Name: Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende el flujo de trabajo de xenoinjertos en peces cebra para cribado de fármacos con imágenes automatizadas. Este método permite evaluar rápidamente la respuesta de células cancerosas humanas derivadas del paciente a tratamientos oncológicos.

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Esta investigación fue apoyada por un V Foundation V Scholar Award y NIH Grants DP2CA228043, R01CA227656 (a J.S. Blackburn) y NIH Training Grant T32CA165990 (a M.G. Haney).

Todos los procedimientos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky (protocolo 2015-2225). Las muestras de pacientes fueron recogidas bajo la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Kentucky (protocolo 44672). Todos los experimentos con animales realizados siguiendo este protocolo deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del usuario.
1. Descongelar células de leucemia linfoblástica aguda del paciente primario
<ol><li>Descongelar las células mononucleares de sangre periférica del paciente primario (PPBCD) del stock congelado en un baño de agua de 37 oC. Inmediatamente después de que las células se hayan descongelado, transfiera las células en sus medios de congelación (90% FBS + 10% dimetil sulfóxido [DMSO]) a un tubo cónico de 15 ml con pipeteo lento, evitando burbujas de aire. Añadir 10 ml de medios de descongelación precalentados de 37 oC (25% de suero bovino fetal [FBS] en el medio modificado de Dulbecco de Iscove [IMDM]) con gota (aproximadamente 2 x 3 s por ml) a las células del tubo cónico de 15 ml. NOTA: Los PBL se recogieron de las muestras de sangre del paciente en el momento del diagnóstico. La capa buffy fue separada por centrifugación de densidad y las células fueron lavadas 2 veces en RPMI 1640 + 10% FBS. Se contaron las células y se congelaron 107 células por criovial en 1 ml de medio de congelación, y se almacenaban a -80 oC.</li>
	<li>Células centrífugas a 100 x g durante 10 min y aspirar medios del pellet celular. Repita la adición de medios de descongelación, centrifugación y aspiración una vez adicional para eliminar cualquier DMSO residual.</li>
	<li>Resuspenda las células en 5 ml de solución salina con fosfato (PBS) y retire 10 ml para contar con un contador de células automatizado o hemocitómetro. Añadir 10 sl de trippan azul a 10 s de celdas eliminadas para contar. Cuente el número de celdas por ml y registre para calcular posteriormente el volumen para resuspender celdas en xenografting (consulte el paso 2.5). NOTA: Típicamente, 500 células son xenoinjeradas por pez cebra larval. Por ejemplo, se necesitan 5 x 105 células para inyectar 1.000 peces cebra. La viabilidad debe ser >85% para usar para xenografting. En este experimento, la viabilidad celular fue del 96% después de la descongelación, evaluada por la tinción azul de trypan.</li>
</ol>2. Celdas fluorescentes de etiquetado con DiI
<ol><li>Centrifugar el número de celda deseado en 5 ml de PBS a 200 x g durante 5 min y aspirar sobrenadante. Mancha un mínimo de 2 x 106 células en caso de aglomeración o problemas para cargar la aguja durante la inyección.</li>
	<li>Hacer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocyanine solución de tinción (DiI) (5 ml de PBS que contiene 4 l por ml de mancha DiI, tabla de materiales) y resuspender el pellet celular en la solución de tinción. NOTA: La densidad celular no debe exceder 2 x 106 células/ml cuando se resuspende en la solución de tinción.</li>
	<li>Incubar las células a 37 oC protegidas de la luz durante 20 minutos, vórtice suavemente, luego incubar las células sobre hielo durante 15 minutos protegidas de la luz.</li>
	<li>Células centrífugas a 200 x g durante 5 min y sobrenadante aspirado. Lavar las células con 5 ml de PBS, centrifugar a 200 x g durante 5 min y aspirar sobrenadante. Repita el lavado, la centrifugación y la aspiración una vez más.</li>
	<li>Resuspenda las células en 1 l de PBS por cada 250.000 células vivas y transfiera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga las células resuspendidas sobre hielo en la oscuridad y continúe inmediatamente con las microinyecciones. NOTA: Esto garantiza que se inyecten 500 células de paciente en el pez cebra con cada bomba de inyección de 2 nL de volumen.</li>
</ol>3. Larvas de pez cebra microinyectars
NOTA: Las microinyecciones deben completarse dentro de 1 x 3 h de la tinción para mejorar la viabilidad de las células.
<ol><li>Antes de manchar las células y inyectar, haga placas de agarosa para inyectar vertiendo 25 ml de agarosa del 3% en 1x Tris/borate/EDTA (TBE) en una placa Petri y deje que se solidifique. Conservar las placas a 4oC durante un máximo de 2 semanas.</li>
