Name: Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a detectar interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans mediante el ensayo de ligadura de proximidad. Esta técnica revela patrones espaciales y temporales con sensibilidad comparable a FRET.

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Algunas cepas de nematodos utilizadas en este estudio fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis financiado por el NIH (P40OD010440). La microscopía confocal se realizó en el Laboratorio de Investigación Core de la Universidad de Montana BioSpectroscopy operado con el apoyo de los NIH Awards P20GM103546 y S10OD021806. Este trabajo fue apoyado en parte por la concesión de NIH GM109053 a E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 a X.W., y montana Academy of Sciences award a X.W. Los funders no participaron en el diseño del estudio ni en la redacción del informe. Agradecemos a M. Ellenbecker por su discusión.

<ol><li>Berggård, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Nooren, I. M., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li>
<li>Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hub+promiscuity+in+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Hub promiscuity in protein-protein interaction networks.</a> International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).</li>
<li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).</li>
<li>Nousch, M., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).</li>
<li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA%2C+a+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+situ+protein-protein+complexes+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+using+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52139(2015).</li>
<li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li>
<li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29%3A+a+5-year+update+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).</li>
<li>Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45 (3), 185-191 (2008).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein%3A+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li>
<li>Erdős, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).</li>
<li>Navarro-Lérida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNLL%2FLC8%3A+a+light+chain+subunit+of+the+dynein+motor+complex+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond.</a> FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).</li>
<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8%2FDYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818(2011).</li>
<li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+IDP+assemblies%3A+Unique+properties+of+LC8-associated%2C+IDP+duplex+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li>
<li>Jespersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+recognition+motifs+for+the+hub+protein+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8.</a> Life Science Alliance. 2 (4), (2019).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+light+chain+DLC-1+promotes+localization+and+function+of+the+PUF+protein+FBF-2+in+germline+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells.</a> Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).</li>
<li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li>
<li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li>
<li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li>
<li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zinc+finger+proteins%2C+OMA-1+and+OMA-2%2C+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li>
<li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).</li>
<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+in+C.+elegans+using+%22freeze-cracking%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Crittenden, S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+immunolabeling+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Cuando se estudian los IBP en la línea germinal de C. elegans, la mayor resolución ofrecida por el ELA en comparación con la inmunoinserización permite la visualización y cuantificación de lugares donde se producen interacciones en la línea germinal. Anteriormente se informó que el DLC-1 interactúa directamente con OMA-1 utilizando un ensayo desplegable in vitro del GST26; sin embargo, esta interacción no fue recuperada por un pulldown in vivo. La co-inmunoinseración fluorescente...

