Preparación de muestras TMT para la presentación de instalaciones proteómicas y análisis de datos posteriores

Los principales beneficios de este protocolo son que reduce los costos de etiquetado, mejora la extracción de proteínas y genera datos de alta calidad. Las principales ventajas de nuestro protocolo son las altas eficiencias de etiquetado para los diferentes tipos de muestras, su reproducibilidad y la adquisición de datos confiables. Después de aislar muestras de tejido muscular del cuádriceps de un ratón eutanizado de acuerdo con un protocolo aprobado por la IACUC, pesar 10 miligramos de tejido muscular y utilizar pinzas para separar las fibras musculares.

Para crear un alate, transfiera la muestra de tejido separado a un tubo de dos mililitros que contenga 200 microlitros de cuentas de sílice de zirconia de un milímetro y 500 microlitros de tampón de lysis CHAPS. Coloque las muestras en un disruptor de cordón y realice dos corridas secuenciales de 45 segundos. Después del segundo ciclo, para liberar la proteína unida al ADN, sonicar la muestra 10 veces durante 10 segundos por sonicación a una amplitud del 50% con intervalos de 30 segundos en hielo.

Después de la última sonicación, centrifugar el izado y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga. Para reducir/alquilar el tratamiento de reactivos, transfiera 200 microgramos de proteína por condición a nuevos tubos centrífugos y utilice un tampón de lisis CHAPS fresco para llevar el volumen final en cada tubo hasta 100 microlitros. A continuación, agregue cinco microlitros de TCEP a cada tubo e incubar las muestras a 55 grados centígrados durante una hora.

Al final de la incubación, disolver nueve miligramos de yodoacetamida en 132 microlitros de 100 TEAB mililolar y proteger la solución de iodoacetamida milimolar resultante de la luz. A continuación, añada cinco microlitros de yodoacetamida a cada muestra e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Para la precipitación de metanol/cloroformo, agregue 400 microlitros de metanol a cada 100 microlitros de proteína y vórtice brevemente las muestras.

Para incorporar los líquidos depositados en los lados de los tubos de muestra, centrifuga brevemente las muestras y agregue 100 microlitros de cloroformo a cada tubo. Después de un breve vórtice, centrifuga rápidamente los tubos de nuevo para recoger el líquido en los lados de los tubos y añadir 300 microlitros de agua a las muestras. Vortex vigorosamente para obtener soluciones homogéneas y centrifugar las muestras durante un minuto en las mismas condiciones de centrífuga.

Al final de la centrífuga, transfiera los tubos cuidadosamente a un bastidor sin alterar las capas y retire cuidadosamente el sobrenadante. Añadir 300 microlitros de metanol a las fases entre e inferior restantes y vórtice de nuevo las muestras. Centrifugar las muestras durante dos minutos y aspirar cuidadosamente los sobrenadantes.

A continuación, aspira suavemente tanto líquido de cada muestra como sea posible bajo una corriente de aire hasta que los pellets estén un poco húmedos. Evalúe la hidratación cada dos minutos durante unos 10 minutos. Si es necesario, los pellets se pueden almacenar a menos 80 grados Celsius hasta su posterior procesamiento.

Para digerir la proteína, resuspender el pellet precipitado en 100 microlitros de tampón de lisis TEAB y añadir 100 microlitros de solución de almacenamiento de trippsina en el fondo de un vial de vidrio de trippsina de 100 microgramos. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, añadir 2,5 microlitros de la solución de trippsina recién preparada por cada 100 microgramos de proteína a cada muestra e incubar las muestras a 37 grados Celsius durante la noche. Para el etiquetado de péptidos, disuelva cada vial de etiqueta TMT de 0,8 miligramos con 41 microlitros de acetonitrilo anhidro por etiqueta e incubar los reactivos durante cinco minutos a temperatura ambiente con vórtice ocasional mientras mantiene las etiquetas protegidas de la luz.

Al final de la incubación, centrifuga brevemente los viales y agregue cuidadosamente 41 microlitros de reactivo de etiqueta TMT a cada muestra de 100 microlitros para una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, apagar las reacciones con la adición de ocho microlitros de 5%hidroxiamina durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, divida las muestras en alícuotas iguales en nuevos tubos centrífugos para almacenar a menos 80 grados centígrados.

En esta adquisición representativa de datos, se analizaron 39, 653 péptidos totales, de los cuales 4, 457 tenían igual o mayor que dos péptidos únicos y 3 829 incluía iones reportero para todos los canales. Se utilizó un corte de cambio de pliegue para determinar la distribución relativa de proteínas de células enfermas en comparación con células sanas con 296 proteínas de abundancia significativamente menor y 108 proteínas de abundancia significativamente mayor observadas. El análisis de PANTHER mostró una lista categorizada de proteínas basada en una abundancia significativamente menor o mayor de células enfermas basadas en su función molecular.

El análisis de cuerdas de las proteínas de abundancia significativamente menor o mayor identificó además múltiples interacciones y fuertes asociaciones entre proteínas. Se pueden realizar métodos adicionales para identificar interacciones entre proteínas, clasificar las interacciones por grupos e identificar las interacciones en una variedad de vías. Las técnicas de proteómica son herramientas poderosas dentro de los campos de investigación biomédica para comprender los mecanismos del desarrollo de enfermedades proporcionando información detallada sobre la abundancia de proteínas.