	<li>También antes de la tinción de las células y la inyección, decorionada 2 dpf pez cebra usando fórceps bajo un microscopio de disección. Para la desboquenación manual, tire de los extremos opuestos del coro protector del pez cebra con fórceps hasta que las lágrimas de coro y el pez cebra se vuelvan sin envolver10. NOTA: La decorionación también se puede realizar mediante el tratamiento enzimático con pronasa, como se describió anteriormente10. Casper (roy-/-;nacre-/-) se utilizaron peces cebra para estos experimentos11. Cualquier cepa larvario de pez cebra se puede utilizar para la xenografting. Si el pigmento interfiere con la imagen o la visualización, se puede utilizar el tratamiento con propiltiouracilo (PTU) para bloquear la síntesis de melanina si no se dispone de cepas de pez cebra ópticamente claras12.</li>
	<li>Prechill agujas a 4 oC o sobre hielo para evitar aglutinar las células durante la microinyección. Cargue 5 l de células manchadas en una aguja de vidrio de borosilicato no filamentoso refrigerada con puntas de pipeta de microcargador. NOTA: Los métodos de configuración de microinyectores y agujas se han publicado previamente13.</li>
	<li>Cargue la aguja en el brazo del microinyector. Bisele la punta de la aguja con una cuchilla de afeitar estéril. Mida el tamaño de las gotas en aceite mineral utilizando un micrómetro de etapa, manteniendo el volumen de las gotas de forma consistente en 2 nL (0,15 mm de diámetro) en todo el momento.</li>
	<li>Utilice 350 ml de 4 mg/ml de tricaína-S para anestesiar el pez cebra de s3 desconforionizado de 2 dpf en una placa de Petri que contenga 25 ml de medios E3. Después de 1 minuto de transferencia de larvas anestesiadas a una placa de inyección de superficie plana (3% agarosa en una placa de Petri) e inyectar larvas con una bomba de células manchadas en el lugar de inyección deseado (por ejemplo, la yema o el pericardio; ver Figura 2A,B). NOTA: El lugar de inyección debe elegirse en función del objetivo del experimento. El lugar de inyección más común es la yema. Para obtener células que circulan en el torrente sanguíneo, el pericardio, el conducto de Cuvier, el espacio periviellina o el espacio retro-orbital se pueden utilizar como sitios de inyección. También se pueden utilizar sitios de inyección ortotópica, como el cerebro.</li>
	<li>Lave las larvas de la placa de inyección en una placa de 10 cm2 Petri (30 larvas por placa) que contenga E3 media14 sin azul de metileno e incubar a 28 oC durante un período de recuperación de 1 h. Continúe inyectando hasta que se haya inyectado un número deseado de larvas. NOTA: Idealmente, inyectar 2 x 2,5 veces el número de larvas necesarias para los experimentos. Habrá alguna sesión de muerte de larvas debido al estrés de la inyección y el aumento de la temperatura de incubación. Típicamente, después de la práctica con la técnica, 800-1.500 larvas de pez cebra pueden ser inyectadas por una sola persona dentro de la 1 a 3 h cuando se deben inyectar células manchadas.</li>
	<li>Mover las placas de las larvas inyectadas a una incubadora de 34oC. No coloque los platos Petri de larvas directamente sobre una plataforma metálica en la incubadora para evitar el sobrecalentamiento del agua E3. Por ejemplo, coloque un plato petri vacío entre el estante y el plato Petri de larvas para actuar como un tampón. Retire las larvas de pez cebra muertas después de 24 y 48 horas después de la inyección (hpi).</li>
</ol>4. Configuración de la pantalla de drogas con peces cebra xenoinjerados
<ol><li>
A 48 hpi, examina las larvas de peces cebra para detectar fluorescencia/injerto tumoral y salud(Figura 2C,D). Retire cualquier pez cebra muerto o malformado y seleccione el pez cebra con injerto similar(Figura 2C,D, 1-3 y 1'-3'). Retire el pez cebra sin injertar(Figura 2C,D, 5 y 5').
	<ol>
<li>En el caso de los peces inyectados en yema, retire los peces donde no se puedan ver los bordes de la yema alrededor de la masa celular injertada(Figura 2C, 4) ya que dificulta la cuantificación. En el caso del pericardio inyectado, retire el pescado en el que la masa celular inyectada invada el saco de yema(Figura 2D,4').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agregue el pez cebra a un plato de 96 pocillos. Para ello, corte la punta de una punta de pipeta de 200 ml, lo suficientemente grande como para que un pez cebra de 4 dpf se ajuste. Aspirar 150 l de medios E3 con un pez cebra de la placa usando una pipeta P200, y añadir a un pozo vacío de una placa de fondo plano de 96 pocillos.</li>
