Name: Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprende a desarrollar un ensayo de invasión basado en esferoides 3D para células madre de glioblastoma. Este método permite cuantificar invasión, migración y proliferación tumoral en un entorno fisiológicamente relevante.

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Este trabajo fue apoyado por Transcan 2017, ARC 2017, Ligue Contre le Cancer (Comité de la Gironde et de la Charente-Maritime). Joris Guyon es becario del Hospital Universitario de Toulouse (CHU Toulouse).

Se obtuvo el consentimiento por escrito informado de todos los pacientes (del Hospital Haukeland, Bergen, Noruega de acuerdo con las regulaciones del comité de ética local). Nuestro protocolo sigue las pautas del comité de ética de investigación humana de nuestra institución.
1. Generación de esferoides tumorales de tamaño uniforme
NOTA: Las células similares al tallo se cultivan en medio neurobasal complementado con suplemento B27, heparina, FGF-2, penicilina y estreptomicina, como se describe en los artículosanteriores 12. Estas células forman espontáneamente esferoides en el cultivo.
<ol><li>Lavar las células tumorales con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubar las células con una enzima disociación de 0,5-1 ml (ver Tabla de materiales)durante 5 minutos a 37 oC.</li>
	<li>Lavar con 4-4,5 ml de PBS y añadir 10 ml del medio de crecimiento completo (medio neurobasal completo, cNBM).</li>
	<li>Cuente las celdas usando una técnica de conteo automático con trippan azul y una diapositiva de cámara de conteo celular.</li>
	<li>Para generar 100 esferoides con 104 células por esferoide (según el tamaño preferido), mezcle 106 células en 8 ml de NBM con 2 ml de 2% de metilcelulosa al 2%.</li>
	<li>Transfiera la suspensión a un recipiente estéril del sistema y dispensar 100 l/bien con una pipeta multicanal en una placa inferior redonda de 96 pocillos.</li>
	<li>Incubar la placa a 37oC, 5% CO2 y 95% de humedad. Se formarán esferoides de igual tamaño y se pueden utilizar después de 3-4 días.</li>
</ol>2. Experimentos tridimensionales
<ol><li>Proliferación<ol>
<li>Preparación<ol>
<li>Suspender los inhibidores (p. ej., rotenona como en la Figura 4A)y productos químicos en 100 s de medio y añadir a los 100 s de medio en cada pocal (es decir, un esferoide por pocido).</li>
			<li>Incubar la placa a 37oC, 5% CO2y 95% de humedad.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adquisición y análisis de imágenes<ol>
<li>Tome fotografías con un microscopio de vídeo en brightfield para crear una serie de condiciones en T0 y los siguientes tiempos esperados.</li>
			<li>Utilice Fiji para analizar imágenes de forma manual o semiautomática. Para hacerlo manualmente, dibuje un círculo alrededor del núcleo del esferoide con la herramienta de selección a mano alzada y mida el área de cada esferoide. Para analizar las imágenes de forma semiautomática, utilice la macro que se muestra en Documento suplementario 1 solo con //Core Area.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Invasión<ol>
<li>Preparación<ol>
<li>Preparar la matriz de colágeno en un tubo sobre hielo con colágeno tipo I a 1 mg/ml de concentración final, 1x PBS, colágeno 0.023xV, hidróxido de sodio de 1 M, e estéril H2O. Incubar la solución en hielo durante 30 min.collagen</li>
			<li>Recoger esferoides de la placa de pozo de fondo redondo en tubos de 500 l y lavar 2x con 200 s 1x PBS.</li>
			<li>Pipetear los esferoides cuidadosamente en 100 l de la matriz de colágeno e insertar en el centro de un pozo en las placas normales de 96 pocillos.</li>
			<li>Incubar el gel de colágeno durante 30 min a 37 oC y luego añadir cNBM encima del gel. Los inhibidores o activadores (por ejemplo, cloruro de hidrógeno como se muestra en la Figura 4B, 4C)se pueden añadir al medio en este paso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adquisición y análisis de imágenes<ol>
<li>Tome fotografías secuencialmente con un microscopio de vídeo en modo campo brillante 24 h después de la inclusión de colágeno.</li>
			<li>Utilice Fiji para analizar imágenes de forma manual o semiautomática. Para hacerlo manualmente, dibuje alrededor del núcleo y el área total del esferoide con la herramienta de selección a mano alzada y mida el área invasiva de cada esferoide restando el área total con el área del núcleo. Para analizar las imágenes de forma semiautomática, utilice la macro como se indica en el Documento Suplementario 1 para determinar el área invasiva.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Migración<ol>
