Detección de fitoestrógenos usando un ensayo de receptores de estrógeno a base de células β Reporter

Utilizamos este ensayo para evaluar si los alimentos vegetales contienen fitoesteríos, que pueden afectar los procesos fisiológicos en los animales, así como el comportamiento y el éxito reproductivo. Este ensayo proporciona un método simple y confiable para determinar si las plantas producen compuestos estrogénicos con actividad biológica. Este método se desarrolló inicialmente para seleccionar fármacos con actividad xenoestrogénica para su aplicación en medicina.

Por ejemplo, inhibir la proliferación celular. Lo estamos utilizando para proporcionar información sobre la ecología y la evolución de los primates. Es importante tener práctica trabajando con la técnica aséptica en un entorno limpio antes de intentar este ensayo, ya que es muy sensible a la contaminación.

Comience por liofilizar los artículos de plantas frescas con el liofilizador, luego muélalos finamente con un molino de molienda con una pantalla de malla de 0,85 milímetros. Guarde las muestras molidas en bolsas en la oscuridad hasta la extracción. Para extraer cualquier fitosteroide potencial en las plantas, agregue la muestra seca a un matraz de tamaño adecuado, luego a metanol de grado HPLC.

Cubra la solución de metanol de la planta con papel de aluminio y configúrela para que gire a 100 RPM durante tres días en un agitador orbital. Después de tres días, use papel de filtro para decantar el supernado y en un sistema de filtración por goteo. Seque el extracto de la planta con un evaporador rotativo hasta que espese, pero se pueda verter en un matraz de fondo redondo de 300 mililitros.

Vierta la muestra en un matraz de 50 mililitros y enjuague el matraz grande con una pequeña cantidad de metanol, luego continúe secando la muestra en el matraz pequeño hasta que el metanol se evapore por completo. Cuando termine, pese el residuo de la muestra con una balanza analítica y registre la masa. Disuelva el extracto de la planta en DMSO a una concentración de 0,1 gramos de extracto por dos mililitros de DMSO y vórtelo hasta homogeneizarlo.

El DMSO no es tóxico por sí solo, pero es un vehículo que permite que otras sustancias atraviesen las membranas. Como no sabemos si nuestras plantas contienen productos químicos tóxicos, todas se tratan como si fueran peligrosas. No permita que la solución toque la piel, reemplace los guantes si está contaminada y use zapatos gruesos y cerrados y batas de laboratorio.

Guarde la muestra a cuatro grados centígrados en viales de vidrio ámbar hasta que esté lista para usar. Agite las muestras, luego agregue cuatro microlitros de cada muestra a 496 microlitros de medio de cribado compuesto para producir una solución de DMSO al 0,8%. Desinfecte la superficie exterior de un tubo de medio de recuperación celular precalentado con etanol al 70% y transfiera 10 mililitros del medio a un tubo de células reporteras congeladas para descongelarlas.

Cierre el tubo de células reporteras y colóquelo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco a 10 minutos. Después de recuperar las células del baño de agua, invierta suavemente el tubo varias veces para romper los agregados de células y producir una suspensión homogénea, luego limpie la superficie del tubo con etanol al 70%. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 100 microlitros de la suspensión de células indicadoras en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, y luego dispense 100 microlitros de muestras por triplicado en los pocillos apropiados.

Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 22 a 24 horas. Justo antes del final de la incubación de placas, retire el sustrato de detección y el tampón de detección del refrigerador y colóquelos en un área con poca luz hasta que se equilibren a temperatura ambiente, luego invierta suavemente cada tubo para mezclar las soluciones. Inmediatamente antes de que se complete la incubación en placa, vierta todo el contenido del tampón de detección en el tubo del sustrato de detección para crear un reactivo de detección de luciferasa.

Mezcle el tubo suavemente para no producir espuma. Deseche el contenido de la placa de muestra en un contenedor de residuos inadecuado y golpéelo suavemente sobre una toalla de papel absorbente limpia para eliminar las últimas gotas de los pocillos. Agregue 100 microlitros del reactivo de detección de luciferasa a cada pocillo y deje que la placa de ensayo descanse a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego cuantifique la luminiscencia usando un luminómetro de lectura de placa de 96 pocillos.

Se examinaron 22 extractos de frutas y verduras que se encuentran comúnmente en las dietas humanas para detectar la presencia de compuestos estrogénicos. La actividad estrogénica se presenta de manera cualitativa ordinal de actividad alta, media, baja o nula. La soja orgánica y no orgánica se seleccionó con altos niveles de actividad, mientras que todos los demás productos de frutas y verduras no registraron actividad.

La comparación de los resultados de la soja con la curva estándar también muestra que tienen altos niveles de actividad estrogénica a esta concentración. El extracto de soja, una potente fuente conocida de las isoflavonas, daidzeína y genisteína, se utilizó además para determinar la dilución, produciendo una señal del 50% al máximo. Este extracto requiere 422 veces más dilución para producir la mitad de la señal de nuestro protocolo de dilución estándar.

Las muestras identificadas con actividad podrían enviarse para su análisis mediante espectrometría de masas para identificar los productos químicos activos. Utilizando un método antagonista, también podríamos determinar si el alimento vegetal contiene sustancias químicas que reducen la unión y la actividad de los estrógenos endógenos. Esta técnica nos permite comprender mejor la prevalencia de los alimentos estrogénicos en las dietas de los primates, así como la forma en que el consumo de fitoestrógenos afecta a la fisiología y el comportamiento cuando el ensayo se combina con análisis de hormonas fecales y datos de campo.