	<li>Diluir el medicamento a probar en el volumen requerido de medios E3, a 150 l por pocido. Preparar el medicamento a 2 veces la concentración deseada. Por ejemplo, prepare 20 m de fármaco en E3 si la concentración final deseada es de 10 m, ya que la mitad del volumen total en cada pozo se compone de la solución del medicamento. Para el grupo de control DMSO, agregue DMSO al mismo volumen que el medicamento.</li>
	<li>Añadir 150 l de solución de fármaco diluido a cada pocal que contenga larvas de pez cebra en 150 l de E3, para un volumen final de 300 l con 1 solución de fármaco por poca.</li>
	<li>Incubar la placa a 34oC. Compruebe si hay peces cebra muertos todos los días. Después de 2 días, si se desea, refrescar el medicamento mediante la eliminación de 200 l de líquido de cada pozo de la placa de 96 pocillos y reemplazar con 200 l de 1x solución de fármaco diluido o DMSO en medios E3. NOTA: Los mejores resultados se encontraron después de 3 días de tratamiento farmacológico para este experimento; sin embargo, la duración del tratamiento farmacológico puede variar entre 2 y 4 días y puede ser necesario optimizar en función del experimento que se está haciendo o drogas que se utilizan.</li>
</ol>5. Imágenes de peces cebra xenoinjerados mediante una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de muestreador automatizada
<ol><li>Preparar 1 L de triaína fresca de 4 mg/ml y 1,5 L de medios E3. Llene la botella de medios 1 con e3 media y media bottle 2 con tricaína.</li>
	<li>Elimine todos los canales fluorescentes no deseados en el software de imágenes y agregue el canal deseado (DiI para este experimento). Compruebe el canal fluorescente deseado, ya que solo se tomará una imagen para los canales con una marca de verificación. Además, seleccione cómo se tomarán las imágenes (pilas z, automatización, bucles en serie, etc.). NOTA: Para este experimento, el enfoque se estableció manualmente para cada pez de la imagen para obtener el mayor número de imágenes con un enfoque óptimo.</li>
	<li>Imagen del pez de control DMSO antes de los peces tratados con drogas para que se pueda establecer el tiempo de exposición adecuado en el software de imágenes. Una vez establecida la exposición, no cambie el tiempo de exposición durante la duración del experimento. NOTA: El enfoque se puede ajustar manualmente para cada pez cebra para asegurarse de que no hay imágenes fuera de foco, o para imágenes totalmente automatizadas, el mismo enfoque se puede utilizar entre peces con imágenes fuera de foco que se descartan o peces reimaged antes de realizar el análisis. Además, este experimento podría llevarse a cabo utilizando cualquier imagen fluorescente seguida de cuantificación de la fluorescencia utilizando el software ImageJ.</li>
</ol>6. Cuantificación de la fluorescencia con ImageJ
<ol><li>Abra el software ImageJ.</li>
	<li>
Ir a Archivo ? Abra y seleccione el archivo .czi deseado. El software mostrará una ventana de opciones de importación.
	<ol>
<li>Para la visualización de la pila, seleccione Hyperstacks, seleccione Abrir archivos individualmente, seleccione Escalado automáticoy seleccione Dividir canales. Para la opción de color, seleccione Colorizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haga clic en Plugins (Plugins) Macros de la página de macros de la Grabar.</li>
	<li>Haga clic en Imagen ( Image) Ajustar ? Umbral. Seleccione el tipo de imagen como rojo en el menú desplegable en el lado derecho de la ventana de umbral. Ajuste el umbral mínimo hasta que el software solo resalte áreas con fluorescencia(Figura 3A)y haga clic en Aplicar. El software convertirá la foto a blanco y negro, con el área seleccionada en negro. NOTA: Utilice el mismo umbral para cada imagen en la pantalla de drogas para mantener los resultados estandarizados y comparables.</li>
	<li>Haga clic en Analizar (Analizar) Medir. El software abrirá una ventana de resultados que contiene el área fluorescente para esa imagen.</li>
	<li>Haga clic en Crear en la ventana Grabadora de macros. Esto abrirá una nueva ventana con el código de la macro. Resalte todas las imágenes deseadas para el análisis y ábralas como en el paso 6.2.</li>
	<li>Seleccione Ejecutar en la ventana con la macro. La ventana de resultados ahora contendrá el área de cada imagen. NOTA: El análisis de imagen se puede realizar individualmente sin grabar y ejecutar una macro, así como repitiendo los pasos anteriores para cada imagen.</li>
	<li>Copie los datos medidos en una hoja de cálculo. Promedio de la fluorescencia total de todas las muestras de control (DMSO). Calcule la diferencia porcentual utilizando la siguiente fórmula: –[(área media DMSO – área experimental)/área DMSO promedio] x 100%(Figura 3B).</li>
</ol>