<li>Preparación<ol>
<li>Recubrir una placa de 6 pocillos con Matrigel (0,2 mg/ml) en NBM durante 30 min a 37 oC, luego retirar el Matrigel y añadir 2 ml de cNBM.</li>
			<li>Transfiera los esferoides a 50 ml de cNBM desde la placa de pozo de fondo redondo a la placa de 6 pocillos.</li>
			<li>Incubar la placa a 37 oC y esperar 30 minutos a que se adhieran los esferoides.</li>
			<li>Después de 24 h de incubación, mancha con 10 ng/ml de Hoechst e incubar 30 min a 37oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Adquisición y análisis de imágenes<ol>
<li>Obtenga imágenes utilizando un microscopio de vídeo en Brightfield. Un láser de 405 nm se utiliza para la visualización de la tinción Hoechst.</li>
			<li>Utilice el software Fiji para analizar imágenes y ejecutar la macro como se indica en el Documento Complementario 1. NOTA: Al tocar la parte inferior del pozo o eliminar completamente el sobrenadante, se dañan los esferoides. Para el manejo del gel de colágeno tipo I, mantener el gel sobre hielo para evitar la polimerización de colágeno, no añadir un componente ácido porque el cambio en el pH afectará a la compacidad del gel, y pipetear las células rápidamente en el colágeno para evitar la muerte celular y la degradación del gel.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fiji Macro
NOTA: Fiji es un programa de análisis de imágenes desarrollado en el dominio público que permite el desarrollo de macros para acelerar el análisis de imágenes. El análisis manual también es posible, pero este es un proceso lento y puede introducir sesgos. Las imágenes se pueden importar arrastrando y soltar en el software y cuantificadas con el plugin ROI Manager Tools. El procedimiento utilizado en este estudio se describe a continuación:
<ol><li>Abra la ventana macro: Plugins Macros de la página de macros de la Intérprete interactivo.</li>
	<li>Copie y pegue el siguiente bucle púrpura adaptado. Conservar las oraciones púrpuras y añadir las oraciones verdes de interés(Documento Suplementario 1).</li>
	<li>Para analizar toda la serie, ajuste los parámetros en rojo para una cuantificación específica y ejecute la macro utilizando Macros . Ejecute Macro o pulse Ctrl+R.</li>
	<li>Compruebe y, si es necesario, adapte manualmente la región de interés (ROI).</li>
</ol>4. Microscopía electrónica de esferoides
NOTA: La mayoría de los siguientes pasos deben realizarse en una campana química.
<ol><li>Paso de fijación<ol>
<li>Recoger el esferoide con una punta de pipeta cortada, ponerlo en un tubo de 1,5 ml, y lavar 1x con tampón de fosfato de 0,1 M (PB).</li>
		<li>Fijar el esferoide durante la noche a 4 oC en 2% glutaraldehído/2% paraformaldehído (PFA) en 0.1 M PB.</li>
		<li>Reemplace la solución de fijación por una solución de 1% de PFA en 0,1 M PB seguida de preparación de muestras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de muestras<ol>
<li>Transfiera los esferoides a un colador y colóquelos en un vaso de precipitados para evitar daños por esferoides.</li>
		<li>Lavar con cuidado 3x con 0.1 M PB.</li>
		<li>Incubar con osmio durante 2 h en la oscuridad. Diluir el osmio al 4% en 1% 0,1 M PB tampón.</li>
		<li>Lavar con cuidado 3x con 0.1 M PB.<ol>
<li>Deshidratar de la siguiente manera: remojar en 50% etanol durante 10 min, 70% etanol para 10 min, 2x 90% etanol para 15 min, 2x 100% etanol para 20 min, y 2x acetona durante 30 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incubar las muestras en una mezcla 50/50 de acetona/resina durante 2 h. Durante este paso, prepare la resina EPON (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).</li>
		<li>Deseche la mezcla de acetona/resina, sustitúyala con resina recién preparada e incuba durante la noche.</li>
		<li>Sustituya la resina por una nueva e incubar entre 2-6 h.</li>
		<li>Añadir los esferoides en resina en un molde a 60oC durante 48-72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los ensayos con esferoides tumorales están bien adaptados para estudiar las características tumorales, incluida la proliferación, la invasión y la migración, así como la muerte celular y la respuesta a las drogas. Las células cancerosas invaden la matriz 3D formando un microtumor invasivo, como se ve en la Figura 4B,C. Durante el proceso invasivo, las matrices de digestión de la matriz de metaloproteinasas (MMP) que rodean las células tumorales13e inh...

