Name: Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a utilizar el sistema translaminar autónomo ocular para regular presiones intraocular e intracraneal en segmentos posteriores humanos. Este modelo permite estudiar mecanismos de glaucoma y neuropatía óptica de manera preclínica ex vivo.

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El financiamiento para este proyecto fue a través de fondos discrecionales de la Dra. Colleen M. McDowell. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Inc. al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de UW Madison. Agradecemos a los Dres. Abbot F. Clark y Weiming Mao por su asistencia técnica con el modelo de cultivo de órganos de perfusión. Agradecemos al Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) por proporcionar los ojos de donantes humanos.

Los ojos se obtuvieron de acuerdo con las disposiciones de la Declaración de Helsinki para la investigación con tejidos humanos.
NOTA: Los ojos de bancos de ojos de buena reputación (por ejemplo, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) se recolectaron dentro de las 6-12 h posteriores a la muerte y el suero del donante se analizó para detectar hepatitis B, hepatitis C y virus de inmunodeficiencia humana 1 y 2. Una vez recibidos, los ojos fueron diseccionados y configurados en el modelo TAS dentro de las 24 h. Los criterios de exclusión incluyeron cualquier patología ocular. Los ojos no se excluyeron en función de la edad, la raza o el género. Para asegurar la viabilidad de la retina al recibirla, se recolectaron explantes de retina de los donantes de tejido y se cultivaron durante 7 y 14 días (Figura suplementaria 1). Estas retinas también se disociaron y crecieron RGC sanas en cultivo durante 7 días con tinción positiva para el marcador RGC, proteína de unión a ARN con empalme múltiple (RBPMS), así como tinción positiva de cadena ligera de neurofilamentos (NEFL) en sus neurofilamentos (Figura suplementaria 2). .
1. Preparación y esterilización de equipos y suministros
<ol><li>Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista completa de los suministros requeridos, así como los números de proveedor y catálogo.</li>
	<li>Antes de su uso, esterilice todos los equipos e instrumentos en autoclave o utilizando ampollas de óxido de etileno.</li>
</ol>2. Preparación del medio de perfusión
<ol><li>Agregue estreptomicina de penicilina al 1% (10,000 U/mL de penicilina, 10,000 μg/mL de estreptomicina en 0.85% de NaCl) y 1% de L-glutamina (200 mM) a 1,000 mL de glucosa alta en el medio modificado de Eagle (DMEM) de Dulbecco.</li>
	<li>Esterilizar el medio de perfusión pasando por un filtro de 0,22 μm.</li>
</ol>3. Configuración del sistema autónomo translaminar (TAS)
<ol><li>Instale jeringas de entrada (depósitos de PIO e ICP).<ol>
<li>Añadir 30 ml del medio de perfusión (sección 2) a una jeringa de 30 ml. Coloque una llave de paso de 3 vías a la jeringa de 30 ml. Conecte un filtro hidrófilo de 0,22 μm a la llave de paso de 3 vías. Conecte un adaptador de talón Luer de 15 G al filtro hidrófilo de 0,22 μm.</li>
		<li>Retire las burbujas de aire de la configuración de la jeringa. Conecte el tubo al adaptador de talón Luer de 15 G. Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita el proceso para un total de dos configuraciones.</li>
		<li>Etiquete una jeringa como presión intracraneal del canal 1 (CH1 ICP) y la otra jeringa como presión intraocular del canal 2 (CH2 IOP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Instale jeringas de salida (depósitos de PIO e ICP).<ol>
<li>Coloque una llave de paso de 3 vías a una jeringa de 30 ml. Conecte un adaptador de talón Luer de 15 G a la llave de paso de 3 vías. Conecte el tubo al adaptador de talón Luer de 15 G.</li>
		<li>Cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación. Repita el proceso para un total de dos configuraciones. Etiquete una jeringa como CH1 ICP y la otra jeringa como CH2 IOP.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparación del globo ocular completo humano
NOTA: Si se reciben ojos enteros, siga el procedimiento a continuación para separar el segmento anterior del segmento posterior del ojo. Si los ojos se reciben divididos en dos, comience en el paso 4.4.
