Name: Optimización del cultivo organoide renal y organatípico para la vascularización, el desarrollo extendido y la imagen mejorada de microscopía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprende a optimizar el cultivo organoide renal usando membrana corioalantoica de embrión de pollo para mejorar la vascularización y permitir imagen de alta resolución. Este método aumenta la supervivencia de los rudimentos renales.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la Suomen Akatemia (Academia de Finlandia) (206038, 121647, 250900, 260056; El Centro de Excelencia concede 2012-2017 251314), Munuaiss-tiá - Asociación Finlandesa de Riñón y Hígado, la Sigrid Juseliuksen Sáti, Victoriastiftelsen, La Fundación Cultural Sueca en Finlandia, Novo Nordisk, Sy-P-j-rjest-t (Sociedad del Cáncer de Finlandia), el Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7/2007-2013; conceder FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) y H2020 Marie Sklodowska-Curie Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 642937. Los autores agradecen la asistencia técnica de Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias y Hannele H'rkman.
Las figuras 3, 4 y 2 se reimprimen con el permiso de Desarrollo.

El cuidado y los procedimientos de los animales se ajustaron a la legislación nacional finlandesa para el uso de animales de laboratorio, al Convenio Europeo para la protección de los animales vertebrados utilizados con fines experimentales y otros fines científicos (ETS 123) y a la Directiva 86/609/CEE de la UE.
1. Fabricación de minidepósitos para el cultivo de riñones embrionarios de ratón y organoides renales en CAM de pollo y la creación de experimentos de xenotrasplante
<ol><li>Utilice plaquitas de cultivo de células transwell diseñadas para 6 placas de pozo o 12 pocillos. NOTA: Dependiendo del experimento en particular, se pueden utilizar minidepósitos grandes o pequeños. Lo mejor es utilizar pequeños minidepósitos para xenografting hasta ocho riñones embrionarios o cuando se colocarán varios minidepósitos en el mismo embrión de pollo (por ejemplo, muestras de experimento y control en el mismo CAM de pollo).</li>
	<li>Corte los lados de las plaquitas utilizando una multiherramienta giratoria con una hoja de sierra circular o una sierra de mano para crear un anillo de plástico de 2 mm de alto con una membrana permeable unida a ella.</li>
	<li>Pulir los bordes de estos minidepósitos con un bisturí o un cuchillo afilado.</li>
	<li>Esterilice los minidepósitos en etanol al 70% durante al menos 1 h.</li>
	<li>Lave los minidepósitos en agua autoclave de doble destilación y déjelos secar en una campana laminar.</li>
	<li>Enjuague los minidepósitos en PBS y medio de cultivo (DMEM de alta glucosa/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina).</li>
	<li>Coloque el depósito en una placa de Petri, encima de una gota (600 l/400 l) de medio de cultivo con la membrana hacia arriba.</li>
	<li>Organizar los riñones embrionarios ex vivo diseccionados o organoides renales uniformemente en la membrana con la ayuda de una pipeta o un tubo capilar de vidrio. Evite dejar mucho líquido alrededor de los riñones.</li>
	<li>Dejar que las muestras se adhieran a la membrana durante 2-24 h en una incubadora de cultivo celular a 37 oC y 5% CO2. NOTA: Se pueden organizar hasta ocho riñones de ratón embrionarios E11.5 o organoides renales en el pequeño inserto. El inserto grande se recomienda si se utilizarán trozos más grandes de tejido embrionario para el xenotrasplante o una mezcla de células y hidrogeles en un área más grande de la CAM.</li>
	<li>Tome pollos embrionarios cultivados ex ovo de 8 días de edad preparados de acuerdo con métodos publicados previamente de la incubadora de cultivo celular12,13.</li>
	<li>Transfiera los minidepósitos al CAM para que los injertos estén frente al CAM, y la membrana los superponga. Coloque los minidepósitos en la periferia de la CAM, para que no cubran el embrión de pollo. NOTA: Cuando se utilizan los minidepósitos más pequeños fabricados a partir de plaquitas transwell para 12 placas de pozo, se pueden colocar hasta tres minidepósitos en un CAM.</li>