En la mayoría de los estudios que utilizan líneas celulares primarias o disponibles comercialmente, los ensayos se realizan en células cultivadas en superficies plásticas como cultivos monocapa. La gestión del cultivo celular en 2D representa desventajas, ya que no imita un entorno de células 3D in vivo. En los cultivos 2D, toda la superficie celular está directamente en contacto con el medio, alterando el crecimiento celular y modificando la disponibilidad de medicamentos. Además, la superficie de plástico no fisiológico desencadena la diferenciación celular1. Se han desarrollado modelos de cultivo tridimensionalparados para superar estas dificultades. Tienen la ventaja de imitar la arquitectura multicelular y la heterogeneidad de los tumores2,por lo que podrían considerarse un modelo más relevante para los tumores sólidos3. La compleja morfología de los esferoides contribuye a evaluar mejor la penetración y resistencia a los fármacos4. La heterogeneidad tumoral en el esferoide afecta a la difusión de oxígeno y nutrientes, y la respuesta a los agentes farmacológicos(Figura 1A). La difusión del oxígeno se altera cuando el tamaño de los esferoides alcanza los 300 m, induciendo un ambiente hipoxico en el centro del esferoide(Figura 1A,C). Los metabolitos también son menos penetrantes a través de las capas celulares y las reacciones metabólicas compensatorias tienen lugar5. Cuando aumenta el diámetro de la esferoide, se pueden observar núcleos necróticos, imitando aún más las características encontradas en muchos cánceres sólidos, incluyendo el glioblastoma agresivo del cáncer cerebral (GBM)6.
Varios ensayos de invasión 2D o 3D para el glioblastoma se han divulgado en la literatura7,8. Los ensayos bidimensionales son principalmente para estudiar la invasión en un plano horizontal en una capa de matriz delgada o en un ensayo de cámara Boyden9. Los ensayos tridimensionales se han descrito con cultivos de esferoides 3D utilizando líneas celulares clásicas de glioblastoma10. Variantes más complejas están representadas por la invasión de organoides cerebrales por esferoides tumorales en las culturas de confrontación11. Sin embargo, sigue siendo importante desarrollar un ensayo fácil de usar y reproducible disponible para cualquier laboratorio. Hemos desarrollado un protocolo para generar células similares a glioblastoma a partir de muestras de pacientes. La cuantificación de estos ensayos es fácilmente manejable y sólo requiere software en línea de acceso abierto. Brevemente, las piezas tumorales se cortan en trozos pequeños y se digieren enzimáticamente. Las células individuales derivadas de la digestión se cultivan en medio neurobasal. Después de 4-7 días, las estructuras esferoides se forman espontáneamente. Tras la implantación intracraneal en modelos de ratones, forman tumores que exhiben un núcleo necrótico rodeado de células pseudo-palisading12. Esto se asemeja mucho a las características encontradas en los pacientes con GBM.
En este artículo, describimos nuestro protocolo para producir esferoides a partir de un número determinado de celdas para garantizar la reproducibilidad. Para ello se pueden utilizar dos matrices complementarias: Matrigel y colágeno tipo I. Matrigel se enriquece en factores de crecimiento e imita la membrana basal de mamíferos necesaria para la unión celular y la migración. Por otro lado, el colágeno tipo I, un elemento estructural del estroma, es la matriz extracelular fibrilar más común y se utiliza en ensayos de invasión celular. Aquí, ilustramos nuestro modelo de esferoides GBM mediante la realización de ensayos de migración y proliferación. El análisis se realizó no sólo en puntos de tiempo fijos, sino también mediante el monitoreo de la expansión del esferoide y el movimiento celular mediante imágenes en vivo. Además, la microscopía electrónica se realizó para visualizar detalles morfológicos.

