a2 + b2 á c2). La hipotenusa es la distancia total (o tamaño de separación).</li>
	<li>Introduzca la medición de distancia resultante en una aplicación de hoja de cálculo para el análisis de datos.</li>
	<li>Revise los archivos de microscopía de lapso de tiempo recopilados en los pasos 8.2–8.3 utilizando el software de imágenes integrado en el sistema confocal o el software de análisis de imágenes de libre disposición. Identificar el punto de tiempo en el que la brecha entre las células interneuromas se llenó mediante proyecciones celulares. Esto puede ser ayudado por el examen de múltiples rodajas z para confirmar el cierre de la brecha en todas las dimensiones.</li>
	<li>Para lograr la medición más precisa del tiempo hasta el cierre de huecos, utilice la marca de tiempo de la imagen posterior a la ablación (visible en Finder o Explorador de archivos) como punto de tiempo cero; tiempo de medición desde el comienzo de la pila de imágenes de lapso de tiempo puede resultar en un tiempo de subestimación para el cierre, dependiendo de cuánto tiempo haya transcurrido mientras se ablan posiciones de etapa adicionales, etc.</li>
	<li>Derive la tasa de cierre simplemente dividiendo el tamaño de la brecha original por las horas o minutos necesarios para el cierre completo de la brecha.</li>
</ol>

<ol><li>Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+Sensory+Organs+to+Define+the+Path+for+Hair+Cell+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration.</a> Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo describe un método versátil para la ablación de células láser que se puede realizar en cualquier microscopio confocal equipado con un láser casi ultravioleta (longitud de onda de 405 nm). Este protocolo aborda las limitaciones de los métodos previamente empleados, como la electroablación (que causa daños más generalizados11)y la ablación pulsada con láser UV (que requiere equipos especializados adicionales12). Las imágenes confocales previas y posteriores a la ablación proporcionan una retroalimentación rápida con respecto al éxito del experimento. La posterior microscopía de lapso de tiempo ofrece un ensayo simple para la regeneración en un tipo de célula crítico para el desarrollo del sistema sensorial.
Es de vital importancia para el pez cebra transgénico que expresan fuertemente la GFP en los neuromastos y los INMC. Las larvas con fluorescencia brillante y aproximadamente un espaciado uniforme de los neuromastas derivados de la primI son candidatas ideales para la ablación con láser. Incluso en estos peces, ocasionalmente hay INMCs dimmer que al principio pueden escapar de la detección. Estas células pueden permanecer atrás después de la ablación láser, evitando la formación de una verdadera brecha entre los INMC. La ganancia digital debe ajustarse para revelar estas células dimmer durante la toma de imágenes previas a la ablación de modo que también puedan ser dirigidas con el láser de 405 nm (paso 8.2).
Del mismo modo, la segmentación por láser a veces no destruirá por completo una célula; más bien, blanqueará la fluorescencia, lo que resulta en un fracaso para crear una brecha real. Estas células generalmente aumentarán en fluorescencia durante la microscopía timelapse. El ajuste de la ganancia en el paso de imágenes posteriores a la ablación junto con la imagen T-PMT (Figura 2) ayudan a garantizar que todas las células dirigidas se hayan eliminado eficazmente. Con frecuencia requiere dos o tres ablaciones de celda individuales para producir una brecha en la cadena INMC. La muerte celular se puede detectar por blebbing o una apariencia granular en las células objetivo; aunque, esto puede requerir un breve período de espera después de la focalización láser (y en algunos casos, se observan cifras apoptóticas o necróticas aparentes poco después).
Una limitación de este procedimiento es que puede requerir múltiples ensayos experimentales antes de que se optimicen las condiciones del láser y la regeneración de INMC sea exitosa. La potencia láser y el tiempo total de permanencia del láser pueden requerir un ligero ajuste para diferentes muestras. Se ha encontrado que la aplicación excesiva de láser puede afectar la capacidad de la línea lateral para repararse a sí mismo. Esto incluye tanto 1) sobreexposición de células individuales a irradiación láser, presumiblemente causando daño adicional a los tejidos circundantes, así como 2) la ablación de demasiadas células en la cuerda, lo que conduce a una brecha más grande. Los usuarios deben lograr un equilibrio entre las células suficientemente irradiantes para asegurar su destrucción y no sobreexponer las células, lo que puede ralentizar o prevenir la regeneración. Con los ajustes apropiados, se ha encontrado que los INMC se pueden quitar sin daño visible al nervio de línea lateral posterior, lo que indica que el daño colateral se minimiza con este protocolo a diferencia de la electroablación11. En ningún caso se observaron nuevos neuromastas que se formaron en la brecha, presumiblemente porque el nervio de línea lateral permanece intacto y las células gliales subyacentes permanecen e inhiben la proliferación de INMC6,7,8,11.
Se ha demostrado que este método de ablación confórica con láser también se puede aplicar a otros tipos de células, particularmente en aquellos que se encuentran superficialmente dentro del animal, incluidas las células pilosas sensoriales (Figura 4). Se puede utilizar un protocolo similar para ablar las células de la piel para examinar la reparación de heridas o las neuronas para estudios de regeneración axonal, como se describió anteriormente13. Se prevé que esta técnica se convierta en una adición útil al repertorio experimental de laboratorios que poseen un microscopio confocal pero ningún otro equipo especializado para la ablación láser.