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<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, demostramos un método estandarizado para la descongelación y la inyección de células de leucemia de pacientes primarios en el pez cebra como modelo de xenoinjerto. También establecimos un protocolo para el cribado de fármacos de alto rendimiento de peces cebra xenoinjerados utilizando una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de toma de muestras automatizada. Anteriormente, se han notificado xenoinjertos con líneas celulares humanas, y la cuantificación de tumores xeno...

La xenografting de cánceres de pacientes primarios o líneas celulares de cáncer humano en organismos modelo es una técnica ampliamente utilizada para estudiar la progresión y el comportamiento del tumor in vivo, la respuesta tumoral al tratamiento farmacológico y la interacción de las células cancerosas con el microambiente, entre otros. Tradicionalmente, las células se xenojeran en ratones inmunes, y esto sigue siendo el estándar en el campo. Sin embargo, este sistema modelo tiene varias limitaciones, tales como alto costo, números de réplica bajos, dificultades para cuantificar con precisión la carga tumoral in vivo, y el tiempo prolongado que tardan los tumores en injertar y pruebas de drogas para completarse. En los últimos años, el pez cebra ha surgido como un modelo de xenoinjerto alternativo, y el primero se ha informado en 2005, con líneas celulares de melanoma humano etiquetadas con proteínafluorescentes verdes (GFP) trasplantadas en embriones de fase de blastula1,,2. Más recientemente, se han utilizado como receptores de xenoinjerto 2 días larvas de pez cebra después de la fertilización (dpf) para permitir el control de la ubicación anatómica de la inyección y para su uso en alta resolución in vivo de la interacción tumoral con el microambiente circundante3,4.
Zebrafish ofrece muchas ventajas como modelo de xenoinjerto. En primer lugar, el pez cebra adulto puede ser alojado y criado rápidamente en grandes cantidades a un costo relativamente bajo. Cada par de peces cebra adultos puede producir cientos de peces laricos por semana. Debido a su pequeño tamaño, estos peces cebra larvales se pueden mantener en placas de 96 pocillos para el cribado de drogas de alto rendimiento. Las larvas no tienen que ser alimentadas durante el transcurso de un experimento típico de xenoinjerto, ya que su saco de yema proporciona los nutrientes para sostenerlas durante su primera semana de vida. Además, el pez cebra no tiene un sistema inmunitario completamente funcional hasta 7 dpf, lo que significa que no requieren irradiación o regímenes inmunosupresores antes de la inyección de xenoinjerto. Por último, las líneas ópticamente claras del pez cebra permiten imágenes de alta resolución de las interacciones tumor-microambiente.
Tal vez la aplicación más prometedora del pez cebra como modelo de xenoinjerto es la capacidad de realizar pruebas de detección de fármacos de alto rendimiento en muestras de cáncer humano de una manera que no es posible utilizando ningún otro organismo modelo. Las larvas absorben los fármacos del agua a través de la piel, mejorando la facilidad de administración de fármacos5. Debido a que los animales se mantienen en placas de 96 pocillos, por lo general en 100 a 300 l de agua, las pantallas requieren cantidades de fármacos más pequeñas en comparación con los ratones. Actualmente, existen varios métodos diferentes para la estandarización y cuantificación del efecto de los medicamentos en la carga tumoral humana en el pez cebra, algunos de los cuales son más prácticos que otros para ampliar las pruebas de un solo fármaco a la detección de alto rendimiento. Por ejemplo, algunos grupos disocian los peces en suspensiones de una sola célula y cuantifican las células tumorales etiquetadas fluorescentes o teñidas mediante la toma de imágenes de gotas individuales de la suspensión y la cuantificación de la fluorescencia utilizando unamacro4 semiautomática de ImageJ. Se desarrolló un método de imagen semiautomática de larvas enteras en el que los peces larvales se fijaban en placas de 96 pocillos e imágenes utilizando un microscopio fluorescente invertido antes de la realineación de imágenes compuestas y la cuantificación de los focos de células tumorales6. Ambos ensayos son métodos bastante intensivos en mano de obra para la cuantificación, lo que ha hecho que el cribado de fármacos de alto rendimiento en modelos de xenoinjerto de pez cebra no sea práctico.
Este problema ha sido abordado por el desarrollo de la Tecnología de Detección Automatizada de Vertebrados (VAST) Bioimagen y Gran Partícula (LP) Sampler, una unidad de imagen equipada con microscopio de fluorescencia y unidad de toma de muestras automatizada(Figura 1 y Tabla de Materiales),que es un método verdaderamente automatizado para la toma de imágenes de alto rendimiento de larvas de pez cebra7,8,9. Con esta unidad, los peces son anestesiados, muestreados automáticamente desde una placa de 96 pocillos, colocados en un capilar y girados en la orientación del conjunto en función de una preferencia de usuario preestablecida, imágenes, y luego colocados de nuevo en el mismo pozo de una nueva placa de 96 pocillos para estudios posteriores o desechados. La combinación de esta tecnología de imágenes con xenoinjertos de pez cebra puede permitir la posibilidad de una medicina personalizada que utilice pruebas de detección de fármacos de alto rendimiento de grandes bibliotecas de compuestos farmacológicos contra tumores de pacientes individuales. Los xenoinjertos de pez cebra también ofrecen un método a gran escala y de bajo costo para probar tanto la toxicidad como la eficacia de nuevos compuestos in vivo. Zebrafish se puede utilizar como paso de cribado preliminar antes de proceder a los modelos de xenoinjerto de ratón.
Hemos desarrollado un flujo de trabajo simplificado para las células de leucemia primaria del paciente de xenografting en el pez cebra y la realización de pantallas farmacológicas de alto rendimiento con imágenes y cuantificación automatizadas, que se pueden aplicar a cualquier otra célula tumoral de paciente primario o línea celular cancerosa. Este flujo de trabajo utilizó una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de tomadegador automatizada para mejorar los métodos actuales de estandarización y cuantificación y ofrece una alternativa automatizada a los métodos anteriores, más intensivos en mano de obra, de cuantificar la masa tumoral in vivo.