	<li>Añadir 500 l (6 plaquitas de pozo) o 300 l (12 plaquitas de pozo) de medio de cultivo a los minidepósitos.</li>
	<li>Cultivar las muestras en pollo CAM durante un máximo de 9 días. Sustituya diariamente el medio de cultivo en los minidepósitos. NOTA: La vascularización de las muestras se puede observar tan pronto como 24–48 h después del trasplante.</li>
</ol>2. Fabricación de placas diseñadas a medida y configuración de cultivos FiZD
<ol><li>Taladre agujeros de 20 mm de diámetro en la parte inferior de una placa de 6 pozos. NOTA: Para experimentos FiZD, utilice 6 placas de pozo con una profundidad de pozo de 16 mm (especificada en Tabla de materiales).</li>
	<li>Pulir las llantas de los agujeros (especialmente en la parte superior) utilizando un taladro eléctrico con una broca de avellanado, un bisturí o un cuchillo afilado.</li>
	<li>Esterilice las placas en 70% de etanol durante al menos 1 h.</li>
	<li>Lave las placas en agua autoclave de doble destilación y déjelas secar en condiciones estériles.</li>
	<li>Lavar a fondo los revestimientos de vidrio de 22 mm x 22 mm con 70% de etanol o limpiarlos de acuerdo con el protocolo publicado por Saarela et al.11.</li>
	<li>Pegue los cubreobjetos en la parte superior de los agujeros en 6 placas de pozo utilizando un pegamento de tejido no tóxico. Aplique pegamento alrededor del orificio y coloque suavemente el cubreobjetos para cubrirlo. Deje que el pegamento se seque.</li>
	<li>Inspeccione las placas bajo un estereomicroscopio y retire el exceso de pegamento seco de la superficie de los labios de las cubiertas si es necesario. NOTA: Compruebe que no haya pegamento por encima de la cubierta para garantizar una compresión uniforme de las muestras.</li>
	<li>Mezclar perlas de poliestireno (tamaño de partícula de 70 m) con un volumen igual de hidrogel. Un volumen de 50–100 l por pocto es suficiente. NOTA: Mantenga la mezcla de hilagey y perlas de poliestireno en hielo.</li>
	<li>Coloque un inserto transwell bajo un microscopio de disección con la membrana hacia arriba.</li>
	<li>Organizar las muestras (p. ej., riñones embrionarios ex vivo o organoides renales) uniformemente en la membrana.</li>
	<li>Agregue cuidadosamente la mezcla de perlas de hidrogel/poliestireno junto a las muestras para evitar daños en tejidos frágiles.</li>
	<li>Voltear el inserto transwell para que la membrana con las muestras ensambladas en ella esté mirando hacia abajo.</li>
	<li>Coloque suavemente el inserto en un pozo de la placa de 6 pocillos modificada y presione suavemente hacia abajo para que las muestras se compriman al nivel de las cuentas. NOTA: Siga el progreso de la compresión utilizando un microscopio.</li>
	<li>Mantenga la plaquita ligeramente prensada al pozo con una mano y fíjela a la placa fundiendo plástico con un soldador en tres puntos en la periferia de la plaquita.</li>
	<li>Cuando la plaquita esté fijada a la placa, añada 2 ml de medio de cultivo (DMEM/10% FBS/1% penicilina-estreptomicina) al pozo y continúe montando los pozos restantes en la placa de la misma manera.</li>
	<li>Transfiera la placa terminada a una incubadora en el escenario de un microscopio invertido para obtener imágenes de lapso de tiempo.</li>
	<li>Realice imágenes de lapso de tiempo de las muestras utilizando los ajustes experimentales adecuados. NOTA: No es necesario cambiar el medio de cultivo en los pocillos de la placa durante los experimentos de lapso de tiempo, pero se puede hacer fácilmente a través de los orificios en los lados de la plaquita.</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se presentan dos protocolos detallados que refinan el método clásico de cultivo organotípico renal y permiten la vascularización, el desarrollo prolongado y la imagen y el tiempo óptimos en 4D (es decir, imagen 3D y tiempo) de riñones embrionarios ex vivo y organoides. Esta sección resalta los pasos críticos en los métodos y discute la solución de problemas.
La diferencia significativa entre otros métodos de cultivo CAM y este método de cultivo CAM de pollo mejorado es el uso de minidepósitos ...