En el núcleo de la mayor pérdida auditiva progresiva se encuentra la destrucción de las células pilosas sensoriales, que transducen estímulos auditivos extrínsecos en impulsos nerviosos detectables por el cerebro. La muerte de las células pilosas cocleares causa pérdida auditiva permanente, ya que los mamíferos adultos carecen de la capacidad de regenerar estas células después del daño. Por el contrario, los vertebrados no mamíferos, como el pez cebra, pueden regenerar células pilosas perdidas por trauma acústico u insultos ototóxicos. La línea lateral mecanosensorial del pez cebra es un sistema de órganos simple y de fácil manipulación que se puede utilizar para estudiar la regeneración de células pilosas1,2,3.
La línea lateral consiste en pequeños parches sensoriales llamados neuromastas, que están conectados durante el desarrollo por una cadena de células alargadas conocidas como células interneuromas (INMCs). Dada su capacidad proliferativa como células madre aparentes que dan lugar a nuevos órganos que contienen células pilosas, el comportamiento de los INMCs es de gran interés para la comunidad4,5. Gran parte de la investigación relacionada con los INMC ha caracterizado la supresión de su proliferación por las células cercanas de Schwann que envuelven el nervio de la línea lateral, probablemente a través de un inhibidor de la señalización Wnt/β-catenin. 6,7,8. Si bien la regulación de la proliferación y diferenciación de INMC en nuevos neuromastas ha sido bien descrita, los mecanismos que rigen el recrecimiento del INMC después de la ablación no han sido aclarados. Este protocolo sirve como un medio para ablar inmCs individuales y analizar su comportamiento regenerativo posterior.
Se han publicado una variedad de métodos para destruir las células pilosas, las células de apoyo y los neuromastas enteros, junto con metodologías para monitorear la recuperación. La ablación química funciona bien para las células pilosas, pero las dosis de sustancias químicas tóxicas como CuSO4 deben aumentar significativamente para eliminar otros tipos de células de línea lateral9. Si bien la electroablación bajo microscopía de fluorescencia es un medio eficaz y simple de destruir a los INMC para estudiar la regeneración, es difícil apuntar de forma estrecha y, por lo tanto, es probable que produzca daños colaterales significativos. Como resultado, esto puede enmascarar aspectos de los comportamientos específicos de INMC10,11. Se han empleado protocolos de ablación láser, pero requieren el uso de equipos especializados no necesariamente presentes en el laboratorio promedio o en la instalación de imágenes (es decir, láseres UV pulsados de alta potencia12). El método descrito aquí se puede realizar con cualquier microscopio confocal de escaneo láser equipado con el láser común de 405 nm, generalmente utilizado para la toma de imágenes DAPI y otros fluoróforos azules. Una ventaja de este método es que las imágenes confocales se pueden realizar inmediatamente antes y después del daño celular sin involucrar ningún sistema de control láser adicional o transferirse a otro microscopio equipado con un láser pulsado.
Se ha descrito un método similar para las neuronas ablando en la médula espinal del pez cebra13. Sin embargo, el método anterior requiere un módulo FRAP para la ablación de la célula, que no es un requisito para este protocolo. Además, dadas las propiedades distintivas de diferentes tipos de células (es decir, brillo de fluorescencia transgénero, profundidad dentro del cuerpo y forma de celda), es probable que se necesiten modificaciones significativas dependiendo del tipo de celda utilizado. El protocolo detallado aquí es más probable que sea eficaz para las células más superficiales, como apoyado por una demostración de ablación de células del cabello sensorial utilizando el mismo método. También se describe un ensayo de regeneración para evaluar las tasas de recuperación del INMC después de la ablación, que no fue una característica del estudio antes mencionado.
El protocolo de ablación celular basado en láser detallado aquí captura la capacidad regenerativa de los INMC a través de la optimización de las condiciones del láser, las imágenes previas y posteriores a la ablación y la microscopía de lapso de tiempo. Estos elementos se unen para retratar de forma exhaustiva el recrecimiento de INMC y el cierre de brechas en su totalidad. Mientras que este protocolo se utiliza aquí para destruir inmCs, se puede aplicar a otro trabajo que requiere una evaluación confiable y eficaz de la ablación celular. También es una tecnología accesible, ya que se puede llevar a cabo en cualquier microscopio confocal equipado con un láser de 405 nm.