<table><tbody><tr><td>10x Concentrado líquido TBE</td><td>VWR</td><td>0658-5L</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos, fondo plano</td><td>CELLTREAT</td><td>229195</td><td>VAST es compatible con una variedad de placas de pocillos estándar o profundos de 24, 48 o 96 pocillos</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato sin filamento</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-EI126-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>E3 medios</td><td></td><td>N/A</td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Puntas de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (Premium Heat Inactivado)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>ImagenJ</td><td>FIJI</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://imagej.net/Fiji <tr><td>Iscove's Modificado Medio</td><td>STEMCELL de Dulbecco Tecnologías</td><td>36150</td><td></td></tr><tr><td>Muestreador de partículas grandes (LP)</td> Unidad <td>de muestreo automatizado</td><td>Union Biometrica</td><td>N/A</td> http://www.unionbio.com/copas/features.aspx?id=8</tr><tr><td>Metotrexato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6770-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26291</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (1x)</td><td>Caisson labs</td><td>PBL06-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Micrómetro de etapa (400 etapas)</td><td>Hausser Scientific</td><td>400-S</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Pentair Aquatic</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VAST Bioimager</td><td>Union Biometrica</td><td>N/ Una</td><td>unidad de imagen de microscopio equipada con fluorescente https://www.unionbio.com/vast/</td></tr> <tr><td>Sulfato de vincristina</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T117-0005</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI Stain</td><td>Thermo Fisher</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente son fundamentales para definir cómo los diferentes tipos de cáncer responden al tratamiento farmacológico en un sistema in vivo. Los modelos de ratón son el estándar en el campo, pero el pez cebra ha surgido como un modelo alternativo con varias ventajas, incluyendo la capacidad de detección de drogas de alto rendimiento y bajo costo. El pez cebra también permite la detección in vivo de fármacos con grandes números de réplica que antes solo se pueden obtener con sistemas in vitro. La capacidad de realizar rápidamente pantallas de medicamentos a gran escala puede abrir la posibilidad de medicina personalizada con una traducción rápida de los resultados a la clínica. Los modelos de xenoinjerto de pez cebra también podrían utilizarse para detectar rápidamente mutaciones procesables basadas en la respuesta tumoral a terapias dirigidas o para identificar nuevos compuestos contra el cáncer de grandes bibliotecas. La principal limitación actual en el campo ha sido cuantificar y automatizar el proceso para que las pantallas de drogas se puedan hacer a mayor escala y sean menos laboriosas. Hemos desarrollado un flujo de trabajo para las muestras de pacientes primarios de xenografting en larvas de peces cebra y la realización de pantallas de fármacos a gran escala utilizando una unidad de imágenes equipada con microscopio de fluorescencia y una unidad de toma de muestras automatizada. Este método permite la estandarización y cuantificación del área tumoral injertada y la respuesta al tratamiento farmacológico a través de un gran número de larvas de pez cebra. En general, este método es ventajoso sobre la detección de drogas de cultivo celular tradicional, ya que permite el crecimiento de células tumorales en un entorno in vivo durante todo el tratamiento farmacológico, y es más práctico y rentable que los ratones para pantallas de fármacos in vivo a gran escala.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, el pez cebra fue xenointizado en la yema y el pericardio con PBL de pacientes primarios que originalmente se aislaron de un paciente con leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL) en el diagnóstico y depositados como una muestra viable y congelada. A 48 hpi, los peces xenoinjerados fueron examinados en busca de células tumorales etiquetadas fluorescentesmente(Figura 2C,D)y tratados con quimioterapia (dexametasona o vincri...

