Name: Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende a medir respuestas de estrés proteotóxico en C. elegans usando reportadores fluorescentes y ensayos de alto rendimiento. Este método permite evaluar perturbaciones genéticas y farmacológicas en vías celulares protectoras.

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R.BZ. cuenta con el apoyo de la beca a largo plazo embo y la Fundación Larry L. Hillblom. R.H.S cuenta con el apoyo de la concesión 5F32AG032023-02 a través del Instituto Nacional de Envejecimiento (NIA) y la Beca Postdoctoral Glenn Foundation for Medical Research. A.F. es apoyado por la concesión F32AG051355 a través de la NIA. H.K.G. cuenta con el apoyo de la beca DGE1752814 a través del Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. M.G.M. es compatible con 1F31AG060660-01 a través de NIA. A.D. cuenta con el apoyo de la Fundación Thomas y Stacey Siebel, el Instituto Médico Howard Hughes y 4R01AG042679-04 y 5R01AG055891-02 de NIA, y 5R01ES021667-09 de NIEHS. Agradecemos a Larry Joe, Melissa Sanchez, Naame Kelet y Anel Esquivel por su importante asistencia técnica. Agradecemos al laboratorio de Morimoto y al CGC (financiado por el Programa p40 OD010440 de la Oficina de Infraestructura de Investigación de los NIH) por las cepas.

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se describen métodos para interrogar las respuestas de estrés celular en C. elegans,utilizando reporteros transcripcionales fluorescentes y ensayos fisiológicos de supervivencia por estrés. Todos los reporteros utilizan la expresión GFP impulsada bajo el promotor de un objetivo transcripcional descendente de los factores de transcripción involucrados en el montaje de las respuestas de estrés celular. El uso de hsp-4p::GFP modulado por XBP-1s-mediada UPRER, hsp-6p::GFP controlad...