Se estima que más del 80% de las proteínas tienen interacciones con otras moléculas1,lo que hace hincapié en la importancia de los IBP para la ejecución de funciones biológicas específicas en la célula2. Algunas proteínas funcionan como centros que facilitan el montaje de complejos más grandes que son necesarios para la supervivencia celular1. Estos concentradores median múltiples IBP y ayudan a organizar las proteínas en una red que facilita funciones específicas en una celda3. La formación de complejos proteicos también se ve afectada por el contexto biológico, como la presencia o ausencia de socios interactuadores específicos4,eventos de señalización celular y la etapa de desarrollo de una célula.
C. elegans se utiliza comúnmente como un organismo modelo para una variedad de estudios, incluyendo el desarrollo. La simple anatomía de este animal se compone de varios órganos, incluyendo la gónada, el intestino y la cutícula transparente, que facilita el análisis del desarrollo del gusano. La germlina que reside en la gónada es una gran herramienta para estudiar cómo las células madre germinales maduran en gametos5 que se convierten en embriones y, finalmente, en la próxima generación de progenie. La región de la punta distal de la línea germinal contiene un grupo de células madre autonuevas(Figura 1). A medida que las células madre salen del nicho, progresan hacia el paquiteno meiótico y finalmente se convierten en ovocitos en la etapa adulta joven(Figura 1). Este programa de desarrollo en la línea germinal está estrechamente regulado a través de diferentes mecanismos, incluyendo una red reguladora post-transcripción facilitada por proteínas de unión al ARN (RBP)6. Los IBP son importantes para esta actividad regulatoria, ya que los PBP se asocian con otros cofactores para ejercer sus funciones.
Hay varios enfoques que se pueden utilizar para sondear los IBP en el gusano, pero cada uno tiene limitaciones únicas. La inmunoprecipitación in vivo (IP) se puede utilizar para aislar complejos de proteínas y proteínas de extractos de gusanos enteros; sin embargo, este enfoque no indica dónde se produce el IBP en el gusano. Además, los complejos proteicos que son transitorios y sólo se forman durante una etapa específica de desarrollo o en un número limitado de células pueden ser difíciles de recuperar por co-inmunoprecipitación. Por último, los experimentos de IP deben abordar las preocupaciones del reordenamiento complejo de proteínas después de la lisis y la retención no específica de proteínas en la matriz de afinidad.
Los enfoques alternativos para la detección in situ de IBP son la co-inmunoingestión, la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) y la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC). La inmunoinserción se basa en la detección simultánea de dos proteínas de interés en el tejido de gusano fijo y la medición del alcance de la colocalización de la señal. El uso de la microscopía de superresolución, que ofrece un mayor detalle que la microscopía estándar7,ayuda a probar más rigurosamente la colocalización de proteínas más allá de la barrera limitada por difracción de 200-300 nm8. Sin embargo, la co-inmunomancha utilizando micromicroscopía convencional y de superresolución funciona mejor para proteínas con patrones de localización bien definidos. Por el contrario, se vuelve mucho menos informativo para los socios que interactúan distribuidas difusamente. La medición para la colocalización de señales basadas en la superposición no proporciona información precisa sobre si las proteínas están en complejo entre sí9,10.
Además, la co-inmunoprecipitación y la co-inmuno-inmunoinactividad de los complejos proteína-proteína no son cuantitativas, por lo que es difícil determinar si tales interacciones son significativas. FRET y BiFC son técnicas fluorescentes. FRET se basa en el etiquetado de proteínas de interés con proteínas fluorescentes (FP) que tienen superposición espectral en la que la energía de un FP (donante) se transfiere a otro FP (aceptador)11. Esta transferencia no radiativa de energía da lugar a la fluorescencia del FP aceptador que se puede detectar en su respectiva longitud de onda de emisión. BiFC se basa en la reconstitución de una proteína fluorescente in vivo. Implica dividir GFP en dos fragmentos complementarios, como hélices 1-10 y hélice 1112,que luego se fusionan en dos proteínas de interés. Si estas dos proteínas interactúan, los fragmentos complementarios de GFP se vuelven lo suficientemente cercanos como para plegarse y ensamblarse, reconstituyendo el fluoróforo de GFP. La GFP reconstituida se observa directamente como fluorescencia e indica dónde se ha producido un IBP.