<table><tbody><tr><td>Portaobjetos impresos de PTFE de 12 pocillos</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>63425-05</td><td></td></tr><tr><td>15 mM Solución madre de tricaína</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>15 mM Tricaína en agua de ósmosis inversa</td></tr><tr><td>1X E3 + 600 &micro; M Tricaína</td><td></td><td></td><td>Diluir 15 mM Stock de tricaína 25X en 1X E3</td></tr> medio <tr><td>1X E3</td><td></td><td></td><td>Diluir 60X E3 medios a 1X en agua de ósmosis inversa (16,7 ml/L)</td></tr><tr><td>60 X E3 medios</td> Todos <td>los componentes comprados a Sigma-Aldrich</td><td></td><td>34,4 g Nacl, 1,52 g Kcl, 5,8 g CaCl2,2H2O, 9,8 g MgSO4.7H20 en agua de ósmosis inversa de 1 litro</td></tr><tr><td>Bx60 Microscopio compuesto con fluorescencia de lámpara de arco de mercurio Microscopio</td> confocal <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700 equipado con láseres de 405 nm, 488 nm y 555 o 561 nm</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>Para la ablación se utilizó un láser de 5 mW y 405 nm; Las ablaciones y las imágenes se realizaron a través de un objetivo Plan-Apochromat de 63x con un NA de 1.40</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ Software de procesamiento de imágenes</td><td>Múltiples colaboradores</td><td></td><td>Descargable en https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>Aguja de disección modificada en cuchillo para el cabello</td><td>Fisher Scientific</td><td>19010</td><td>Se pegó una pestaña en el extremo de una aguja de disección con mango de madera</td></tr><tr><td>Software Microsoft Excel Microsoft</td><td>Corp.</td><td></td><td>Google Sheets es una alternativa gratuita a Microsoft</td></tr><tr><td>Excel Fondo de cristal Platos de 35 mm con cubreobjetos n.º 1,5, ventana de 20 mm</td><td>Mattek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C Placa de</td><td>Petri de 35 mm, ventana de vidrio de 20 mm</td></tr><tr><td>Immersol 518F Aceite de inmersión</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de baja gelificación Sigma</td><td>Life Science</td><td>A9414-256</td><td></td></tr><tr><td>Inserto Corning Netwell con malla de poliéster de 74 mmm, inserto de 24 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3479-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Software Rstudio Rstudio</td><td>PBC</td><td></td><td>Descargable en https://rstudio.com/</td></tr> <tr><td>SMX-168-BL Microscopio estereoscópico</td><td>Pipeta de transferencia Motic</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Software Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Las células pilosas son células mecanosensoriales que median el sentido del oído. Estas células no se regeneran después del daño en los seres humanos, pero se reponen naturalmente en vertebrados no mamíferos como el pez cebra. El sistema de línea lateral de pez cebra es un modelo útil para caracterizar la regeneración de células capilares sensoriales. La línea lateral se compone de órganos que contienen células pilosas llamados neuromastas, que están unidos entre sí por una cadena de células interneuromas (INMCs). Los INMC actúan como células progenitoras que dan lugar a nuevos neuromastas durante el desarrollo. Los INMC pueden reparar huecos en el sistema de línea lateral creado por la muerte celular. Un método se describe aquí para la ablación selectiva INMC utilizando un microscopio confocal de escaneo láser convencional y peces transgénicos que expresan proteína fluorescente verde en INMCs. La microscopía de lapso de tiempo se utiliza para monitorear la regeneración de INMC y determinar la tasa de cierre de brechas. Esto representa un protocolo accesible para la ablación celular que no requiere equipo especializado, como un láser ultravioleta pulsado de alta potencia. El protocolo de ablación puede servir a intereses más amplios, ya que podría ser útil para la ablación de tipos de celdas adicionales, empleando un conjunto de herramientas que ya está disponible para muchos usuarios. Esta técnica permitirá además la caracterización de la regeneración del INMC en diferentes condiciones y a partir de diferentes orígenes genéticos, lo que avanzará en la comprensión de la regeneración celular progenitora sensorial.