La capacidad de un organismo para responder a los cambios en el entorno intra y extracelular es crucial para su supervivencia y adaptación. Esto se logra a nivel celular a través de numerosas vías protectoras que aseguran la integridad de la célula. Mientras que numerosos componentes celulares están sujetos a daño asociado al estrés, una participación importante de las respuestas de estrés celular es reparar y proteger la homeostasis del proteome celular. Sin embargo, la compartimentación de proteínas en estructuras especiales, llamadas orgánulos, plantea un desafío para la célula, ya que no puede confiar en una forma centralizada de control de calidad de proteínas para garantizar que todas las proteínas dentro de la célula estén correctamente plegadas y funcionales. Por lo tanto, para hacer frente a las perturbaciones a sus proteínas, los orgánulos han desarrollado mecanismos de control de calidad dedicados, que pueden detectar proteínas mal dobladas y activar una respuesta de tensión en un intento de aliviar el estrés dentro de ese compartimiento. Por ejemplo, el citosol se basa en la respuesta de choque térmico (HSR), mientras que el retículo endoplasmático (ER) y las mitocondrias dependen de sus respuestas proteicas desplegadas específicas del compartimiento (UPR). El OxSR sirve para aliviar los efectos tóxicos de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Cada respuesta de estrés se activa en presencia de desafíos celulares e insultos ambientales e induce una respuesta transcripcional personalizada. Las características distintivas de estas respuestas incluyen la síntesis de moléculas que vuelven a plegar las proteínas mal dobladas (como los chaperones) dirigidas al orgánulo adecuado, o alternativamente, eliminan las proteínas dañadas por degradación de proteínas. Si no se activan estas respuestas de tensión, se acumulan proteínas dañadas, la disfunción celular se propaga a la insuficiencia sistémica de los tejidos y, finalmente, la muerte del organismo. La función y la regulación de las diferentes respuestas de tensión se revisan en otros lugares1.
Muchos conocimientos sobre la regulación y la actividad de las respuestas al estrés celular se han atribuido al nematodo, Caenorhabditis elegans, un organismo modelo multicelular en la investigación genética. Los nematodos no sólo permiten estudiar la activación de las respuestas de estrés a nivel celular, sino también a nivel de organismo; nematodos se han utilizado para estudiar los efectos de las perturbaciones genéticas o la exposición a fármacos y contaminantes en su crecimiento y supervivencia. Su tiempo de generación rápida, isogenia, transparencia, tractabilidad genética y facilidad de uso durante la experimentación los hacen ideales para tales estudios. Además, la respuesta fisiológica relativamente rápida al estrés (entre horas y unos días) y la conservación evolutiva de las vías celulares hacen de los nematodos una herramienta prominente en el estudio de la resistencia al estrés.
Hay dos cepas de E. coli comúnmente utilizadas como fuente de alimento para cultivar C. elegans: OP50 estándar, una cepa B en la que la mayoría de la experimentación se ha realizado históricamente2 y HT115, una cepa K-12 que se utiliza para casi todos los experimentos RNAi3,4. Es importante tener en cuenta que hay diferencias significativas entre las dietas bacterianas OP50 y HT115. Crecimiento en estas diferentes fuentes bacterianas se ha demostrado para causar grandes diferencias en el perfil metabólico, número de copia de ADN mitocondrial, y varios fenotipos principales, incluyendo la vida útil5. Algunas de estas diferencias se atribuyen a la deficiencia de vitamina B12 asociada con el crecimiento de bacterias OP50, que puede resultar en defectos en la homeostasis mitocondrial y mayor sensibilidad a patógenos y tensiones. Todos estos fenotipos han demostrado ser aliviados por el crecimiento de bacterias HT115, que tienen niveles más altos de vitamina B126. Por lo tanto, se recomienda que todos los experimentos sobre respuestas de estrés fisiológico se realicen en bacterias HT115, independientemente de la necesidad de condiciones de ARNi. Sin embargo, debido a la facilidad de mantener los animales en OP50, todo el crecimiento estándar (es decir, el mantenimiento y la amplificación de los animales) se puede realizar en OP50, ya que no se detectaron diferencias significativas en los paradigmas experimentales descritos aquí en los gusanos mantenidos en OP50 siempre y cuando se trasladaran a la sincronización posterior HT115 (es decir, desde el post-blanqueamiento de escotillas con o sin detención de L1) hasta la experimentación.
Aquí, se describe la caracterización de la actividad de las respuestas de estrés celular utilizando dos métodos funcionales. Cabe señalar que los protocolos presentados se centran principalmente en las respuestas de estrés celular y su impacto en la homeostasis proteica. En primer lugar, se utilizan reporteros transcripcionales fluorescentes, que están regulados por promotores de genes endógenos que se activan específicamente en respuesta a diferentes tensiones celulares. Estos reporteros transcripcionales fluorescentes se basan en la inducción transcripcional de genes específicos que son nativos parte de la respuesta al estrés. Por ejemplo, HSP-4, una proteína de choque térmico ortolista para el chaperone humano HSPA5/BiP, se activa al er-estrés y localiza a la sala de er para aliviar el estrés. En condiciones de estrés er (por ejemplo, la exposición a la tunicamicina), una proteína fluorescente verde (GFP), colocada bajo la regulación del promotor hsp-4, se sintetiza en niveles elevados, como puede evaluarse mediante microscopía fluorescente o medir cuantitativamente utilizando citometría de flujo de partículas grandes de nematodos7. Del mismo modo, el promotor de un chaperón mitocondrial, hsp-6 (ortologous a mamífero HSPA9), se utiliza para monitorear la activación de la UPRMT8,y el promotor de la chaperona citosólica hsp-16.2 (ortopéloga a los genes alfa de cristalino humana) se utiliza para evaluar la actividad del HSR9. Estos reporteros permiten una rápida caracterización de las vías activadas en respuesta a diversas perturbaciones.
A menudo, los reporteros presentados aquí son fotodos usando microscopía, que proporciona una salida cualitativa de la activación de las respuestas de estrés. Sin embargo, mientras que las técnicas de diagnóstico por imágenes proporcionan información sobre la intensidad y la ubicación de los tejidos de los reporteros descritos anteriormente, su cuantificación no siempre es precisa o robusta. Si bien es posible cuantificar la activación fluorescente utilizando herramientas de análisis de imágenes, estos métodos son relativamente bajos y el tamaño de la muestra es pequeño, debido al número relativamente bajo de animales en la imagen. La facilidad y la capacidad de obtener grandes cantidades de animales rápidamente hacen de C. elegans un sistema de modelo ideal para analizar la activación de los reporteros de estrés fluorescente a través del uso de un gran citómetro de flujo de partículas. Un citómetro de flujo de partículas grandes es capaz de registrar, analizar y clasificar en función del tamaño y la fluorescencia de muchos animales vivos. Usando este método, es posible obtener la intensidad fluorescente, el tamaño y también la información espacial (2D) para miles de gusanos. El sistema se controla mediante FlowPilot, que permite la adquisición y el análisis de datos en tiempo real de los parámetros medidos. Aquí, los métodos para la toma de imágenes microscópicas y el análisis cuantitativo utilizando un citómetro de flujo de partículas grandes se ofrecen como métodos para medir la activación de las respuestas de tensión.
Más allá del análisis del reportero, la sensibilidad o resistencia de los animales al estrés se puede medir mediante ensayos fisiológicos de estrés. Esto se logra mediante la exposición de los animales a ambientes estresantes que activan vías de estrés celular específicos. Aquí, se proporcionan varios métodos para medir la sensibilidad de animales enteros a tipos específicos de factores de estrés.
El estrés ER se aplica a C. elegans utilizando el agente químico, la tunicamicina, que bloquea la glicosilación ligada a N, causando la acumulación de proteínas mal plegadas en el ER10. En C. elegans, el crecimiento tras la exposición a la tunicamicina da lugar a perturbaciones importantes en la función de ER, y una vida útil significativamente disminuida11. Mediante la medición de la supervivencia de los animales en placas que contienen tunicamicina, se puede cuantificar la sensibilidad al estrés de los animales en ER. Por ejemplo, los animales con inducción ECtópica deURGENCIA supeditada y, por lo tanto, una mayor resistencia al estrés dedesdoblamiento de proteínas en el ER tienen una mayor supervivencia tras la exposición a la tunicamicina en comparación con los animales de tipo salvaje12.
El estrés oxidativo y mitocondrial se aplica a C. elegans al exponer animales al agente químico, paraquat. Paraquat es un herbicida de uso común, que causa la formación de superóxido específicamente en las mitocondrias13. Debido a la localización específica de las especies de oxígeno reactivo derivadas de las mitocondrias (ROS), los ensayos de paraquat se utilizan a menudo como un ensayo de estrés "mitocondrial". Sin embargo, el superóxido se convierte rápidamente en peróxido de hidrógeno por dismutas de superóxido mitocondrial (SOD)14. Posteriormente, el peróxido de hidrógeno puede salir de las mitocondrias y causar estrés oxidativo en otros compartimentos de la célula. Por lo tanto, describimos los ensayos de supervivencia de paraquat como la medición de la sensibilidad al estrés mitocondrial y oxidativo (otros ensayos de estrés oxidativo se pueden encontrar15).
Los ensayos de termotolerancia se realizan en C. elegans colocando animales a temperaturas elevadas. Las temperaturas ambiente de los nematodos son de 15-20 oC y se induce tensión térmica a temperaturas superiores a 25 oC16,17. Los ensayos de termotolerancia se realizan generalmente a temperaturas que oscilan entre 30-37 oC, ya que los animales presentan defectos celulares importantes a esta temperatura, y los ensayos de supervivencia se completan dentro de las 24 horas16,,18. Aquí, se proporcionan dos métodos alternativos para la realización de ensayos de termotolerancia: crecimiento a 34 oC y crecimiento a 37 oC. Juntos, los protocolos presentados aquí se pueden utilizar para realizar pantallas a gran escala cuando se combinan con el derribo de genes estándar utilizando interferencia de ARN o bibliotecas de fármacos químicos.
El protocolo se puede dividir en 4 procedimientos generales: crecimiento de C. elegans y preparación para la toma de imágenes (secciones 1 y 2), imágenes de reporteros transcripcionales mediante microscopía fluorescente (secciones 3-5), mediciones cuantitativas de reporteros utilizando un citómetro de flujo de partículas grandes (sección 6), y ensayos fisiológicos para medir la sensibilidad al estrés en C. elegans (sección 7).