Los modelos de xenoinjerto de pez cebra permiten la detección de fármacos de alto rendimiento y la toma de imágenes fluorescentes de células cancerosas humanas en un microambiente in vivo. Desarrollamos un flujo de trabajo para la detección automatizada de fármacos a gran escala en muestras de leucemia derivadas del paciente en peces cebra utilizando una unidad de imágenes automatizada equipada con microscopio de fluorescencia.

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Nuestro flujo de trabajo de detección de fármacos de xenoinjerto de peces cebra permite obtener imágenes automatizadas y cuantificar las células cancerosas humanas y su respuesta al tratamiento farmacológico. Se puede utilizar para probar rápidamente la respuesta de las células cancerosas de una paciencia a fármacos conocidos o para identificar nuevos compuestos contra el cáncer. El uso de modelos de xenografo de peces cebra y cribado de fármacos permite números replicantes de Inviva que anteriormente solo se obtenían con sistemas in vitro.También es mucho más rentable que los modelos de ratón en la detección a través de grandes bibliotecas de compuestos. Este flujo de trabajo tiene varios pasos desde la interjección de células cancerosas en el pez cebra hasta la toma de imágenes de la respuesta de los fármacos que se aprenden mejor mediante la demostración visual. Para empezar, centrifugar un mínimo de dos veces 10 a las sextas células en cinco milímetros de PBS a 200 veces g durante cinco minutos, y aspirar el sobrenadante.Resuspender la paleta de celdas en cinco milímetros de solución de tinción dii. Incubar las células a 37 grados centígrados protegidos de la luz durante 20 min

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video describe la técnica para crear un modelo de xenoinjerto derivado de un paciente de pez cebra. En el protocolo de muestra, evaluamos la eficacia de los fármacos Gemcitabina y Navitoclax en el modelo de xenoinjerto de tumor pancreático.