Con el fin de ablar los INMC y registrar la regeneración, las larvas de peces cebras de la línea transgénica ET20 se montaron en 2 o 3 días después de la fertilización para la ablación como se describe en el paso 5.4. Varios peces se pueden montar simultáneamente para que se puedan capturar varios lapsos de tiempo en un solo experimento. Se identificó la región de la línea lateral situada entre los neuronestos primIL3 y primIL4, y las imágenes de preablación se capturaron como se describe en los pasos 6.5–6.7(Figura 1A,B).
Tres cuerpos celulares fueron blanco de ablación láser para crear un hueco en la cadena INMC de aproximadamente 40 m. La exploración posterior a la ablación con alta ganancia y posteriores imágenes confirmó que no quedaban cuerpos celulares en la región ablada, dejando una brecha entre las proyecciones alargadas de los INMC adyacentes (Figura 1C). La muerte celular se demostró aún más examinando el canal T-PMT después de la ablación. Las células dañadas y moribundas estaban marcadas por núcleos hinchados y de forma irregular, así como una apariencia granular(Figura 2, esbozada). En algunos casos, las imágenes de lapso de tiempo también revelaron el reclutamiento de grandes células amoeboides que probablemente eran macrófagos(Figura 2, asterisco). Las áreas oscuras que rodean a los INMCblados indican fotoblandia en las células de periderm que se alvanecen. Estas células no parecían estar dañadas o destruidas por la irradiación láser en estos experimentos; más bien, su fluorescencia se redujo temporalmente. La microscopía de lapso de tiempo revela que estas células normalmente se recuperan después de la ablación y no cambian de forma o de otro modo parecen dañadas (resultados no publicados, Volpe et al.).
Para apoyar la especificidad de la destrucción del INMC, se realizaron ablaciones en larvas ET20 transgénicas dobles y Tg(neuroD:tdTomato) en las que el nervio de línea lateral (que corre sólo micrones por debajo de las células del interneuroma) está etiquetado con proteína fluorescente roja. Las ablaciones de varias células que crearon espacios considerables en la cadena INMC tuvieron poco o ningún efecto en el nervio de línea lateral basado en la fluorescencia roja (Figura 3). La flexibilidad de la técnica para ablar células superficialmente localizadas se demostró mediante la destrucción selectiva de células pilosas sensoriales individuales dentro de los neuromastos de la línea lateral. Utilizando esencialmente el mismo protocolo detallado anteriormente (secciones 7 y 8), las células monoer venosas en larvas transgénicas Tg(myo6b:-actin-GFP) fueron destruidas sin daño aparente a las células adyacentes (Figura 4). Las células del cabello abladadas no recuperaron la fluorescencia después de la microscopía de lapso de tiempo, y sus núcleos eran notablemente granulares y deformados después de la exposición al láser (Figura 4B). Al igual que las ablaciones inMC, los macrófagos aparentes fueron frecuentemente reclutados para el sitio de exposición láser (resultados inéditos, Volpe et al.).
Después de la ablación láser y la captura de imágenes posteriores a la ablación, el tamaño de la brecha se midió utilizando el software de análisis de imágenes disponible libremente. La herramienta de medición demostró tamaños de brecha que van desde unos pocos micras hasta 100 micras, dependiendo de la anchura de los INMC individuales y cuántas células fueron elegidas para la ablación (Figura 5). La microscopía Timelapse se empleó para registrar los comportamientos del INMC durante la regeneración. En 50 ensayos, 15 brechas (30%) se cerraron por regeneración en un período de 24 horas. En la mayoría de los casos, los INMC que pudieron recuperarse lo hicieron dentro de las primeras horas de la toma de imágenes. La recuperación se definió como el punto de tiempo en el que las proyecciones de las células vecinas entraron en contacto, lo que ocurrió 16 h después de la ablación para un intervalo de aproximadamente 40 m(Película 1). Las pilas Z se examinaron cuidadosamente para asegurarse de que el contacto entre células celulares se produjera dentro de un único plano z, evitando posibles artefactos debido a las proyecciones z. El análisis de regresión logística reveló que la probabilidad de cierre de brecha se correlacionó con el tamaño de la brecha (p a 0,0453), con espacios más pequeños que son más propensos a sanar. Una diferencia de 55,5 m dio lugar a una probabilidad de cierre del 50%(Figura 5).