<table><tbody><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>para el estrés mitocondrial</td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118072</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>BD Difco agar granulado</td><td>VWR</td><td>90000-782</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>BioPioneer</td><td>C0051-25</td><td>para ARNi</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>COPAS</td><td>Biosorter Union Biometrica</td><td>350-5000-000</td><td>equipado con una fuente de luz de 488 nm.</td></tr><tr><td>COPAS Solución de limpieza</td><td>Union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td>para usar con COPAS</td></tr><tr><td>COPAS Solución de vaina</td><td>Union Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td>para usar con COPAS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>disolvente para medicamentos</td></tr><tr><td>IPTG sin dioxano</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280-4</td><td>para ARNi</td></tr><tr><td>Caldo LB Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426500</td><td>para el</td></tr><tr><td>estereoscopio LB M205FA</td><td>Leica</td><td>10450040</td><td>equipado con una cámara CCD monocromática Leica DFC3000G, filtro Leica GFP estándar (ex 395-455, EM 480 LP) y software LAS X</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>VWR</td><td>EM-MX0070-3</td><td>para placas NGM, M9</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td><td>para estrés oxidativo/mitocondrial</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>para solución de lejía</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>para M9</td></tr><tr><td>Revolve</td><td>ECHO</td><td>75990-514</td><td>equipado con una lente de objetivo Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13, filtro Olympus FITC estándar (ex 470/40; em 525/50; DM 560), y un iPad Pro para la cámara y para el controlador Software ECHO</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289-50G</td><td>para la imagen</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0420-5</td><td>para placas NGM, M9</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>para M9</td></tr><tr><td>Hidroperóxido de terc-butilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td>para el estrés</td></tr> <tr><td>oxidativoClorhidrato de tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td><td>para ARNi</td></tr><tr><td>Tunicamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-50MG</td><td>para el estrés del RE</td></tr></tbody></table>

mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en c. elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Los organismos a menudo están expuestos a ambientes fluctuantes y cambios en la homeostasis intracelular, que pueden tener efectos perjudiciales en su proteome y fisiología. Por lo tanto, los organismos han evolucionado respuestas de estrés específicas y específicas dedicadas a reparar el daño y mantener la homeostasis. Estos mecanismos incluyen la respuesta proteica desplegada del retículo endoplasmático (UPRER),la respuesta proteica desplegada de las mitocondrias (UPRMT),la respuesta de choque térmico (HSR) y la respuesta de estrés oxidativo (OxSR). Los protocolos aquí presentados describen métodos para detectar y caracterizar la activación de estas vías y sus consecuencias fisiológicas en el nematodo, C. elegans. En primer lugar, se describe el uso de reporteros transcripcionales fluorescentes específicos de la vía para la caracterización celular rápida, la detección de drogas o la detección genética a gran escala (por ejemplo, RNAi o bibliotecas mutantes). Además, se describen ensayos fisiológicos complementarios y robustos, que pueden utilizarse para evaluar directamente la sensibilidad de los animales a factores de estrés específicos, sirviendo como validación funcional de los reporteros transcripcionales. Juntos, estos métodos permiten una rápida caracterización de los efectos celulares y fisiológicos de las perturbaciones proteotóxicas internas y externas.

Uso de reporteros transcripcionales para medir la activación de las respuestas de estrés Aquí, se utilizan reporteros transcripcionales fluorescentes, que sirven como herramientas robustas para medir la activación de la mayoría de las respuestas de estrés en C. elegans. La expresión gFP se impulsa bajo el promotor de objetivos canónicos de los reguladores transcripcionales maestros involucrados en la respuesta a las tensiones específicas del compartimiento. Un...

Aquí, caracterizamos las respuestas de estrés proteotóxico celular en el nematodo C. elegans midiendo la activación de los reporteros transcripcionales fluorescentes y diciendo sensibilidad al estrés fisiológico.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Estos métodos se pueden utilizar para caracterizar las respuestas al estrés en C.elegans y para determinar si las perturbaciones genéticas o farmacológicas afectan la activación de las vías celulares protectoras. Estos métodos permiten pruebas rápidas y de alto rendimiento de cientos de perturbaciones como la reducción genética tanto en los niveles moleculares como fisiológicos. Para asegurarse de que el ensayo se realiza correctamente, incluya controles positivos y negativos.Sincronice animales sanos y bien alimentados a la etapa adecuada y use platos frescos para el experimento. La visualización de la micromanipulación de los gusanos con una selección puede ayudar a los nuevos usuarios a entender cómo se pueden alinear y evaluar los gusanos para su viabilidad. Demostrando los procedimientos estarán Phil Frankino, Holly Gildea y Melissa Metcalf, estudiantes graduados en nuestro laboratorio.Utilizar animales que expresen GFP bajo el promotor de la proteína de choque térmico cuatro para la activación de la respuesta de proteína desdoplasmática desplegada de retículo, crecer animales reporteros sincronizados a 20 grados celsius hasta la etapa L4 y lavar los gusanos de la placa utiliz