El cultivo organotípico de los riñones embrionarios se convirtió en un modelo importante para estudiar la nefrogénesis hace décadas1,2,3. Los organoides renales representan un sistema modelo avanzado para el desarrollo de riñones sanos y enfermos4. El principal inconveniente para ambos métodos, sin embargo, es que ninguno de los dos métodos recapitula la función principal del riñón: la filtración de sangre. Las nefronas y la vasculatura renal se desarrollan en organoides renales y cultivos organotípicos de forma similar al desarrollo in vivo en etapa temprana; sin embargo, los glomérulos formados in vitro permanecen avasculares5. La vascularización de los riñones embrionarios ex vivo y los organoides renales se demostró previamente en experimentos de trasplante solo en condiciones in vivo. Por ejemplo, el trasplante de organoides renales pluripotentes derivados de células madre humanas bajo una cápsula renal de ratón permite el desarrollo de las nefronas en el organoide a una etapa funcional6.
Un enfoque intermedio entre cultivos puramente in vitro y métodos de trasplante in vivo es el xenotrasplante a la CAM de embriones aviares. La vascularización de la primordia renal intacta se ha demostrado previamente utilizando este sistema7,8. Sin embargo, también se demostró que la vasculatura renal en el riñón murino xenotransplanted se deriva del endotelio huésped, no del injerto9. Esta observación redujo significativamente el potencial de los modelos quiméricos (aviares-mamíferos) de riñón embrionario para estudiar el desarrollo de la vasculatura renal, porque las condiciones experimentales no eran permisivas para la supervivencia de las células endoteliales derivadas de donantes.
En la primera parte de este protocolo se presenta un método mejorado para el cultivo de riñones embrionarios de ratón en CAM de huevos aviares, combinando condiciones microambientales de cultivo organotípico y xenotrasplante. La principal mejora de los métodos anteriores es que en lugar de colocar los riñones embrionarios de ratón y los organoides renales directamente en el CAM, el área de implantación se superpone con minidepósitos permeables llenos de medio de cultivo que suministran el tejido trasplantado con nutrientes y protegerlo del secado. La tasa de éxito de los experimentos aumenta significativamente y las condiciones para el desarrollo de la vasculatura derivada de donantes mejoran. La aplicación de este método a los cultivos xenotrasplantes da como resultado el desarrollo de vasculatura glomerular compuesta por células endoteliales endógenas de los riñones de los donantes.
El análisis detallado de la morfogénesis celular es otra aplicación importante de los modelos de cultivo renal. Los métodos notificados anteriormente de adquisición de imágenes de lapso de tiempo de cultivos renales son suficientes sólo para el análisis de la morfología general y el patrón del riñón embrionario, pero no para el seguimiento de células individuales10. Recientemente, se describió11un nuevo método de Dirección Z Fija (FiZD) destinado a la toma de imágenes de lapso de tiempo 3D confocales de alta resolución de organoides renales y cultivos organotípicos organotípicos. En este método, los organoides y los órganos embrionarios se comprimen suavemente entre un tapón de vidrio y una membrana permeable de un inserto transpoente en una placa diseñada a medida hasta que el espesor de la muestra alcanza los 70 m, proporcionando condiciones ópticas óptimas para la toma de imágenes. En la segunda parte de los métodos, se describe un protocolo detallado para la fabricación de una placa diseñada a medida y la configuración de experimentos FiZD para imágenes organoides a largo plazo.