En el 70% de los casos, las INMC no pudieron cerrar por completo la brecha creada por la ablación. Sin embargo, incluso en estos casos pudimos monitorear la formación de proyecciones largas de los INMC vecinos, que se asemejan en algunos aspectos extendiendo los conos de crecimiento neuronal (Película 2). Por lo tanto, estos experimentos también pueden proporcionar información sobre los comportamientos de los INMC después del daño.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig01.jpg"> Figura 1: Ablación selectiva de células interneuromas por irradiación láser. (A) Se seleccionaron células interneuromas entre los neuromastas primIL3 y primIL4 para la ablación. Estas celdas muestran una forma de husillo característica con proyecciones alargadas superpuestas que se superponen a los sólidos de celda adyacentes. (B) Las imágenes previas a la ablación identificaron los cuerpos celulares que podrían ser ablados para producir una brecha. (C) Las imágenes posteriores a la ablación confirman la ablación exitosa, como se indica en la ausencia de cuerpos celulares en la región de brecha. Barras de escala a 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig02.jpg"> Figura 2: Las imágenes posteriores a la ablación demuestran la muerte celular en respuesta a la exposición con láser en células interneuromas etiquetadas por GFP. Las imágenes fotomultiplicadoras de luz transmitida (T-PMT) indican la presencia de una célula necrótica con una apariencia granular (rodeada), así como el reclutamiento de células de forma irregular que son probables macrófagos (*). La fusión de los canales GFP y T-PMT confirma que la muerte celular y la actividad de los macrófagos ocurrieron en el lugar de la ablación. Barras de escala a 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig03.jpg"> Figura 3: Especificidad de la ablación interneuromast. (A) Células interneuromas etiquetadas por GFP previas a la AMG (verde) y nervio de línea lateral (rojo) con etiqueta tdTomato en un Tg(ET20) doble transgénico; Larva neuroD:tdTomato). Los cuerpos celulares cerca del nervio de la línea lateral fueron atacados para la ablación. (B) Las imágenes posteriores a la ablación demuestran la ablación de cuerpos celulares dirigidos con un nervio de línea lateral intacto. Barras de escala a 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig04.jpg"> Figura 4: Ablación de células pilosas sensoriales mediante microscopía confocal. (A) Las imágenes previas a la ablación identificaron una célula del cabello sensorial etiquetada por la GFP (*) destinada a la ablación en peces cebra Tg(ET20; myo6b:-actin-GFP) con etiqueta GFP. Las imágenes de tubos fotomultiplicadores de luz transmitida (T-PMT) revelan la morfología normal de las células pilosas, con una sección transversal redonda. (B) Las imágenes posteriores a la ablación confirman la ablación exitosa de la célula capilar objetivo. Una imagen T-PMT indica irregularidad en la forma de la célula del cabello y aumento de la granularidad después de la exposición al láser, lo que sugiere la muerte celular en lugar de la fotoblancada. Barras de escala a 10 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig05.jpg"> Figura 5: La regresión logística modela la probabilidad de cierre de separación en función del ancho de la brecha (en m). Una puntuación de 0 representa el cierre de brechas completo, mientras que una puntuación de 1 representa el cierre de brecha incompleto. Los resultados indican que el efecto del ancho de la brecha en la capacidad de las células interneuromas para cerrar las brechas respectivas es estadísticamente significativo (p - 0,0453, n a 24 en total; n a 12 huecos cerrados, n a 12 brechas incompletamente cerradas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película 1: Microscopía de lapso de tiempo que demuestra el cierre de la brecha (40 m) después de 16 h. Las imágenes se capturaban cada 15 minutos, y se hacía una proyección z de intensidad máxima para todos los puntos de tiempo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60966/Suppl_Movie_1.avi" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Película 2: Microscopía de lapso de tiempo de una brecha INMC que no se cerraba. Se muestran las proyecciones alargadas y ramificadas de los INMC restantes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60966/Suppl_Movie_2.avi" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>