Como tal, tanto FRET como BiFC dependen de grandes etiquetas fluorescentes que pueden alterar la función de la proteína etiquetada. Además, FRET y BiFC requieren una expresión abundante y comparable de las proteínas etiquetadas para obtener datos precisos. FRET puede no ser adecuado para experimentos en los que un socio es superior al otro, lo que puede conducir a un fondo alto13. También se debe evitar la sobreexpresión en experimentos DeFC, ya que esto puede inducir un ensamblado no específico14 que da lugar a un mayor fondo. Ambas técnicas requieren la optimización de las condiciones de expresión e imagen de las proteínas etiquetadas, lo que puede prolongar el tiempo necesario para completar los experimentos.
El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) es un enfoque alternativo que puede abordar las limitaciones de las técnicas mencionadas anteriormente. PLA aprovecha los anticuerpos primarios que reconocen las proteínas de interés (o sus etiquetas). Estos anticuerpos primarios están enlazados por anticuerpos secundarios que contienen sondas de oligonucleótidos que pueden hibridarentrelazados entre sí cuando están dentro de una distancia de 40 nm (o más corta)15. El ADN hibridado resultante se amplifica a través de una reacción PCR, que es detectada por sondas que complementan el ADN. Esto da como resultado focos que son visualizados por un microscopio. Esta tecnología puede detectar IBP in situ en tejidos complejos (es decir, la gónada de gusano), que se organiza como una línea de ensamblaje que contiene células en varias etapas de desarrollo y diferenciación. Con PLA, los IBP se pueden visualizar directamente en una gónada de gusano fija, lo que es ventajoso para investigar si los IBP se producen durante una etapa específica de desarrollo. PLA ofrece una mayor resolución de los IBP en comparación con los ensayos basados en la colocalización, que es ideal para realizar mediciones precisas. Si se utiliza, la microscopía de superresolución tiene el potencial de proporcionar detalles más finos sobre la ubicación de los focos de PLA dentro de una célula. Otra ventaja es que los focos resultantes de las reacciones PLA pueden ser contados por un flujo de trabajo de análisis basado en ImageJ, haciendo que esta técnica sea cuantitativa.
La familia LC8 de cadenas ligeras de dynein fue descrita por primera vez como una subunidad del complejo de motores de dinin16 e hipotetizado para servir como adaptador de carga. Desde su descubrimiento inicial, LC8 se ha encontrado en múltiples complejos proteicos además del complejo motor de dinina17,,18,,19,,20. El escaneo de secuencias de proteínas que contienen el motivo de interacción LC819 sugiere que LC8 puede tener muchas interacciones con una amplia gama de diferentes proteínas17,,18,19,20,21,22. Como resultado, las proteínas de la familia LC8 ahora se consideran centros que ayudan a promover el ensamblaje de complejos proteicos más grandes19,,22, como ensamblajes de proteínas intrínsecamente desordenadas21.
Una proteína de la familia C. elegans LC8, cadena de luz de dinneina-1 (DLC-1), se expresa ampliamente en muchos tejidos y no se enriquece en estructuras subcelulares específicas23,24. En consecuencia, la identificación de socios in vivo biológicamente relevantes de DLC-1 en C. elegans es difícil por varias razones: 1) la coinmunoprecipitación no indica la fuente de tejido donde se produce la interacción; 2) la expresión limitada de socios particulares o las interacciones transitorias pueden obstaculizar la capacidad de detectar una interacción por coinmunoprecipitación; y 3) la distribución difusa de DLC-1 conduce a una superposición no específica con las proteínas potenciales asociadas mediante la inmunoingestión. Basado en estos desafíos, PLA es un enfoque ideal para probar interacciones in vivo con DLC-1.
Se ha informado previamente que DLC-1 interactúa directamente con y sirve como cofactor para las proteínas de unión al ARN (RBP) FBF-223 y GLD-125. Nuestro trabajo apoya el modelo de DLC-1 sirviendo como proteína de cubo y sugiere que DLC-1 facilita una red de interacción que abarca más allá de la dinin19,,22. Usando un ensayo desplegable GST, se ha identificado un nuevo RBP de interacción con DLC-1 denominado OMA-126. OMA-1 es importante para el crecimiento de ovocitos y la maduración meiótica27 y funciona en conjunto con una serie de represores y activadores traslacionales28. Mientras que FBF-2 y GLD-1 se expresan en las células madre y las regiones meioticas de paquiteno, respectivamente, OMA-1 se expresa difusamente en la línea germinal del paquiteno meiotico a través de los ovocitos27 (Figura 1). Esto sugiere que el DLC-1 forma los complejos con los RBP en las diversas regiones de la gónada. También se ha encontrado que la interacción directa entre DLC-1 y OMA-1 observada in vitro no se recupera mediante una IP in vivo. El PLA se ha utilizado con éxito como un enfoque alternativo para estudiar más a fondo esta interacción en la línea germinal de C. elegans, y los resultados sugieren que el PLA se puede utilizar para sondear muchos otros IBP en el gusano.