<table><tbody><tr><td>Placa de fondo redondo de 96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Almacenado a 4 &deg; C, enzima de disociación esférica</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Almacenada a -20 &deg; C, descongelar antes de usar</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento básico de fibroblastos</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Almacenado a -20 ° C, descongelar antes</td></tr><tr><td>de usar Countess Cámara de recuento de células Slides Invitrogen</td><td></td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Se utiliza para analizar imágenes</td></tr><tr><td>Matraz 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Almacenado a -20 &deg; C, diluido a una concentración final de 0,2 mg/mL en NBM</td></tr><tr><td>frío Metilcelulosa</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Diluido en NBM para una concentración final del 2%</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Penicilina - Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>almacenada a 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Azul de tripano 0.4%</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Utilizado para el recuento de células</td></tr><tr><td>Colágeno tipo I Corning</td><td>354236</td><td></td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr></tbody></table>

un modelo de esferoides 3d para glioblastoma

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Los cultivos celulares bidimensionales (2D) no imitan satisfactoriamente el crecimiento tumoral in vivo. Por lo tanto, se desarrollaron modelos de esferoides de cultivo tridimensionales (3D). Estos modelos pueden ser particularmente importantes en el campo de la neurooncología. De hecho, los tumores cerebrales tienen la tendencia a invadir el ambiente cerebral sano. Aquí describimos un ensayo ideal basado en esferoides de glioblastoma 3D que desarrollamos para estudiar la invasión tumoral. Proporcionamos todos los detalles técnicos y herramientas analíticas para realizar con éxito este ensayo.

Los esferoides se prepararon como se describe en la sección de protocolos y se hicieron observaciones con respecto a la migración, invasión, proliferación y microscopía. Para medir la hipoxia en áreas distintas de la estructura esférica, se utilizó la tinción de anhidrasa IX carboxínica para determinar la actividad hipoxica(Figura 1A-C). Se observaron más células CAIX positivas en el centro esferoide(Figura 1<str...