La ablación láser es una tecnología ampliamente aplicable para el estudio de la regeneración en sistemas biológicos. El protocolo presentado describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser estándar para la ablación láser y la posterior imagen de lapso de tiempo de las células interneuromas regeneradoras en la línea lateral del pez cebra.

Ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Usando este protocolo, cualquier laboratorio que tenga un microscopio confocal estándar equipado con un láser de 405 nanómetros puede realizar ablaciones láser progenitoras de células capilares y monitorear su regeneración. A diferencia de la electroablación, esta técnica limita los daños que dañan las células circundantes y es más accesible que una potente configuración láser UV pulsada. Las imágenes confocales también se pueden realizar inmediatamente antes y después de la ablación.Esta técnica nos permite comprender mejor el comportamiento regenerativo de los progenitores sensoriales, lo que puede ayudar en el desarrollo de terapias para la pérdida auditiva humana. Para el montaje, primero pipetear tres a cuatro anestesifica larvas en una pequeña gota de solución de tricaína E3 en el centro de la placa de 35 milímetros, con un fondo de cubierta de 14 milímetros 1.5. Retire el exceso de solución para que las larvas permanezcan en una gota pequeña lo suficientemente grande como para contenerlas.Y coloque el plato en el escenario de un microscopio estereomático binocular. Manipule el zoom y el enfoque para que todas las larvas estén en el campo de visión y utilice una pipeta de transferencia para agregar una fina capa de agrocontrasión en el resbalón de la cubierta. Retire el exceso de agros hasta que el líquido se llene el pozo en la parte inferior del plato, teniendo cuidado de no aspirar ninguna larva.Y usa un cuchillo para el cabello para orientar rápidamente las larvas en la agro-solución con el lado rostral orientado hacia la izquierda. Presione suavemente las larvas contra el vidrio, de manera que las larvas estén en el perfil con sus lados derecho hacia abajo. Después de unos 60 segundos, los agros comenzarán a solidificarse y las larvas no podrán ser reorientadas.Después de cinco minutos, utilice una pipeta de transferencia para llenar el plato a mitad de camino con E3 complementado con 1X tricaína. Para localizar objetivos prospectivos, encienda el sistema de microscopía confocal de escaneo láser e inicialice el láser a través del software de imágenes integrado. Seleccione el objetivo de inmersión en aceite 63X Plan-Apochromat y aplique aceite de inmersión a la lente.Asegurar el plato en un inserto de etapa circular con el aspecto rostral de las larvas mirando hacia la izquierda. Mediante la iluminación de contraste de interferencia diferencial o de campo brillante, seleccione una de las larvas montadas para la toma de imágenes y utilice la perilla de enfoque para enfocar la piel en el lado del pez más cercana al resbalón de la cubierta. Cambie a la iluminación epifluorescente en el canal GFP y localice la línea lateral posterior mediante la expresión GFP a lo largo del mioseptum horizontal.Los anillos de células fluorescentes son indicativos de las células del manto neuromast y las hebras alargadas de las células son las células interneuromas. Comenzando con el primer neuromast primordium migratorio, utilice el joystick de control de escenario para escanear visualmente caudalmente a lo largo del mioseptum horizontal. Siguiendo la cadena de células interneuromas hasta que se alcanza la región entre el tercer y el cuarto neuromasts primordium migratorio.Si se van a tomar imágenes de varias larvas, seleccione la posición para establecer la primera posición de la etapa. Una vez identificados los cuerpos celulares en la región L3, L4, cambie al modo de adquisición y utilice un láser adecuado para activar la pista de imágenes GFP. Para agregar un canal de luz transmitido a la pista láser activada, haga clic en el cuadro T-PMT del menú desplegable configuración de imágenes.Para crear imágenes de larvas ET20, seleccione el láser de 488 nanómetros, establezca la potencia del láser en 6%el tamaño del agujero en un equivalente de unidad de área y la ganancia digital en 750. Ajuste las ganancias de tal manera que los cuerpos celulares estén saturados para capturar proyecciones tenues y filopodia. Y establezca el tamaño del fotograma en 1, 024 por 1, 024 píxeles, el promedio a dos y el zoom digital a 0.7.Marque la casilla de la pila Z para abrir el menú desplegable de la posición Z. Mientras escanea rápidamente, concéntrate hasta que las células interneuromas estén desenfocadas y establece la primera rebanada. Concéntrese a través de la muestra