<table><tbody><tr><td>Solución de paraformaldehído al 16% Servicios de</td><td>microscopía electrónica</td><td>15710</td><td>utilizado para hacer una solución de trabajo al 4%</td></tr><tr><td>1M KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>Prepare un material de trabajo</td>de</tr><tr><td>1M 1x M9</td><td>varios</td><td>varios</td><td>preparados como 10x stock utilizado en 1x; ver wormbook.org para el protocolo</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>varios</td><td>varios ver</td><td> wormbook.org para el protocolo</td></tr><tr><td>Aguja de calibre 26.5</td><td>Exel International</td><td>26402</td><td>Agujas utilizadas para la disección</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td></td> BSA Lampire 7500802 <td></td> Thermo Scientific 05-529C <td>50ml Tubo de centrífuga Oak Ridge utilizado para la sincronización</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Tarro Coplin PolyLab 62101 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos para congelar muestras</td><td>Globe Scientific</td><td>1411-10</td><td>22x40mm, n.º 1</td></tr><tr><td>cubreobjetos para sellar portaobjetos</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td>22x22mm, n.º 1.5</td></tr><tr><td>DAPI Medio de montaje para vector de inmunofluorescencia</td><td></td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Ligasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82029</td><td>Duolink 1x Ligasa, viene como parte del kit rojo de reactivos de detección in situ Duolink DUO92008</td></tr><tr><td>Tampón rojo de amplificación</td><td>Sigma-Aldrich DUO82011</td><td></td><td>Duolink 5x Tampón rojo, viene como parte del kit rojo de reactivos de detección in situ Duolink DUO92008</td></tr><tr><td>tampón de ligadura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82009</td><td>tampón de ligadura Duolink 5x, viene como parte del kit rojo de reactivos de detección in situ Duolink DUO92008</td></tr><tr><td>diluyente de anticuerpos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82008</td><td>Diluyente de anticuerpos Duolink, viene con DUO92004 y DUO92002, Nota: También se puede usar una solución de 1x PBS/1% BSA como sustituto para diluir el anticuerpo.</td></tr><tr><td>Solución</td><td>de bloqueo Sigma-Aldrich</td><td>DUO82007</td><td>solución de bloqueo Duolink, viene con DUO92004 y DUO92002</td></tr><tr><td>medio de montaje para PLA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td>Duolink Medio de montaje in situ con</td></tr><tr><td>sonda</td> DAPI MINUS <td>Sigma-Aldrich DUO92004</td><td></td><td>Sonda in situ Duolink Sonda anti-ratón MINUS</td></tr><tr><td>PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Sonda in situ Duolink Tampón de lavado Anti-Rabbit PLUS</td></tr><tr><td>A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink Tampón de lavado in situ A Tampón</td></tr> de <tr><td>lavado B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Duolink Tampón de lavado in situ B</td></tr><tr><td>Polimerasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82030</td><td>Duolink Polimerasa, Viene como parte de los reactivos de detección in situ Duolink Kit rojo DUO92008</td></tr><tr><td>Microscopio epifluorescente</td><td>Leica</td><td></td><td>DFC300G cámara, DM5500B microscopio</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón Alexa 594</td><td>JacksonImmuno</td><td>115-585-146</td><td>Uso a 1:500</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo Alexa 488</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-545-144</td><td>Uso a 1:200</td></tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td></tr><tr><td>Pipeta de vidrio</td><td>Corning</td><td>7095B-5X</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>ACROS Orgánicos</td><td>187870100</td><td>Prepare un material de trabajo de 250 mM</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Uso a 1:1000 para inmunofluorescencia y PLA, prebloqueo con suero de cabra normal</td></tr><tr><td>recomendado Esmalte de uñas</td><td>L.A. colores</td><td>CNP195</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de nematodos (NGM)</td><td>varios</td><td></td><td>Consulte wormbook.org para protocolo</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>JacksonImmuno</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Polietileno Pasteur Pipeta</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>Preparado como solución madre al 0,1% en agua, almacenado a -20 °C y diluido 1:100 en agua para recubrir portaobjetos</td></tr><tr><td>Placas de Petri Tritech</td><td></td><td>PD7060</td><td>60 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Conejo anti-GFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>G10362</td><td>Úselo a 1:200 para inmunofluorescencia, 1:4000 para portaobjetos de PLA</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>30-2066A-Brown</td><td>Los portaobjetos esterilizables en autoclave de tres cuadrados de 14x14 mm con barras se piden a medida a través de Fisher Scientific. Poly-L-Lisina añadida a portaobjetos en el laboratorio</td></tr><tr><td>Solución de hipoclorito de sodio</td><td>Toallitas</td> de trabajo <td>Fisher Scientific SS290-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimtech</td><td>34120</td><td>Toallitas de trabajo de 4,4x8,4 pulgadas</td></tr><tr><td>Bandejas (242x241x20mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>240845 Se utiliza para hacer cámara húmeda</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>Agua ultrapura obtenida del sistema integral de purificación de agua Milli-Q</td></tr><tr><td>Watchglass</td><td>Carolina Biological</td><td>742300-20</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C congelador-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C congelador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 cepa E. coli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>cepas de nematodos utilizadas en este estudio (ambas disponibles a pedido)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td><td></td><td>UMT 376</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Referencia 24</td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td><td></td><td>UMT 422</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Referencia: este estudio</td></tr></tbody></table>

detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de c. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Comprender cuándo y dónde se producen las interacciones proteína-proteína (IPP) es fundamental para comprender la función proteica en la célula y cómo se ven afectados procesos más amplios como el desarrollo. La línea germinal Caenorhabditis elegans es un gran sistema modelo para estudiar los IBP relacionados con la regulación de las células madre, la meiosis y el desarrollo. Existen una variedad de técnicas bien desarrolladas que permiten etiquetar proteínas de interés para su reconocimiento por anticuerpos estándar, lo que hace que este sistema sea ventajoso para las reacciones de ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Como resultado, el PLA es capaz de mostrar dónde los IBP se producen de manera espacial y temporal en líneas germinales de manera más eficaz que los enfoques alternativos. Aquí se describe un protocolo para la aplicación y cuantificación de esta tecnología para sondear los IBP en la línea germinal c. elegans.

Co-inmunomanchado de ambos 3xFLAG::DLC-1; GFP y 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlíneas con anticuerpos FLAG y GFP revelaron sus patrones de expresión en la línea germinal(Figura 3Aii-iii,3Bii-iii). Mientras que la GFP se expresó a lo largo de la línea germinal(Figura 3Aiii), la expresión OMA-1::GFP se limitó al paquiteno tardío y a los ovocitos(Figura 3Biii)</s...