<ol><li>Coloque un ojo entero en la solución de povidona yodada durante 2 min.</li>
	<li>Enjuague el ojo en una solución tamponada con fosfato estéril (PBS) para enjuagar la povidona yodada. Repetir 2 veces.</li>
	<li>Retire los anexos de todo el globo ocular con fórceps y tijeras. Dividir el ojo en el ecuador para separar los segmentos anterior y posterior del ojo.</li>
	<li>Retire la vaina del nervio óptico. Retire el humor vítreo del segmento posterior.</li>
	<li>Recorte la esclerótica adicional del segmento posterior, si es necesario, para garantizar un buen ajuste en la cúpula redonda de la cámara IOP (inferior). Usando fórceps, asegúrese de que la retina se extienda uniformemente sobre la parte posterior del segmento.</li>
	<li>Configuración de la cámara IOP (inferior)<ol>
<li>Coloque el segmento posterior humano en la cámara IOP (inferior) del TAS sobre la cúpula redonda con el nervio óptico mirando hacia la parte superior.</li>
		<li>Selle el segmento posterior utilizando la junta tórica de resina epoxi con cuatro tornillos, asegurando un sellado hermético.</li>
		<li>Inserte el tubo en los puertos de entrada y salida de la cámara IOP (inferior). La jeringa de entrada IOP con tubo que contiene medio se inserta en el puerto IN y la jeringa de salida IOP vacía con tubo se inserta en el puerto OUT.</li>
		<li>Utilice el método push/pull para infundir lentamente el medio de perfusión en el puerto de entrada para llenar la copa del ojo posterior mientras que simultáneamente tira lentamente del medio de perfusión a través de la jeringa de salida para eliminar cualquier burbuja de aire de las líneas. Deje de infundir el medio una vez que los tubos DE ENTRADA y SALIDA estén vacíos de burbujas de aire.</li>
		<li>Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del conjunto del filtro del puerto IOP IN y vuelva a llenarla con un total de 30 ml de medio. Reemplace la jeringa de 30 ml en el conjunto del filtro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configuración de la cámara ICP (superior)
	<ol>
<li>Coloque la cámara/tapa ICP (superior) sobre la parte posterior del segmento posterior. Asegúrese de que el nervio óptico esté dentro de la cámara superior. Selle la cámara superior con cuatro tornillos.</li>
		<li>Inserte el tubo en los puertos DE ENTRADA y SALIDA de la cámara ICP (superior). La jeringa de entrada ICP con medio que contiene tubos se inserta en el puerto IN y la jeringa de salida ICP vacía con tubos se inserta en el puerto OUT.</li>
		<li>Infunda suave y lentamente el medio en el puerto IN para llenar la cámara ICP y eliminar las burbujas de aire de las líneas utilizando el método push/pull. Deje de infundir el medio una vez que la cámara ICP, así como el tubo IN y OUT, estén vacíos de burbujas de aire.</li>
		<li>Bloquee las llaves de paso en la posición de apagado. Retire la jeringa de 30 ml del ICP en el conjunto del filtro de puerto y vuelva a llenarla con un total de 30 ml de medio. Reemplace la jeringa de 30 ml en el conjunto del filtro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Configuración del sistema de registro de datos
NOTA: El sistema de registro de datos se compone de una fuente de alimentación de 8 canales, un amplificador de puente multicanal, transductores de presión hidrostática y una computadora con software de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales). A continuación se describe cómo configurar y calibrar el sistema.
<ol><li>Conecte el cable de alimentación a la parte posterior de la fuente de alimentación de 8 canales y conéctelo a un dispositivo de respaldo de batería.</li>
	<li>Conecte el cable USB de la fuente de alimentación de 8 canales a la parte posterior del ordenador.</li>
	<li>Conecte la fuente de alimentación de 8 canales al amplificador de puente multicanal mediante el cable I2C suministrado.</li>
	<li>Conecte los cables Bayonet Neill-Concelman (BNC) a las entradas de canal frente a la fuente de alimentación de 8 canales y el extremo de los cables a los canales correspondientes en la parte posterior del amplificador multicanal.</li>
	<li>Conecte los cables del transductor a la parte frontal del amplificador multicanal.</li>
	<li>Instale el software de adquisición de datos en el equipo.<ol>
<li>Ejecute el instalador de configuración del software de adquisición de datos desde el CD de software suministrado.</li>
		<li>Siga las instrucciones en la pantalla de la computadora.</li>
		<li>Cuando se complete la instalación, seleccione Finalizar.</li>
	</ol></li>
	<li>Encienda la fuente de alimentación de 8 canales.</li>
	<li>Encienda la computadora e inicie el software de adquisición de datos.<ol>
<li>Seleccione archivo | Nuevo.