hasta que las células interneuromas estén desenfocadas una vez más y establezca la última rebanada.A continuación, haga clic en detener y haga clic en Iniciar experimento para capturar una pila Z previa a la ablación. Si se han añadido las posiciones de etapa, desactive la opción de posiciones para que solo se imagine la posición actual y guarde el archivo una vez que se haya capturado. Para la ablación láser de los cuerpos de celda de destino, haga clic en Mostrar todas las herramientas en la interfaz de adquisición y, en el menú de configuración de imágenes, seleccione Agregar una nueva pista.Haga clic en tinte y seleccione DAPI. En Canales, seleccione 405 para el ajuste láser y aumente la potencia del láser al 75% Haga clic en el canal DAPI para apagar el láser mientras busca cuerpos celulares candidatos para la ablación. Haga clic en vivo y con el cuerpo de una celda interneuromast centrada en el campo de visión, haga zoom en el marco de escaneo a 20 a 22X.Detenga el escaneo en vivo tan pronto como el cuerpo de la celda llene el campo de visión. Marque la caja del obturador láser de 405 nanómetros para activar la pista y ajuste un temporizador durante 45 segundos. A continuación, active el escaneo continuo e inicie el temporizador.Detenga inmediatamente el escaneo a los 45 segundos. Para obtener imágenes de los cuerpos celulares después de la ablación, en el menú de canales, desactive la pista DAPI para desactivar el láser de ablación y abra el menú del modo de adquisición. Haga clic en zoom y disminuya el zoom a 0,7.Para evaluar el éxito de la ablación celular, escanee rápidamente el campo de visión. Utilizando la misma configuración que la de la imagen previa a la ablación, capture y guarde una imagen posterior a la ablación. Inspeccione la imagen del canal del tubo fotomultiplicador de luz transmitida para confirmar aún más el daño celular.Las células dañadas demostrarán una apariencia granular y los núcleos con frecuencia se hinchan o aparecen de forma irregular. Para evaluar la recuperación del cuerpo de la célula posterior a la ablación, active las opciones de posición de la etapa y de tiempo para la captura de imágenes de lapso de tiempo y establezca los parámetros de tiempo en el punto de tiempo experimental adecuado y en los intervalos de 15 minutos. A continuación, inicie el experimento para adquirir imágenes y guarde el archivo resultante cuando haya finalizado.En este experimento representativo, se identificó la región de la línea lateral situada entre el tercer y el cuarto neuromasta primoridio migratorio y se capturaron imágenes previas a la ablación. La exploración posterior a la ablación confirmó que no quedaban cuerpos celulares en la región ablada. Dejando un hueco entre las proyecciones alargadas de las células interneuromas adyacentes.El análisis del canal de tubo fotomultiplicador de luz transmitida después de la ablación, revela células dañadas y moribundas. Marcado por núcleos hinchados y de forma irregular y una apariencia granular. También se puede observar el reclutamiento de grandes células amoeboides que probablemente sean macrófagos.En este experimento, la ablación de varias células en las larvas transgénicas dobles creó brechas considerables en la cadena de las células interneuromas, pero tuvo poco o ningún efecto en el nervio de línea lateral. Después de la ablación láser, se pueden medir los tamaños de separación. Desde unas pocas micras hasta 100 micras, dependiendo del ancho que las células neuromasmas individuales y cuántas células se seleccionan para la ablación.Después de la ablación, algunas células interneuromast se recuperan dentro de las primeras horas de la toma de imágenes. Con la probabilidad de cierre de brecha correlacionado negativamente con el tamaño de la brecha. Incluso en las células interneuromas que son incapaces de recuperarse sin embargo, se puede observar la formación de proyecciones largas de las células interneuromas vecinas, que pueden parecerse a la extensión de los conos de crecimiento neuronal.Es importante inspeccionar a fondo el canal T-PMT en busca de células dañadas que presenten núcleos y granularidad de forma irregular, y que se permita tiempo suficiente para que estos indicadores de muerte celular se vuelvan visibles. Un análisis posterior de los datos resultantes de la microscopía de lapso de tiempo, puede revelar potencialmente nuevos comportamientos celulares inducidos por la ablación láser y puede guiar el desarrollo de experimentos para identificar reguladores de regeneración. Esta técnica nos ha permitido estudiar los reguladores moleculares de la regeneración celular interneuromas proporcionando un método rápido y rentable para dañar selectivamente estas células.