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

El ensayo de ligadura de proximidad permite a los usuarios detectar interacciones proteína-proteína in situ, revelando patrones espaciales y temporales de las interacciones. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas importantes sobre la regulación del desarrollo de C.elegans. Esta técnica ofrece una sensibilidad comparable para la detección de interacciones proteína-proteína sin la complejidad de otras técnicas, como FRET y BiFC.Individuos que nunca han diseccionado gusanos para liberar las gónadas pueden luchar con este paso. Practique gusanos diseccionados y utilícelos para la inmunofluorescencia para perfeccionar las técnicas de manipulación y disección antes de pasar al PLA. Para empezar, escoge de 30 a 40 gusanos adultos jóvenes en un plato de cristal de reloj que contenga 500 microlitros de 1x M9 y levamisol.Después de recoger los gusanos, retire y deseche cuidadosamente la mayoría de los medios para eliminar las bacterias que se transfieren junto con los gusanos. Añadir 500 microlitros frescos de 1x M9 y levamisol, y utilizar la pipeta para extraer y dispensar suavemente el medio para enjuagar los gusanos. Retire y deseche cuidadosamente la mayoría de los medios.Repita el lavado de dos a tres veces. Después de los lavados, deje los gusanos en unos 100 microlitros de medios durante no más de ocho minutos. Usando una pipeta de vidrio o polietileno, transfiera los gusanos a un portaobjetos de microscopio de 25 milímetros por 75 milímetros recubierto con 001%poli-L-lisina.Retire el exceso de medios para que permanezcan aproximadamente 15 microlitros de medios en la diapositiva. La eliminación del exceso de búfer es fundamental para garantizar que los gusanos diseccionados y las gónadas se adhieran a la diapositiva. Bajo un microscopio de disección, con dos agujas de calibre 26 de 1/2, coloque una aguja sobre la otra para que los extremos formen un par de tijeras.Usando las agujas orientadas de esta manera, cortar los gusanos detrás de la faringe para liberar las líneas germinales. Disecciona todos los gusanos en cinco minutos. Después de diseccionar todos los gusanos, coloque suavemente un cubreobjetos de 22 milímetros por 40 milímetros sobre la diapositiva para que sea perpendicular a la diapositiva.Los extremos del cubreobjetos deben colgarse de la corredera. Congele los portaobjetos en un bloque de aluminio pre-refrigerado mantenido sobre hielo seco durante al menos 20 minutos. Coloque suavemente un lápiz frío en la parte superior del cubreobjetos para evitar que el cubreobjeto se afloje debido a la expansión del hielo.Cuando esté listo para la fijación, deslice los cubreobjetos con un lápiz e inmediatamente sumerja la diapositiva en un frasco que contenga metanol fresco y helado durante un minuto. A continuación, limpie suavemente los bordes de la diapositiva que rodea la muestra y aplique 150 microlitros de fijador de formaldehído a temperatura ambiente para fijar durante cinco minutos. Toque la diapositiva en una toalla de papel en un ángulo perpendicular de 90 grados para dejar que el fijador se salga de la diapositiva y absorberlo en la toalla de papel.Bloquee los portaobjetos dos veces durante 15 minutos a temperatura ambiente en un frasco de Coplin con 50 mililitros de PBT/BSA. A continuación, bloquee los portaobjetos con una solución PBT/BSA que contenga un 10% de suero de cabra normal. Limpie suavemente los bordes que rodean la diapositiva y aplique 100 microlitros de la solución a cada diapositiva.Y agitar suavemente la diapositiva para ayudar a extender la solución. Incubar durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que la solución se escale y limpie suavemente los bordes.Para bloquear las diapositivas, aplique una gota del reactivo de bloqueo al espacio de 14 milímetros por 14 milímetros. Incubar los toboganes durante una hora a 37 grados centígrados en una cámara húmeda. Coloque las diapositivas en una toalla de papel para dejar que el reactivo de bloqueo salga corriendo de la diapositiva y limpie suavemente los bordes.Utilice el diluyente de anticuerpos para diluir los anticuerpos primarios. Aplique 40 microlitros de la solución de anticuerpos primarios diluidos por espacio de 14 por 14 milímetros en las diapositivas. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.Por la mañana, lave los portaobjetos dos veces durante cinco minutos, cada uno con 50 mililitros de 1x tampón de lavado A a temperatura ambiente en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital establecido en 60 rpm. Coloque las diapositivas en una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se escalda de la diapositiva y limpie suavemente los bordes.Prepare una solución de 40 microlitros que contenga sondas más y menos. Agregue la solución a cada espacio de 14 por 14 milímetros. Incubar los toboganes en una cámara húmeda durante una hora a 37 grados centígrados.Lave los portaobjetos dos veces durante cinco minutos cada uno con 50 mililitros de 1x tampón de lavado A a temperatura ambiente en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital establecido en 60 rpm. Diluir el buffer de ligadura uno a cinco con agua ultrapura.Utilice este búfer para diluir la ligasa de uno a 40 para preparar un stock de trabajo de solución de ligadura. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se salga de los lados y limpie suavemente los bordes. Agregue 40 microlitros de la solución de ligadura a cada espacio de 14 por 14 milímetros.Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de lavar y secar los portaobjetos como se describió anteriormente, agregue 40 microlitros de solución de amplificación recién preparada, protegidos de la luz, a cada espacio de 14 por 14 milímetros. Incubar los toboganes en la cámara húmeda y oscura durante una hora y 40 minutos a 37 grados centígrados.Lave los portaobjetos dos veces durante 10 minutos cada uno con 50 mililitros de tampón de lavado B, y lave las diapositivas una vez durante un minuto con 50 mililitros de tampón de lavado 01x B.Después de secar el perímetro recubierto de epoxi de la corredera, agregue 10 microlitros de montaje medio a cada muestra y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior, lo que permite que el medio de montaje se extienda. Pinta alrededor del borde del cubreobjetos con esmalte de uñas para sellar el cubreobjetos y deslizarlo. Evite mover las cubiertas.Deje que el esmalte de uñas se endurezca durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. La co-inmunostaining de las líneas germinales con anticuerpos FLAG y GFP reveló su patrón de expresión en la línea germinal. Mientras que la GFP se expresaba a lo largo de la línea germinal, la expresión OMA-1:GFP se limitaba al paquiteno tardío y a los ovocitos.La inmunostaining FLAG muestra que 3xFLAG:DLC-1 se expresó a través de la línea germinal en ambas cepas. La región de interés para la cuantificación del PLA en la línea germinal abarcó el paquiteno tardío a través de los ovocitos en todas las líneas germinales. Esta es la región de la expresión OMA-1.3xFLAG:DLC-1, OMA-1:Las líneas germinales GFP parecían tener una mayor cantidad de focos PLA dentro de esta región en comparación con las líneas germinales 3xFLAG:DLC-1, GFP. Asegúrese de que haya suficiente agua para elevar la humedad en la cámara. Además, asegúrese de que los portaobjetos estén nivelados dentro de la cámara para evitar la escorrentía de reactivos.Tras el ensayo de ligadura de proximidad, las gónadas extruidas se pueden ver en un microscopio confocal y cuantificarse utilizando el flujo de trabajo de Fiji, ImageJ. Esta cuantificación puede ayudar a determinar si la interacción es estadísticamente significativa. PLA nos permitió evaluar las interacciones in situ entre los reguladores críticos del desarrollo de la línea germinal de los nematodos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describe un método sensible para identificar a los reguladores postembrionario de expresión de la proteína y su localización...