</li>
		<li>Seleccione configuración | Configuración del canal. Seleccione tres canales (abajo a la izquierda de la pantalla). En la columna Título del canal , cambie el nombre de los canales de la siguiente manera: CH1 ICP; PIO CH2; CH3 TLPG (IOP-ICP).</li>
		<li>Seleccione 2 mV para el rango en todos los canales. En la columna Cálculo , seleccione Sin cálculo para los canales 1 y 2.</li>
		<li>En la columna Cálculo , seleccione Aritmética para el canal 3. En la sección Fórmula : Seleccionar canales/CH2; Seleccione aritmética "-"; Seleccione canales/CH1. En la sección Salida , seleccione mmHg. Seleccione Aceptar. Vuelva a seleccionar Aceptar .</li>
	</ol></li>
	<li>Configure y calibre los transductores de presión hidrostática. NOTA: Los transductores de presión hidrostática deben calibrarse antes de los experimentos utilizando el siguiente método.<ol>
<li>Conecte los transductores de presión hidrostática a las líneas de transductores conectadas al amplificador de puente multicanal.</li>
		<li>Conecte una jeringa de 30 ml llena de aire al puerto lateral del transductor de presión CH1 (ICP). Conecte el esfigmomanómetro a la parte inferior del transductor de presión CH1 (ICP).</li>
		<li>En el gráfico, vea la página del software de adquisición de datos, establezca la velocidad de muestreo haciendo clic con el botón izquierdo en la flecha junto al tiempo de muestreo y seleccione 100. A continuación, haga clic con el botón derecho en el área CH1 (ICP) de la página.</li>
		<li>Seleccione Amplificador de puente. Seleccione Filtro de red. Seleccione Cero y espere a que el sistema se ponga a cero, teniendo cuidado de no mover el transductor de presión.</li>
		<li>Pellizque las pestañas blancas del transductor de presión y empuje el aire a través del transductor hasta obtener 40 mmHg en el esfigmomanómetro. Suelte las pestañas blancas y retire la jeringa y el esfigmomanómetro.</li>
		<li>En la página Conversión de unidades , seleccione el signo 'menos (-)'. Resalte la meseta más alta para indicar 40 mmHg. Haga clic en la flecha del punto 1 e introduzca 40.</li>
		<li>Resalte la meseta más baja para indicar 0 mmHg. Haga clic en la flecha del punto 2 e introduzca 0. Seleccione mmHg para las unidades. Seleccione Aceptar.</li>
		<li>Seleccione Aceptar (página Amplificador de puente). Repita los pasos 9.1–9.7 para CH2 (IOP) usando 100 mmHg para la meseta más alta y 0 para la meseta más baja.</li>
	</ol></li>
	<li>Conecte la unidad de segmento TAS/posterior al sistema de adquisición de datos.<ol>
<li>Coloque la unidad TAS/segmento posterior en una incubadora (37 °C, 5% co2). Conecte el tubo ICP desde el puerto OUT al transductor de presión CH1 (ICP).</li>
		<li>Conecte el tubo IOP del puerto OUT al transductor de presión CH2 (IOP).</li>
		<li>Conecte las configuraciones de la jeringa (ICP e IOP) con medio desde los puertos IN hasta el soporte del anillo.</li>
		<li>En la página Vista de gráfico , seleccione Iniciar muestreo. Establezca la velocidad de muestreo haciendo clic con el botón izquierdo en la flecha junto al tiempo de muestreo y seleccione Lento y 1 min.</li>
		<li>Ajuste las jeringas en el soporte del anillo hacia arriba o hacia abajo para regular las presiones ICP e IOP según los requisitos del protocolo.</li>
		<li>Realice la reposición sistémica del medio en el sistema cada 48-72 h a través del método push and pull.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Recuperación y análisis de datos
<ol><li>Abra el archivo de datos en el software de adquisición de datos.</li>
	<li>En la sección Data Pad , haga clic en el icono Agregar múltiples al DataPad . Aparecerá una nueva ventana.<ol>
<li>En la sección Buscar usando , seleccione Hora en el menú desplegable.</li>
		<li>En la sección Seleccionar , seleccione 1 hora cada 1 hora en los menús desplegables.</li>
		<li>En la sección Paso a paso , seleccione Todo el archivo y, a continuación, haga clic en Agregar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En la sección Data Pad , haga clic en el icono Data Pad View . Resalte todos los datos y copie / pegue en una hoja de cálculo.</li>