<table><tbody><tr><td>Broca de pala ajustable</td><td>Bosch</td><td>2609255277</td><td>Para perforar agujeros de 20 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Volteador automático de huevos</td><td>OLBA B.V., Países Bajos</td><td>AT-42</td><td>Para la incubación de huevos antes de la configuración ex ovo.</td></tr><tr><td>Incubadora de células</td><td>Panasonic</td><td>13090543</td><td>Temperatura ajustada a 37 grados; C, 90% de humedad, 5% de CO2</td></tr><tr><td>Cell Incubadora</td> de cultivo <td>CAN-CAM de SANYO</td><td>10070347</td><td>Chicken. Temperatura ajustada a 37 grados; C, 90% de humedad, 5% de CO2</td></tr><tr><td>Cellstar Placa de 6 pocillos</td><td>Greiner</td><td>M9062</td><td>16 mm de profundidad de pocillos para que coincida con los insertos</td></tr><tr><td>Hoja de sierra circular para herramienta rotativa Dremel</td><td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Placa de pocillos múltiples con insertos de membrana de policarbonato permeable</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>Para placas de 6 pocillos. 40 y micro; Tamaño de poro m</td></tr><tr><td>Broca avellanadora</td><td>Craftomat, Bauhaus</td><td>22377902</td><td>Para pulir (20,5 mm, 1/4", HSS)</td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio desechable</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí desechable</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Taladradora</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-EC </td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma</td><td>D777</td><td>Incubadora de huevos con alto contenido de glucosa</td></tr><tr><td>Compact S84</td><td>Grumbach, Alemania</td><td>8012</td><td>Para la incubación de huevos antes de la configuración ex ovo. Temperatura ajustada a 38 grados; C con humedad relativa superior al 60%</td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td>Huevos fertilizados <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finlandia</td><td></td><td>Hy-Line White y Nick Chick</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Pinzas Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>DUMONT #5</td><td>Dumont</td><td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>Fundas de vidrio</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>Histoacryl Glue</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora en el escenario</td><td>Okolab</td><td></td><td>Boldline, a medida</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>Lavado de los mini depósitos.</td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de poliestireno</td><td>corpusculares</td><td>1000263-10</td><td>70 &micro; m de diámetro</td></tr><tr><td>Sistema rotativo multiherramienta</td><td>Dremel</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td>Soldador</td><td>Weller</td><td>TCP S</td><td>También se puede utilizar capilar de vidrio calentado</td></tr><tr><td>Thincert de 12 pocillos Insertos de cultivo celular con 0,4 y micro; membrana de poliestireno m-pore</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert insertos de cultivo celular de 6 pocillos con 0,4 y micro; membrana de poliestireno m-pore</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

optimización del cultivo organoide renal y organatípico para la vascularización, el desarrollo extendido y la imagen mejorada de microscopía

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Los cultivos organotípicos renales embrionarios, y especialmente los organoides renales derivados de células madre pluripotentes, son excelentes herramientas para seguir los procesos de desarrollo y modelar la enfermedad renal. Sin embargo, los modelos están limitados por la falta de vascularización y funcionalidad. Para abordar esto, se desarrolló un protocolo mejorado para el método de xenografting células y tejidos a la membrana corioalantoica (CAM) de un embrión aviar para obtener vascularización y restauración del flujo sanguíneo. Los injertos están superpuestos con minidepósitos hechos a medida que fijan las muestras al CAM y les suministran un medio de cultivo que protege los injertos del secado. El método de cultivo mejorado permite que los xenoinjertos crezcan hasta 9 días. El manuscrito también describe cómo proporcionar condiciones óptimas para la toma de imágenes confocales a largo plazo de organoides renales y cultivos organotípicos utilizando el método de dirección Z fija (FiZD) publicado anteriormente. Este método comprime suavemente un órgano embrionario o un organoide entre un revestimiento de vidrio y una membrana en una gran cantidad de medio y proporciona excelentes condiciones para la toma de imágenes durante un máximo de 12 días. Juntos, estos métodos permiten la vascularización y el flujo sanguíneo a organoides renales y cultivos renales organotípicos con imágenes confocales mejoradas. Los métodos descritos aquí son altamente beneficiosos para el estudio de las funciones fundamentales y aplicadas de los riñones ex vivo. Ambos métodos son aplicables a varios tipos de tejidos y organoides.

