Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton

La evaluación de las propiedades contráctiles de las miofibriles aisladas del músculo estriado se puede utilizar para determinar si la disfunción del sarcomere es una causa primaria de debilidad muscular debido a mutaciones en las proteínas sarcoméricas. Esta técnica se puede utilizar para adquirir datos con una relación señal-ruido muy alta con resolución nanonewton. Este protocolo también es adecuado para medir la contractilidad en cardiomiocitos permeabilizados.

Tenga en cuenta que el transductor de fuerza es muy frágil. Así que al quitar el pegamento de la aguja de montaje o al pegar un myofibril, es necesario tener una mano firme, mucha práctica, y mucha paciencia. Antes de montar el tejido, coloque una varilla homogeneizadora en el tubo que contiene el tejido muscular.

Manteniendo el tubo en hielo, gire el rotor durante 15 segundos a la velocidad cinco. Al final de la homogeneización, transfiera 50 microlitros de la suspensión myofibril resultante y 250 microlitros de solución relajante a un tobogán recubierto de poli-HEMA en un baño de tejido. Cubra el baño con una tapa para proteger la mezcla del polvo y espere de 5 a 10 minutos para permitir que las miofibrils se hundan hasta el fondo de la gota.

Durante el hundimiento de los myofibrils, calienta Shellac un pegamento de etanol a 65 grados Celsius durante 30 a 60 segundos antes de añadir unos seis microlitros de pegamento en un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento. Sumerja repetidamente la punta de cada aguja de montaje en el pegamento hasta que una capa de pegamento sea visible. A continuación, utilice micro-manipuladores para mover la sonda y el piezo verticalmente para hacer espacio para el baño de tejido en la etapa del microscopio y eliminar el portaobjetos de vidrio que contiene el pegamento.

Después de montar las miofibriles, para medir la longitud de la sarcomere, mueva el piezo y/o la sonda de fuerza para establecer la longitud inicial de sarcomere del miofibril a 2,5 micrómetros. Usando la función de recipiente del software del controlador del sistema, mida la longitud y la anchura del myofibril. Utilice la etapa del microscopio para colocar el myofibril en el centro de la imagen de vídeo y estirar un rectángulo de un lado del myofibril al otro, teniendo cuidado de incluir el borde oscuro de las gotas de pegamento.

Para comenzar a grabar los datos, haga clic en Iniciar. Después de cinco segundos, haga clic en pausar. La longitud se habrá grabado.

Para medir la anchura, gire la cámara 90 grados para ver el contraste del borde del propio myofibril. Ajuste el rectángulo y haga clic en comenzar a grabar los datos. Después de cinco segundos, haga clic en pausar.

El ancho se habrá grabado. Para colocar el cristal theta, utilice el ocular y el manipulador para mover cuidadosamente el vidrio theta hacia el myofibril. Alinee el canal superior del cristal theta con el myofibril y realice un paso rápido para comprobar la posición.

Encienda el flujo relajante de fondo para comprobar la alineación del vidrio theta y utilice una palanca de válvula Luer para encender la entrada de la cámara de flujo. A continuación, para comenzar a drenar la cámara de flujo y evitar el desbordamiento de la cámara de flujo, ajuste la válvula de la bomba de salida a la válvula de baño dos, el modo de micro paso a micro, el objetivo del émbolo a 48.000 y la velocidad del émbolo en 38 a 40. Para medir la tasa de reurbanización de tensión, calcule el movimiento piezoeléctrico necesario para aflojar el miofibril en un 15% e introduzca este valor en el generador de señal.

Haga clic en reanudar para continuar registrando los datos y abrir las válvulas uno y seis para iniciar los flujos de la solución relajante y las diferentes concentraciones de calcio a través del vidrio theta respectivamente. Seleccione el rango de reinicio en el interferómetro para restablecer el rango del interferómetro de modo que la fuerza de línea base sea cero voltios. Cuando la traza de fuerza es estable, realice el paso rápido del vidrio theta con un tamaño de paso de 100 micrómetros.

Cuando se alcance la meseta de fuerza, realice el estiramiento de acortamiento con el piezo. Se registrará un rastro de relajación de activación. Haga clic en pausar.

Para realizar un estiramiento escalonado, haga clic en iniciar y restablezca el rango del interferómetro para que la fuerza de línea base sea cero voltios. Realice un estiramiento escalonado con el generador de señal. Cuando el estiramiento haya terminado, utilice el piezo para acortar el myofibril a la longitud floja.

A continuación, pulse pause y stop y guarde los datos. Aquí, se muestran rastros de fuerza de un experimento de fuerza activa con un miofibril aislado del músculo de cuádriceps humanos sanos. El myofibril se activó cinco veces con soluciones con diferentes concentraciones de calcio, con una fuerza máxima media de todos los miofibriles de aproximadamente 123 milinewtons por milímetro cuadrado.

La construcción de una curva de concentración de calcio de fuerza a partir de las fuerzas de la meseta alcanzadas durante cada activación en cada una de las cinco curvas de calcio permite calcular la concentración de calcio al 50% de la producción de fuerza máxima. Como se ilustra en este análisis representativo, los myofibrils se pueden tratar con múltiples compuestos en un solo experimento para responder preguntas adicionales sobre el tipo myofibril. La fuerza activa y la longitud del sarcomere también se pueden medir para permitir el cálculo de las tasas de reurbanización, activación y relajación.

El fuerte aumento que se muestra en la caja roja punteada es causado tanto por la viscosidad como por la elasticidad. La meseta se asemeja sólo al componente elástico. Como la viscosidad resiste la tensión linealmente, la fuerza cayó después de eliminar la tensión.

Al colocar el cristal theta, asegúrese de alinearlo correctamente con el myofibril. De lo contrario, la solución de activación podría entrar entre la fibra óptica y el voladizo de la sonda de fuerza y esto hace que se produzcan artefactos en los datos. Además, es posible que el myofibril no se active correctamente.

Este método de perfusión también es adecuado para determinar el tipo de fibra muscular del myofibril. Por ejemplo, primero puede perfumar el myofibril con una solución normal de calcio seguida de perfusión de esa misma solución, pero luego agregar un compuesto específico de mejora de la fuerza de tipo fibra muscular.