	<li>Calcule la media y las desviaciones estándar para IOP, ICP y TLPG cada 24 h. Recopile los datos utilizando la opción de tabla dinámica en un programa de hoja de cálculo y un gráfico.</li>
</ol>7. Inmunohistoquímica y tinción de hematoxilina y eosina de segmentos posteriores
<ol><li>Retire los segmentos oculares posteriores siguiendo varios puntos de tiempo del modelo TAS y fije la formalina antes de parafinar.</li>
	<li>Seccionar los ojos para producir planos de tejido sagital.</li>
	<li>Desparafinar los segmentos incrustados en parafina con una solución 100% xileno, 95% etanol, 50% etanol.</li>
	<li>Lave los portaobjetos con PBS durante 10 minutos y bloquee con un tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Etiquete las secciones con anticuerpos primarios: anticolágeno IV (marcador de matriz extracelular (ECM), NB120-6586, 1:100) y antilaminina (marcador ECM, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (marcador RGC), GTX118619, 1:50).</li>
	<li>Detectar los anticuerpos primarios utilizando anticuerpos secundarios Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo, A11008, 1:500).</li>
	<li>Contramante los núcleos celulares utilizando la solución antidesvanecimiento DAPI.</li>
	<li>Capture imágenes de las secciones teñidas e imágenes de fase con lentes de objetivo 4x y 10x utilizando un microscopio de fluorescencia (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E), procese las secciones en un sistema de tinción automatizado (consulte la Tabla de materiales) para la desparafinación utilizando una solución de etanol 100%, xileno al 95%, etanol al 50% y manche con H&E.</li>
	<li>Capture imágenes con las lentes de objetivos 4x y 10x utilizando un microscopio con una fuente de luz de campo brillante.</li>
</ol>

Los autores del manuscrito no tienen conflictos de intereses potenciales que revelar.

Los tejidos postmortem humanos son un recurso especialmente valioso para el estudio de las enfermedades neurodegenerativas humanas porque la identificación de posibles fármacos desarrollados en modelos animales debe ser traducible a humanos47. Los efectos de la elevación de la PIO humana están bien establecidos, pero se ha realizado una investigación mínima sobre los cambios anormales de presión translaminar de ONH. A pesar de que existen múltiples modelos animales y modelos finitos de ONH humana,...

Las estimaciones mundiales en encuestas recientes sugieren que 285 millones de personas viven con discapacidad visual, incluidos 39 millones que son ciegos1. En 2010, la Organización Mundial de la Salud documentó que tres de las nueve principales causas de ceguera enumeradas ocurren en el segmento posterior del ojo1. Las enfermedades oculares del segmento posterior involucran la retina, la coroides y el nervio óptico2. La retina y el nervio óptico son extensiones del sistema nervioso central (SNC) del cerebro. Los axones de células ganglionares de la retina (RGC) son vulnerables al daño porque salen del ojo a través de la cabeza del nervio óptico (ONH) para formar el nervio óptico3. El ONH sigue siendo el punto más vulnerable para los axones RGC debido a la malla 3D de haces de tejido conectivo llamada lámina cribrosa (LC)4. La ONH es el sitio inicial de insulto a los axones RGC en glaucoma5,6,7, y se han estudiado cambios en la expresión génica dentro de la ONH en modelos de hipertensión ocular y glaucoma8,9,10. Los axones RGC son susceptibles en la ONH debido a los diferenciales de presión entre el compartimento intraocular, llamado presión intraocular (PIO), y dentro del espacio subaracnoideo perióptico externo, llamado presión intracraneal (ICP)11. La región LC separa ambas áreas, manteniendo diferenciales de presión normales, con PIO que oscila entre 10 y 21 mmHg y PIC desde 5-15 mmHg12. La diferencia de presión a través de la lámina entre las dos cámaras se denomina gradiente de presión translaminar (TLPG)13. Un factor de riesgo importante del glaucoma es la PIO14 elevada.