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Los cultivos celulares bidimensionales no imitan adecuadamente el crecimiento tumoral in vivo. Para mejorar, se han desarrollado procedimientos 3D utilizando esferoides. Nuestro ensayo basado en el esferoide de glioblastoma 3D es particularmente adecuado para investigar la invasión de tumores cerebrales en el entorno saludable del tumor cerebral.Los modelos de cultivo tridimensionales se pueden utilizar para recapitular una arquitectura multicelular, heterogeneidad y estado metabólico de los tumores, lo que permite una evaluación más rigurosa de los efectos farmacológicos. Asegúrese de no tocar la parte inferior del pozo o quitar completamente el sobrenadante, para mantener el gel en hielo, y para agregar las células al gel rápidamente. Para generar esferoides tumorales de tamaño uniforme, primero lave el cultivo celular tumoral de interés con cinco mililitros de PBS y trate las células con 0,5 a un mililitro de enzima de disociación.Después de cinco minutos a 37 grados celsius, detenga la reacción con cuatro a 4,5 mililitros de PBS y transfiera las células separadas en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento completo. Después de contar, resuspender las células en un uno por 10 a la sexta célula por ocho mililitros de medio de crecimiento completo complementado con dos mililitros de 2%concentración de metilcelulosa y transferir la suspensión a un contenedor de sistema estéril. Luego agregue 100 microlitros de células a cada pozo de una placa inferior redonda de 96 pozos y coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius 5% durante tres a cuatro días.Para realizar un ensayo de invasión, cuando las células tumorales se hayan formado esferoides de tamaño uniforme, transfiera cada estructura celular a un tubo de 500 microlitros y lave los esferoides una vez con 200 microlitros de PBS. Después del segundo lavado, transfiera los esferoides cuidadosamente en 100 microlitros de matriz de colágeno recién preparada y agregue cada suspensión de esferoides en el centro de cada pozo de una placa plana inferior de 96 pozos. Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius, agregue 100 microlitros de medio de crecimiento completo en la parte superior del gel en cada pocóyo.Asegúrese de colocar todos los esferoides en el centro de cada pozo para obtener las mejores imágenes de la invasión de células tumorales. Para realizar un ensayo de migración, cuando las células tumorales se han formado esferoides de tamaño uniforme, recubrir una placa de seis pozos con 0,2 miligramos por mililitro de Matrigel en medio de crecimiento durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, retire el Matrigel y añada dos mililitros de medio de crecimiento completo a cada pocóyo.Transfiera los esferoides de la placa inferior redonda en volúmenes de 50 microlitros en pozos individuales de la placa de seis pozos y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al día siguiente, mancha los esferoides con 10 nanogramos por mililitro de Hoechst durante 30 minutos a 37 grados Centígrados. Para la adquisición de imágenes después de un ensayo de invasión o migración, coloque la placa en el escenario de un microscopio confocal Brightfield equipado con una cámara de video y obtenga imágenes durante el período experimental adecuado.Para analizar las imágenes de forma semiautomática, importe las imágenes a Fiji y haga clic en Plugins, Macros, Interactive Interpreter. Copie y pegue el bucle púrpura adaptado. Mantenga las oraciones púrpuras y agregue las oraciones verdes de interés según sea necesario.A continuación, para medir el área de cada esferoide, haga clic en Analizar y medir. Para medir la hipoxia en áreas distintas de la estructura esférica, se puede utilizar la tinción de anhidrasa IX carbónica para determinar la actividad hipoxica. En este análisis representativo, se observaron más células positivas de anhidrasa carbónica IX en el centro esferoide.Las células hipoxiicas ubicadas en el núcleo esferoide tienden a ser más glucolíticas que las células que rodean el núcleo. Las mitocondrias se pueden obtener mediante microscopía electrónica para su posterior análisis. El diámetro del esferoide está directamente correlacionado con la densidad de las células que componen la estructura celular 3D y las macros de Fiji se pueden utilizar para cuantificar la proliferación, invasión o migración de las células dentro de cada esferoide o migración de las células dentro de cada esferoide.Los aumentos en el núcleo esferoide reflejan la estimulación de la proliferación celular. Tras la inhibición del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial, la gran mayoría de la producción de ATP en las mitocondrias se ve comprometida reduciendo la proliferación en un 20%después de 72 horas. El tratamiento del cloruro de hidrógeno mejora la invasión del colágeno tipo I durante un período de 24 horas, pero reduce el área migratoria de los esferoides 1,5 veces en comparación con el control de los esferoides no tratados.Según lo evaluado por imágenes en vivo, los esferoides demuestran una alta dinámica interna y se mueven rápidamente. El tamaño de los esferoides debe ser relativamente uniforme y se debe tener cuidado de manipular los esferoides al centro de los pozos para obtener los mejores resultados de imagen. Este método también se puede utilizar para investigar la proliferación de células tumorales, migración y muerte, así como la expresión de matriz extracelular, receptores celulares o proteínas intracelulares de interés.Los esferoides también pueden encapsularse y el efecto del aumento de la tensión de la superficie celular se puede investigar al retirar las cápsulas.

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video demuestra cómo las gliomasferas, derivadas de tumores cerebrales, se separan en células individuales y se encapsulan en un hidrogel a base de ácido hialurónico. Este proceso promueve las interacciones célula-célula, formando un modelo de glioblastoma estructurado y tridimensional.