Xenoinjerto derivado de paciente de pez cebra (zPDX): un modelo de cáncer

Este video describe el ensayo de xenoinjerto de pez cebra para evaluar la formación de tumores in vivo y estudiar el efecto de los agentes terapéuticos.

Ensayo de xenoinjerto de pez cebra: un método para evaluar la eficacia anticancerígena de las terapias sobre la tumorigénesis en el pez cebra in vivo

Este video describe el método para el trasplante de células tumorales del modelo de pez cebra donante portador de melanoma a un receptor inmunodeprimido, el pez cebra Casper. Ayuda a visualizar el injerto tumoral y la proliferación en el pez receptor.

Ensayo de trasplante subcutáneo: un método para trasplantar células de melanoma de un donante a un modelo de pez cebra receptor

Una forma rápida de pantalla para los modificadores de melanoma utilizando un modelo de pez cebra tumor autóctona se presenta. Se aprovecha de la miniCoopR vector que permite la expresión de los genes candidatos de melanoma en los melanocitos. Un método para obtener gratis melanoma curvas de supervivencia, un ensayo de invasión, un protocolo para la tinción de anticuerpos de los melanocitos de escala y un ensayo de trasplante de melanoma se describen.

La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona

El trasplante de células cancerosas es una herramienta importante para la identificación de mecanismos de cáncer y respuestas terapéuticas. Las técnicas actuales dependen de animales inmuno-incompetentes. En este artículo, describimos un método para trasplantar células tumorales de pez cebra en embriones inmune-competentes para el análisis a largo plazo del comportamiento de las células tumorales y las respuestas in vivo a los fármacos.

Transplante de Tumores cerebrales pediátricos de Zebrafish en huéspedes inmune-competentes para el estudio a largo plazo del comportamiento de la célula de tumor y de la respuesta de la droga

Este protocolo describe los procedimientos de optimización en un modelo de xenoinjerto tumoral doble etiquetado con fluorescencia doble basado en virus utilizando peces cebra larvales como huéspedes. Este modelo heterogéneo de xenoinjerto imita la composición tisular del microambiente del cáncer de páncreas in vivo y sirve como una herramienta más precisa para evaluar las respuestas de los medicamentos en modelos personalizados de xenoinjerto derivado del paciente de pez cebra.

Modelo de xenoinjerto heterogéneo derivado del paciente del cáncer de páncreas utilizando larvas de pez cebra como anfitriones para la evaluación comparativa de fármacos

Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

Los modelos preclínicos tienen como objetivo avanzar en el conocimiento de la biología del cáncer y predecir la eficacia del tratamiento. Este artículo describe la generación de xenoinjertos derivados de pacientes a base de pez cebra (zPDX) con fragmentos de tejido tumoral. Las zPDX se trataron con quimioterapia, cuyo efecto terapéutico se evaluó en términos de apoptosis celular del tejido trasplantado.

Establecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra de cáncer de páncreas para pruebas de quimiosensibilidad

Describimos un protocolo para el xenotrasplante en la yema de embriones transparentes de pez cebra que se optimiza mediante un método de estadificación simple y rápido. Los análisis posteriores a la inyección incluyen la supervivencia y la evaluación de la carga de enfermedad de las células xenotrasplantadas mediante citometría de flujo.

Un método sencillo, rápido y eficaz para el análisis de xenotrasplantes tumorales en embriones transparentes de pez cebra

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para generar y solucionar problemas de xenoinjertos de leucemia linfoblástica aguda (LLA) humana a partir de líneas celulares y material fresco del paciente en embriones de pez cebra inmunosuprimidos transitoriamente, junto con pautas para la evaluación de la respuesta a los medicamentos mediante citometría de flujo. La tubería experimental también se puede adaptar para tumores sólidos.

Predicción rápida de la respuesta a fármacos in vivo mediante injertos de células de leucemia en embriones de pez cebra

Aprende el flujo de trabajo de xenoinjertos en peces cebra para cribado de fármacos con imágenes automatizadas. Este método permite evaluar rápidamente la respuesta de células cancerosas humanas derivadas del paciente a tratamientos oncológicos.

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

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