El aumento de la PIO aumenta la tensión dentro y a través de la región laminar6,15,16. Observaciones experimentales en humanos y modelos animales presentan la ONH como el sitio inicial del daño axonal17,18. El paradigma biomecánico del estrés y la tensión relacionados con la PIO que causan daños glaucomatosos en la ONH también influye en la fisiopatología del glaucoma19,20,21. Aunque en humanos los cambios inducidos por la presión dañan mecánicamente los axones RGC22, los roedores que carecen de placas colágenas dentro de la lámina también pueden desarrollar glaucoma7,23. Además, la PIO elevada sigue siendo el factor de riesgo más prominente en los pacientes con glaucoma primario de ángulo abierto, mientras que los pacientes con glaucoma de tensión normal desarrollan neuropatía óptica glaucomatosa incluso sin PIO elevada. Además, también hay un subconjunto de pacientes hipertensos oculares que no muestran daño en el nervio óptico. También se ha sugerido que la presión del líquido cefalorraquídeo (CSFp) puede desempeñar un papel en la patogénesis del glaucoma. La evidencia indica que la PIC se reduce a ~5 mmHg en pacientes con glaucoma en comparación con individuos normales, lo que provoca un aumento de la presión translaminar y juega un papel crucial en la enfermedad24,25. Anteriormente, se demostró en un modelo canino, que al controlar los cambios de IOP y CSFp, puede haber grandes desplazamientos del disco óptico26. La elevación de la CSFp en los ojos porcinos también ha mostrado un aumento de la tensión principal dentro de la región LC y el tejido neural retrolaminar. El aumento de la tensión en los RGC y la región LC contribuye al bloqueo del transporte axonal y a la pérdida de RGC27. La degeneración progresiva de las RGC se ha asociado con pérdida de soporte trófico28,29, estimulación de procesos inflamatorios/regulación inmune30,31 y efectores apoptóticos29,32,33,34,35. Además, la lesión axonal (Figura 3) causa efectos perjudiciales sobre las RGC, desencadenando el fracaso regenerativo36,37,38,39. A pesar de que los efectos de la PIO han sido bien estudiados, se han realizado investigaciones mínimas sobre los cambios anormales de presión translaminar. La mayoría de los tratamientos para el glaucoma se centran en estabilizar la PIO. Sin embargo, a pesar de que la disminución de la PIO ralentiza la progresión de la enfermedad, no revierte la pérdida del campo visual y previene la pérdida completa de RGC. Comprender los cambios neurodegenerativos relacionados con la presión en el glaucoma será crucial para prevenir la muerte por RGC.
La evidencia actual indica que las modulaciones de presión translaminar debido a diversos cambios mecánicos, biológicos o fisiológicos en pacientes que sufren de discapacidades visuales traumáticas o neurodegenerativas pueden causar una pérdida significativa de la visión. Actualmente, no existe un verdadero modelo preclínico del segmento posterior humano que pueda permitir el estudio del daño biomecánico glaucomatoso dentro de la ONH humana ex vivo. La observación y el tratamiento del segmento posterior del ojo es un gran reto en oftalmología27. Existen barreras físicas y biológicas para atacar el ojo posterior, incluyendo altas tasas de eliminación, barrera sangre-retina y posibles respuestas inmunológicas40. La mayoría de las pruebas de eficacia y seguridad para nuevos objetivos farmacológicos se realizan utilizando modelos celulares e in vivo in vitro41. La anatomía ocular es compleja, y los estudios in vitro no imitan con precisión las barreras anatómicas y fisiológicas presentadas por los sistemas de modelos de tejidos. A pesar de que los modelos animales son una necesidad para los estudios farmacocinéticos, la fisiología ocular del ojo posterior humano puede variar entre varias especies animales, incluida la anatomía celular de la retina, la vasculatura y la ONH41,42.
El uso de animales vivos requiere regulaciones éticas intensivas y detalladas, un alto compromiso financiero y una reproducibilidad efectiva43. Recientemente, se han seguido muchas otras directrices para el uso ético de animales en la investigación experimental44,45,46. Una alternativa a las pruebas con animales es el uso de modelos de ojo humano ex vivo para investigar la patogénesis de la enfermedad y el análisis potencial de medicamentos para proteger el daño de LA ONH. El tejido postmortem humano es un recurso valioso para el estudio de los paradigmas de las enfermedades humanas, especialmente en el caso de las enfermedades neurodegenerativas humanas, porque la identificación de fármacos potenciales desarrollados en modelos animales requiere la necesidad de ser traducibles a los humanos47. El tejido donante humano ex vivo se ha utilizado ampliamente para el estudio de trastornos humanos47,48,49, y los sistemas de cultivo de órganos de perfusión del segmento anterior humano han proporcionado previamente un modelo ex vivo único para estudiar la fisiopatología de la PIO elevada50,51,52.
Para estudiar la presión translaminar relacionada con la PIO y la PIC en los ojos humanos, diseñamos y desarrollamos con éxito un sistema autónomo translaminar (TAS) de dos cámaras que puede regular de forma independiente la PIO y la PIC utilizando segmentos posteriores de los ojos de donantes humanos. Es el primer modelo humano ex vivo que estudia la presión translaminar y explota los efectos biomecánicos del TLPG en la ONH.
Este modelo de TAS humano ex vivo se puede utilizar para descubrir y clasificar las modificaciones celulares y funcionales que ocurren debido a la elevación crónica de la PIO o ICP. En este informe, detallamos el protocolo paso a paso de disección, configuración y monitoreo del modelo de segmento posterior humano TAS. El protocolo permitirá a otros investigadores reproducir eficazmente este nuevo modelo de segmento posterior humano presurizado ex vivo para estudiar la patogénesis de enfermedades biomecánicas.