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

Este video demuestra la visualización de las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular (NMJ) de Drosophila utilizando el Ensayo de Ligadura de Proximidad (PLA). Después de aislar las paredes del cuerpo, las proteínas que interactúan se prueban con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con PLA. La proximidad de las proteínas que interactúan facilita la ligadura de las sondas con oligonucleótidos conectores, formando ADN circular, que luego se amplifica...

Detección de interacciones proteína-proteína en larvas de Drosophila mediante un ensayo de ligadura de proximidad

Este protocolo demuestra cómo la proximidad Ligadura ensayo se puede usar para detectar in situ en las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular Drosophila larval. Con esta técnica, los discos grandes y Hu-li shao tai se muestra para formar un complejo en la región postsináptica, una asociación identificado previamente a través de co-inmunoprecipitación.

Detección de In Situ Complejos proteína-proteína en la Drosophila Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Reportamos un procedimiento conciso de hibridación fluorescente in situ (FISH) en la gónada y embriones de Caenorhabditis elegans para observar y cuantificar secuencias repetitivas. Observamos y cuantificamos con éxito dos secuencias repetitivas diferentes, las repeticiones de telómeros y la plantilla de alargamiento alternativo de telómeros (TALT).

La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH) con sondas de PNA en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Se presenta un método basado en la formación de imágenes de inmunofluorescencia para la localización espacial y temporal de ERK activa en la C. diseccionado gónadas elegans. El protocolo aquí descrito se puede adaptar para la visualización de cualquier señalización o la proteína estructural en la C. elegans gónada, proporciona un reactivo de anticuerpo adecuado está disponible.

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a detectar interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans mediante el ensayo de ligadura de proximidad. Esta técnica revela patrones espaciales y temporales con sensibilidad comparable a FRET.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (Video) | JoVE Journal

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

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