confocal-microscope-based-laser-ablation-regeneration-assay-zebrafish

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

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Este video demuestra el método para estudiar la detección visual de presas en larvas de pez cebra transgénicas utilizando imágenes fluorescentes basadas en indicadores de calcio con sus neuronas expresando complejos indicadores de calcio fluorescentes.

Análisis de la actividad neuronal evocada por presas en una larva de pez cebra transgénica

Fuente: Volpe, B. A., et al. Ensayo de ablación y regeneración láser basado en microscopio confocal en células interneuromast de pez cebra. J. Vis. Exp.{{TAG_ 31}} (2020) Este video demuestra el monitoreo de la recuperación de los interneuromastocitos en el pez cebra utilizando microscopía confocal, rastreando la muerte celular y la reparación a través de imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo.

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Source: Morsch, M.,  et. al., desencadenando el estrés y la muerte celular utilizando microscopía confocal convencional con láser UV. J. Vis. Exp. (2017) En este video, exploramos la técnica de ablación con láser UV de alta intensidad para apuntar y estudiar con precisión las neuronas individuales en el pez cebra transgénico. Demostramos cómo preparar, inmovilizar y visualizar las respuestas neuronales, destacando la dinámica celular de la lesión y la recuperación.

Ablación selectiva con láser de una sola neurona en una larva de pez cebra utilizando un microscopio confocal

Fuente: Muto, A., et al. Ablación de una población neuronal mediante láser de dos fotones y su evaluación mediante imágenes de calcio y registro de comportamiento en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018) En este video,  Se demuestra un procedimiento de ablación con láser de dos fotones, que permite la destrucción selectiva de neuronas fluorescentes en larvas de pez cebra inmovilizadas con agarosa. Las imágenes de alta resolución antes y después del procedimiento confirman un daño neuronal...

Ablación neuronal dirigida mediante microscopía de dos fotones en un pez cebra Larava

Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

El pez cebra es un popular modelo animal para estudiar mecanismos de degeneración/regeneración retiniana en vertebrados. Este protocolo describe un método para inducir lesiones localizadas interrumpir la retina externa con mínimo daño a la retina interna. Posteriormente, hacemos un seguimiento en vivo la morfología retiniana y la respuesta de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.

Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

Aquí, presentamos un protocolo para ablación de una subpoblación genéticamente marcada de neuronas por un láser de dos fotones de larvas de pez cebra.

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo detallado para examinar la actividad neuronal en regiones cerebrales de pez cebra transgénico que expresan indicadores de calcio GCaMP utilizando microscopía confocal.

In vivo Imágenes de fluorescencia confocal de la actividad neuronal inducida por estimulación sensorial en larvas de pez cebra parcialmente restringidas

Aprende ablación láser con microscopio confocal para estudiar la regeneración de células interneuromas en peces cebra Danio rerio. Este método permite monitorear progenitores de células ciliadas con precisión y mínimo daño colateral.

Ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra

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