El protocolo de cultivo CAM presentado aquí permitió la vascularización altamente eficiente de organoides renales y riñones embrionarios como resultado del xenotrasplante en el pollo CAM(Figura 1, Película 1). Los minidepósitos que contenían un medio de cultivo suministraban nutrientes al tejido del donante y lo protegían del secado durante el período anterior a la vascularización adecuada. Este método proporcionó condiciones permisivas para que las células endoteliales deri...

Este trabajo describe dos métodos para estudiar el desarrollo de órganos, una mejor configuración de xenotrasplante en la membrana corioalantoica (CAM) a partir de embriones aviares que permite la vascularización de órganos embrionarios y organoides cultivados y una nueva dirección z fija método de cultivo de órganos con condiciones experimentales modificadas que permite imágenes confocales de lapso de tiempo de alta resolución.

Optimización del cultivo organoide renal y organatípico para la vascularización, el desarrollo extendido y la imagen mejorada de microscopía

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

El cultivo de órganos renales y los orgánulos que se derivan de células madre programadas proporcionan excelentes maneras de estudiar los mecanismos detrás del desarrollo renal y la enfermedad. Sin embargo, el sistema de cultivo de órganos actual no proporciona flujo sanguíneo al riñón. Debido a esto, razón por la que los modelos actuales están incompletos y no recapitulan la función principal del riñón, que es la filtración de sangre.En esta publicación, presentamos un protocolo mejorado para el cultivo y visualización de riñones embrionarios y organoides en la membrana chorioalantoica del embrión de pollo. En nuestra novedosa configuración experimental, superponemos los rudimentos renales trasplantados en CAM con reservorios de significado permeable que están llenos de medio de cultivo. Este protocolo aumenta significativamente la supervivencia de los rudimentos renales y también las células endoteliales intrínsecas.El método permite el flujo sanguíneo al glomérulo en desarrollo. Recientemente publicamos también un novedoso método de cultivo de órganos de dirección fija que ofrece imágenes de lapso de tiempo 3D confocal de alta resolución. El método proporcionó condiciones óptimas para la toma de imágenes confocales a largo plazo de los organoides y rudimentos de órganos.En el enfoque, comprimimos suavemente el tejido entre un resbalón de cubierta de vidrio y una membrana permeable. Aquí mostramos cómo se hacen las placas diseñadas a medida y cómo se configuran los experimentos de cultivo. Así, en esta publicación presentamos una técnica mejorada de cultivo de tubos de orgánulo renal.Este método ofrece una mejor manera de modelar la génesis del orgánulo y realizar imágenes de alta resolución para estudiar los riñones embrionarios y los organoides renales ex vivo. Dependiendo de su experimento, tome contra-inserciones de celda de transferencia diseñadas para placas de seis o 12 pozos. Corte los lados de la plaquita utilizando una herramienta Dremel para crear un anillo de plástico de dos milímetros de alto con una membrana permeable unida a él.Pulir los bordes del anillo de swarf con un bisturí o un cuchillo afilado. Esterilice los mini reservorios en 70% etanol durante al menos una hora. A continuación, lave los mini depósitos en autoclave con agua destilada y séquelos en una campana laminar.Enjuague los mini reservorios en PBS y medio de cultivo. Coloque el depósito en un plato de petri encima de nuestra gota de medio de cultivo con la membrana mirando hacia arriba. Colocar riñones embrionarios ex vivo diseccionados o organoides renales en la membrana.Evite dejar mucho líquido alrededor de las muestras y déjelas unidas de dos a 24 horas en una incubadora de cultivo celular. El trasplante de exención se realiza a la membrana corioalantoica de pollo embrionario ex ovo de ocho días de edad. Transfiera los mini reservorios para que la membrana cubra el injerto.Colóquelos en la periferia de la CAM para que no cubran el embrión. A continuación, añada un medio de cultivo a los mini reservorios. Cultivar las muestras en el cam de pollo durante