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Hemos desarrollado un sistema de seguimiento de vídeo de tasa microscopio que puede registrar y...

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

Este video presenta un ensayo de supervivencia a corto plazo que prueba un tratamiento para la toxicidad aguda o prueba una cepa genética para determinar la resistencia a una condición tóxica. El protocolo de ejemplo muestra un ejemplo de ensayo de supervivencia en el que se evalúa la capacidad de los gusanos para resistir el estrés oxidativo inducido por el paraquat (PQ).

C. elegans Ensayo de supervivencia: una prueba de toxicidad a corto plazo

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

Un ensayo de huevo-en-gusano (EIW) es un método útil para cuantificar el comportamiento de puesta de huevos. Las alteraciones de la postura de huevos pueden ser una respuesta de comportamiento del organismo...

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

Un protocolo se describe que utiliza la anoxia / inanición en C. elegans para modelar la isquemia / reperfusión. Los resultados funcionales incluyen aumento de la mortalidad, anormalidades visibles en los procesos neuronales GFP-etiquetados, y las respuestas conductuales alterados que requieren la función neuronal.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

C. elegans es un organismo modelo atractivo para estudiar las vías de transducción de señales involucradas en la resistencia al estrés oxidativo. Aquí proporcionamos un protocolo para medir la resistencia al estrés oxidativo de animales C. elegans en fase líquida, utilizando varios agentes oxidantes en placas de 96 pocillos.

Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 pocillos en placas de microtitulación

Aquí, se presentan protocolos estandarizados para evaluar la inducción de la respuesta de choque térmico (HSR) en Caenorhabditis elegans usando RT-qPCR a nivel molecular, reporteros fluorescentes a nivel celular y termorecovery a nivel de organismo.

Métodos estandarizados para medir la inducción de la respuesta de choque térmico en Caenorhabditis elegans

El deterioro proteostático es un sello distintivo del envejecimiento, que facilita la aparición de enfermedades neurodegenerativas. Esbozamos un protocolo para medir cuantificablemente la proteostasis en dos tejidos diferentes de Caenorhabditis elegans a través de la expresión heteróloga de repeticiones de poliglutamina fusionadas a un reportero fluorescente. Este modelo permite un rápido análisis genético in vivo de la proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

Este estudio presenta protocolos para dos enfoques semiautomatizado de análisis de actividad locomotora en gusanos gas-1(fc21)de la enfermedad de C. elegans complejo I, a saber, ZebraLab (un ensayo de rendimiento medio) y WormScan (un ensayo de alto rendimiento) y proporcionan un análisis comparativo entre una amplia gama de métodos de investigación para cuantificar el comportamiento de los nematodos y la función neuromuscular integrada.

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Los microbios intestinales pueden afectar positiva o negativamente la salud de su huésped a través de mecanismos específicos o conservados. Caenorhabditis elegans es una plataforma conveniente para detectar tales microbios. El presente protocolo describe el cribado de alto rendimiento de 48 aislados bacterianos para determinar su impacto en la resistencia al estrés de los nematodos, utilizados como sustitutos de la salud de los gusanos.

Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans sirve como un excelente sistema modelo con métodos robustos y de bajo costo para estudiar la duración de la salud, la vida útil y la resistencia al estrés.

Encuesta de métodos de bajo costo para medir la esperanza de vida y la salud en Caenorhabditis elegans

Aprende a medir respuestas de estrés proteotóxico en C. elegans usando reportadores fluorescentes y ensayos de alto rendimiento. Este método permite evaluar perturbaciones genéticas y farmacológicas en vías celulares protectoras.

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