<table><tbody><tr><td>#122, 1-1/8" interior x 1-5/16" de diámetro exterior, junta tórica de Viton, 3/32" de grosor, 755 Durómetro Paquete de 50</td><td>Amazon</td><td>B07DRGPPZJ</td><td></td></tr><tr><td>114 Junta tórica Buna-N, durómetro de 70A, negro, 5/8" de diámetro interior, 13/16" de diámetro exterior, 3/32" de ancho (paquete de 100)</td><td>Amazon</td><td>B000FMYRHK</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Jeringas sin aguja</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>Llave de paso de 3 vías, 2 cerraduras Luer hembra, cerradura Luer macho giratoria, tapa ventilada</td><td>QOSINA</td><td>2C6201</td><td></td></tr><tr><td>4-40 x 1/2 PH PAN MS SS/CHROME y destornillador Phillips de tamaño adecuado</td><td>Brikksen Sujetadores de acero inoxidable</td><td>PPMSSSCH4C.5</td><td>&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td>ANPROLENE 16 LARGE AMPULE</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9085343</td><td>&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>PUR1815001EACH</td><td><fuerte>&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td>Corning 100 x 20 mm placas de cultivo de tejidos tratadas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167-100EA</td><<td>strong>&nbsp; </fuerte></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Solución de L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 3033 Esponja de gasa de curity , 4" x 4", 12 capas, estéril, 1200/CS</td><td>Med Plus Medical Supply</td><td>COV-3033-CS</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de vendaje delicadas curvadas (dentadas)</td><td>Katena</td><td>K5-4010</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinzas finas</td><td>F.S.T.</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de ojo</td> estándar <td>curvadas Katena</td><td>K4-7410</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 150 x 15mm Placas de Petri Desechables Estériles Lisas Capitol</td><td>Scientific</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 4 oz. Contenedores de muestras</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-320-730</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Bolsas de esterilización de sellado instantáneo</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Bolsas de esterilización de sellado instantáneo</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-55</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Bolsas de esterilización de sellado instantáneo</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-58</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3024302</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicilina Estreptomicina 100X Solución</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Hidrofílico con Entrada Luer Lock Hembra, Salida de Deslizamiento Luer Macho, Azul y Transparente</td><td>Qosina</td><td>28217</td><td></td></tr><tr><td>Transductores de presión hidrostática, DELTRAN &reg; II, Catálogo # DPT-200 con un caudal de 3CC/HR</td><td>AD instruments</td><td>DPT-200</td><td></td></tr><tr><td>JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Punta Dispensadora 50/Caja</td><td>Jenson Global</td><td>JG15-0.5HPX 15</td><td></td></tr><tr><td>Keyence B2? Microscopio X710</td><td>Keyence</td><td>B2-X710</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8</td><td>AD instruments</td><td>LabChart 8</td><td></td></tr><tr><td>Leica ST5020 Multi-stainer</td><td>Leica</td><td>ST5020</td><td></td></tr><tr><td>Tapa Luer Universal No Ventilada, Blanco</td><td>QOSINA</td><td>65811</td><td></td></tr><tr><td>Octal Bridge Amp (Modelo # FE228)</td><td>AD instruments</td><td>FE228</td><td></td></tr><tr><td>Productos Pharmco ALCOHOL ETÍLICO, 200 DE PRUEBA</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1675398</td><td></td></tr><tr><td>Solución tamponada de fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35 (Modelo # PL3508)</td><td>AD instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Montaje antidecoloración con DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio de tubo de conexión a presión para aire y agua&nbsp; Adaptador recto, tubo de 1/8" de diámetro exterior x 1/8 NPT macho</td><td>McMAster-Carr</td><td>7880T113</td><td></td></tr><tr><td>Accesorio de tubo de conexión a presión con rosca universal&nbsp; para Aire y Agua, Adaptador, Tubo de 1/8" OD x Tubo de 1/8</td><td>McMAster-Carr</td><td>51235K101</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Tubo Flexible 500 ft.</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-268</td><td></td></tr><tr><td>Superblock T20</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI37536</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas - afiladas y romas</td><td>F.S.T.</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Tejido Delicado 1x2 Dientes Curvos</td><td>Katena</td><td>K5-4110</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Autónomo Translaminar (TAS)</td><td>Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad del Norte de Texas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>EE. UU. Tamaño 030 Junta tórica Buna-N, B1000, 70 Durómetro, Negro, Buna-N (NBR, Nitrilo, Buna)</td><td>Marco Rubber & Plásticos</td><td>B1000-030</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos

Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments

Existe una necesidad insatisfecha actual de un nuevo modelo humano preclínico que pueda dirigirse a la etiología de la enfermedad ex vivo utilizando la presión intracraneal (PIC) y la presión intraocular (PIO) que pueda identificar varios paradigmas patógenos relacionados con la patogénesis del glaucoma. Los modelos de cultivo de órganos de perfusión del segmento anterior humano ex vivo se han utilizado y aplicado con éxito como tecnologías efectivas para el descubrimiento de la patogénesis del glaucoma y las pruebas terapéuticas. El cribado preclínico de fármacos y la investigación realizada en sistemas de órganos humanos ex vivo pueden ser más traducibles a la investigación clínica. Este artículo describe en detalle la generación y el funcionamiento de un nuevo modelo de presión translaminar humana ex vivo llamado sistema autónomo translaminar (TAS). El modelo TAS puede regular de forma independiente la PIC y la PIO utilizando segmentos posteriores de donantes humanos. El modelo permite estudiar la patogénesis de manera preclínica. Puede reducir el uso de animales vivos en la investigación oftálmica. A diferencia de los modelos experimentales in vitro, la estructura, complejidad e integridad del tejido de la cabeza del nervio óptico (ONH) también se pueden mantener dentro del modelo TAS ex vivo.

Diseño y creación del sistema autónomo translaminar El diferencial de presión translaminar es un mecanismo clave potencial en la patogénesis de diversas enfermedades, incluido el glaucoma. Los usos para el modelo descrito incluyen, pero no se limitan a, el estudio del glaucoma (PIO elevada, tal vez disminución de la PIC), lesión cerebral traumática (PIC elevada) y exposición a largo plazo a la discapacidad visual asociada a la microgravedad (PIC elevada, PIO elevada). Para ayudar a descubrir la patogé...

Describimos y detallamos el uso del sistema autónomo translaminar. Este sistema utiliza el segmento posterior humano para regular independientemente la presión dentro del segmento (intraocular) y que rodea el nervio óptico (intracraneal) para generar un gradiente de presión translaminar que imita las características de la neuropatía óptica glaucomatosa.

Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular ...

Este novedoso sistema autónomo translaminar ocular utiliza el segmento posterior humano para regular de forma independiente las presiones intraoculares e intracraneales para generar un gradiente de presión translaminar. El modelo TAS permite evaluar la presión intracraneal humana de forma preclínica ex vivo que anteriormente no podía ser estudiada. Este modelo podría utilizarse para estudiar enfermedades como el glaucoma, la lesión cerebral traumática, la hipertensión intracraneal idiopática y el síndrome neuroocular asociado a los vuelos espaciales.Para configurar las jeringas de entrada, cargue la jeringa de 30 mililitros con 30 mililitros del líquido de perfusión de interés y conecte una llave de tope de tres vías a la jeringa. Conecte un filtro hidrofílico de 0,22 micrómetros a la llave de paso y conecte un adaptador de talón luer de calibre 15 al filtro hidrófilo de 0,22 micrómetros. Después de quitar las burbujas de aire de la configuración de la jeringa, conecte el tubo al adaptador de talón luer y cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación.Después de configurar una segunda jeringa de entrada como se acaba de demostrar, etiquete un canal de jeringa como ICP y etiquete el otro canal de jeringa como dos IOP. A continuación, configure las jeringas de salida como se acaba de demostrar, pero sin cargar las jeringas con el medio de infusión. Para preparar una muestra de globo ocular humano completo, retire la vaina del nervio óptico y elimine el humor vítreo del segmento posterior.Para asegurar un buen ajuste en la cúpula redonda de la cámara de PIO, recorte la esclerótica adicional del segmento posterior según sea necesario, y use fórceps para asegurarse de que la retina se extienda uniformemente sobre la parte posterior humana del segmento. A continuación, coloque el segmento en la cámara de PIO del TAS sobre la cúpula redonda con el nervio óptico hacia arriba, y utilice una junta tórica de resina epoxi y cuatro tornillos para sellar el segmento posterior. Para configurar la cámara de PIO, inserte el tubo en los puertos de entrada y salida de la cámara e inserte la jeringa de