Un hidrogel a base de ácido hialurónico para el cultivo tridimensional de células de glioblastoma

Fuente: Guyon, J., et al. Un modelo esferoide 3D para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)El video muestra la generación de un modelo esferoide tridimensional de la invasión de células tumorales. Los esferoides se forman a partir de células tumorales cerebrales humanas y se incrustan en una matriz de colágeno. Las células tumorales en la periferia esferoide adoptan un fenotipo invasivo, secretando proteasas para degradar el colágeno y avanzando para invadir la matriz circundante.

Generación de un modelo esferoide tridimensional de invasión de células tumorales

Protocolo para la propagación de muestras quirúrgicas de glioma de alto grado disociadas en medio de neuroesfera sin suero para seleccionar células con fenotipo de células madre cancerosas. Para los especímenes que no pueden crecer como neuroesferas, se sugiere un protocolo alternativo. Una técnica de incrustación de la parafina para mantener la arquitectura 3D de la neuroesfera para el immunocytochemistry se describe.

Optimización Del Cultivo Celular De Glioma De Alto Grado De Muestras Quirúrgicas Para Su Uso En Modelos Animales Clínicamente Relevantes E Inmunoquímica 3D

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Aquí, describimos un modelo de ratón ortotópico preclínico para GBM, establecido por inyección intracraneal de células derivadas de tumores modelo de ratón genéticamente modificados. Este modelo muestra las características de la enfermedad del GBM humano. Para estudios traslacionales, el tumor cerebral de ratón se rastrea mediante resonancia magnética in vivo e histopatología.

Modelos ortotópicos traslacionales del glioblastoma multiforme

Los embriones de pollo se utilizan para estudiar tumores cerebrales de glioblastoma humano (GBM) in ovo y en cocultivos de cortes cerebrales ex vivo . El comportamiento de las células GBM se puede registrar mediante microscopía de lapso de tiempo en cocultivos ex vivo , y ambas preparaciones se pueden analizar en el punto final experimental mediante un análisis confocal 3D detallado.

Uso del cerebro del embrión de pollo como modelo para análisis in vivo y ex vivo del comportamiento de las células de glioblastoma humano

Aquí, presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y barata de esferoides tumorales seguida de encapsulación de hidrogel. Es ampliamente aplicable ya que no requiere equipo especializado. Sería particularmente útil para explorar las interacciones esferoides-matrices y construir modelos de fisiología tisular o patología in vitro .

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Presentamos un método para replicar el microambiente tumoral de glioma en el frente invasivo que incorpora flujo de líquido intersticial. Este modelo es un hidrogel de hialuronano-colágeno I en un inserto de cultivo de tejidos donde se puede aplicar un cabezal de presión de fluido. La invasión se puede cuantificar y las células se pueden aislar o lisar.

Un modelo fotopolimerizable de ácido hialurónico-colágeno del microambiente de glioma invasivo con flujo intersticial

Aquí, establecemos una plataforma de perfiles metabólicos que integra esferoides de glioma tridimensionales (3D) y normalización basada en imágenes a través del análisis de flujo extracelular. Este enfoque permite una evaluación más precisa de las respuestas metabólicas de los tumores a los tratamientos farmacológicos y proporciona información sobre los posibles mecanismos de resistencia.

Avances en el perfil metabólico de esferoides tumorales cerebrales tridimensionales para la detección de fármacos

Presentamos un modelo de migración de glioblastoma 3D utilizando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes generadas a partir de tumores recién diagnosticados y recurrentes. Esta plataforma permite visualizar la dinámica migratoria específica del paciente y evaluar la eficacia terapéutica. El ensayo puede multiplexarse tras la migración para evaluar la localización y los patrones de expresión de proteínas.

Ensayo reproducible de migración de glioblastoma 3D con localización esferoide mediada por nanopartículas magnéticas bajo condiciones hipóxicas

Aprende a desarrollar un ensayo de invasión basado en esferoides 3D para células madre de glioblastoma. Este método permite cuantificar invasión, migración y proliferación tumoral en un entorno fisiológicamente relevante.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

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