nueve días como máximo.Sustituya el medio de cultivo en los mini reservorios diariamente. La vascularización de las muestras ya se puede observar de 24 a 48 horas después del trasplante. Para hacer las placas de seis pozos diseñadas a medida para el cultivo fijo.Es necesario comenzar perforando agujeros de 20 milímetros en la parte inferior de la placa utilizando una máquina de perforación con una broca adecuada. A continuación, pula las llantas de los orificios en la parte superior de la placa. Finalmente, esterilizar las placas en 70%etanol durante al menos una hora.A continuación, lave las placas en el autoclave con agua destilada y séquelas en la capucha lemiar. Lave los resbalones de cubierta de 22x22 milímetros en 70% etanol y déjelos secar por completo. Pegue el resbalón de la cubierta en la parte superior de un agujero en la parte inferior de un pozo usando pegamento de tejido.Después del secado, inspeccione las placas bajo un microscopio estéril y retire el exceso de pegamento. En primer lugar, mezclar una alícuota de cuentas de poliestireno con un volumen igual de hidrógeno. Coloque el inserto de transbordo debajo de un microscopio diseccionado con la membrana hacia arriba y coloque los riñones en la membrana.Agregue una gota de mezcla de perlas de hidro-gel junto a los riñones cuidadosamente. Voltee el inserto transfill para que la membrana y los riñones estén mirando hacia abajo. A continuación, coloque cuidadosamente el inserto en nuestro pozo de placa de seis pozos diseñada a medida.Empuje el inserto muy suavemente en el pozo. Siga el grado de aplanamiento desde el microscopio hasta que el riñón esté al nivel de las cuentas. Mantenga el inserto ligeramente presionado al pozo con una mano y fijarlo a la placa fundiendo plástico en tres puntos en la periferia de la plaquita con un soldador.Añadir dos mililitros de cultivo medio en el pozo a través de una abertura en el lado. Al iniciar una toma de imágenes de lapso de tiempo, transfiera la placa a la incubadora en el escenario de un microscopio invertido. Nuestro protocolo de captura CAM modificado permite una vascularización altamente eficiente de organoides renales y riñones embrionarios.Muchos reservorios que contienen un medio de cultivo suministran tejido de donante y lo protegen del secado durante el período inicial de tiempo que procede del vascularizatón. Esta película muestra el flujo de células sanguíneas de pollo en un centro renal de ratón embrionario injertado en CAM de pollo y cultivado durante siete días. Este panel de figuras muestra que nuestro método de cultivo CAM mejorado proporciona condiciones permisivas para las células endoteliales derivadas renales.Las figuras A y B muestran riñones embrionarios cultivados durante cinco días en días de cultivo de intervalo fueron injertados en el centro a CAM de pollo durante cinco días. La tinción con los anticuerpos CD-31 de los detalles del ratón muestra que la red celular endotelial del centro renal injertado en CAM es más extensa que en el control del lado izquierdo. En la figura C vemos que los vasos sanguíneos del ratón se tiñen con el anticuerpo CD-31 específico del ratón y eso es lo más con los vasos sanguíneos de pollo.Las figuras D y E muestran criocciones de riñones embrionarios de ratón cultivados en cultivo de viaje o CAM de pollo durante cinco días y manchados con CD-31 y Hoechst. La vasculatura de glomérulo es más madura en los riñones cultivados en CAM de pollo que en cultivos de control. La Figura F muestra un riñón embrionario de ratón cultivado en CAM de un pollo transgénico de la GFP durante siete días.Las células endoteliales de ratón están manchadas con anticuerpo CD-31 y podemos observar que la vasculatura en los riñones de ratón xenotrasplante es principalmente, pero no exclusivamente derivada del ratón. El novedoso cultivo de dirección fija permite el cultivo de riñones embrionarios y organoides en una distancia establecida restringida. En una cultura de viaje tradicional, los órganos cultivados se colocan en un filtro que se mantiene en una interfaz de medio aire por una rejilla de metal.Este método permite buenas condiciones para el desarrollo y crecimiento, pero no es óptimo para la toma de imágenes. En el cultivo de dirección fija, el órgano cultivado se presiona entre un fondo de vidrio de la placa y una membrana y el espesor de la misma es controlado por las cuentas de poliestireno que trabajan como espaciadores aquí. Los órganos en desarrollo se pueden visualizar directamente a través del cristal de la cubierta dando la visión mejorada del órgano.Este panel de figuras muestra que los riñones embrionarios y los organoides renales se pueden cultivar en el método de cultivo de dirección fija. Las imágenes de campo brillante de riñones embrionarios y organoides renales en el día siete muestran un desarrollo normal. En la figura C, la expresión GFB se ha activado en los nefronas en desarrollo de un organoide renal por la Figura D muestra un riñón con trauma una tinción en el cogollo eurétrico y seis dos manchas que marcan las células precursoras de nefronas.Las figuras E y F presentan el riñón del ratón cultivado durante 12 días. El trauma y la tinción de nefrona muestran el cogollo eurédico y los podoites. La película también presenta un riñón embrionario de MTMG, origen cree de Taiwán, donde la cree de Taiwán induce la expresión de GFB en las células endoteliales.Podemos ver que las células endoteliales renales están presentes en el riñón embrionario en desarrollo y la red endotelial también puede desarrollarse en el método de cultivo. En el panel de la derecha, se puede ver cómo las células endoteliales migran a la hendidura vascular de un nefrón en forma de S. Aquí hemos presentado el protocolo mejorado para el xenotrasplante de organoides renales y riñones embrionarios al pollo CAM.Este protocolo aumenta significativamente la supervivencia de los rudimentos renales y también sus células endoteliales intrínsecas. El método permite el flujo sanguíneo al glomérulo en desarrollo. El otro protocolo presentado aquí es el método de cultivo de órganos de dirección fija que mejora la calidad de la imagen y ayuda a estudiar la génesis del orgánulo a nivel de una sola célula.Las imágenes de alta resolución son adecuadas para la segmentación celular automatizada y el estudio basado en computadora del comportamiento celular en organoides renales y cultivos renales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video describe un método para estudiar el desarrollo de órganos utilizando una configuración mejorada de xenotrasplante en membrana corioalantoidea (CAM) de embriones aviares. Este método permite el desarrollo de órganos embrionarios y organoides cultivados completamente vascularizados.

Cultivo organotípico renal en CAM de pollo: una técnica para el trasplante de explantes de riñón murino en CAM de pollo para inducir la formación de arquitectura vascular renal

El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.

In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

Toda la estructura 3D y el contenido celular de los organoides, así como su parecido fenotípico con el tejido original se pueden capturar utilizando el protocolo de imágenes 3D de resolución de una sola célula descrito aquí. Este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de organoides que varían en origen, tamaño y forma.

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Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

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Generación de organoides renales en suspensión a partir de células madre pluripotentes inducidas

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Modelado de nicho neurovascular de organoides cerebrales humanos tempranos no guiados en la membrana corioalantoidea permisiva del embrión de pollo

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Generación de organoides vasculares a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

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Optimización del cultivo organoide renal y organatípico para la vascularización, el desarrollo extendido y la imagen mejorada de microscopía (Video) | JoVE Journal

Optimización del cultivo organoide renal y organatípico para la vascularización, el desarrollo extendido y la imagen mejorada de microscopía

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