entrada de PIO en el puerto de entrada.Inserte la configuración de jeringa de salida de IOP vacía en el puerto de salida y use el método de empuje / tracción para infundir lentamente el medio de perfusión en el puerto de entrada para llenar la copa del ojo posterior, mientras simultáneamente tira lentamente del medio de perfusión a través de la jeringa de salida para eliminar cualquier burbuja de aire de las vías. Una vez que los tubos de entrada y salida estén libres de burbujas de aire, detenga la infusión y bloquee las llaves de parada en la posición de apagado. Retire la jeringa del conjunto de filtro IOP en el puerto y vuelva a llenar la jeringa con 30 milímetros adicionales de medio, luego vuelva a insertar la configuración de la jeringa en el conjunto del filtro.Para configurar la cámara ICP, coloque la cámara sobre la parte posterior del segmento posterior, teniendo cuidado de que el nervio óptico esté dentro de la cámara superior, y selle la cámara superior con cuatro tornillos, luego inserte el tubo en los puertos de entrada y salida de la cámara ICP, la jeringa de entrada ICP en el puerto de entrada, y la jeringa de salida ICP vacía en el puerto de salida para enjuagar el sistema con medio como se acaba de demostrar. Para configurar el sistema de grabación de datos, encienda la fuente de alimentación de ocho canales y la computadora, e inicie el software de adquisición de datos. Seleccione Archivo y Nuevo y seleccione Configuración y configuración de canal.Seleccione tres canales y cambie el nombre de los canales como se indica. Seleccione dos milivoltios para el rango en todos los canales y, en la columna Cálculo, seleccione Sin cálculo para los canales uno y dos. Seleccione Aritmética para el canal tres En la ventana Fórmula, en Canales, seleccione 2 canales.En Función, seleccione Matemáticas y menos, y en Canales, seleccione Canal 1. Para configurar y calibrar los transductores de presión hidrostática, conecte los transductores de presión hidrostática a las líneas de transductores conectadas al amplificador de puente multicanal y conecte una jeringa vacía de 30 mililitros al puerto lateral del transductor de presión ICP de canal uno. Conecte un esfigmomanómetro a la parte inferior del transductor de presión ICP del canal uno y haga clic en la flecha junto al tiempo de muestreo para establecer la velocidad de muestreo en 100.Seleccione Bridge Amp, Mains filter y Zero, y espere a que el sistema se ponga a cero, teniendo cuidado de no mover el transductor de presión. A continuación, pellizque las lengüetas blancas del transductor de presión y empuje el aire a través del transductor hasta obtener 40 milímetros de mercurio en el esfigmomanómetro, luego suelte las lengüetas blancas y retire la jeringa y el esfigmomanómetro. En la página Conversión de unidades, seleccione menos y resalte la meseta más alta para indicar 40 milímetros de mercurio.Haga clic en la flecha de 0,1, escriba 100 y resalte la meseta más baja para indicar cero milímetros de mercurio. Haga clic en la flecha de 0,2, escriba cero, seleccione milímetros de mercurio para las unidades y haga clic en Aceptar. En la ventana Bridge Amp, haga clic en Aceptar y calibre los transductores de presión hidrostática para IOP del canal dos como se acaba de demostrar, utilizando 100 milímetros de mercurio para la meseta más alta y cero para la meseta más baja.Para conectar la unidad de segmento posterior TAS al sistema de adquisición de datos, coloque la unidad de segmento posterior TAS en una incubadora de dióxido de carbono al 5% de 37 grados Celsius y conecte el tubo ICP desde el puerto de salida del transductor de presión ICP de canal uno. Conecte el tubo IOP desde el puerto de salida al transductor de presión IOP del canal dos. En la página Vista de gráfico, seleccione Iniciar muestreo y establezca la velocidad de muestreo en Lento y un minuto.A continuación, ajuste las jeringas en el soporte del anillo hacia arriba o hacia abajo para regular las presiones de ICP y IOP de acuerdo con los requisitos del protocolo, o colóquelas en bombas de perfusión para regular la presión. En este análisis representativo, se probó el mantenimiento de los diferenciales de presión normal promedio en ambas cámaras a través de diversos parámetros de las condiciones de PIO e PIC. Para asegurar la viabilidad del tejido, el medio en el tejido se intercambió cada 48 horas.Se produjeron aumentos mínimos de presión en el momento del intercambio del medio, y no afectaron la viabilidad o morfología de la cabeza del nervio óptico como se observó en el análisis inmunohistoquímico y la expresión de colágeno IV en los días 14 y 30 del experimento. El aumento de la PIO o la disminución de la PIC en varios puntos de tiempo permite mantener un rango en gradiente de presión translaminar elevado durante siete días. A los siete días de gradiente de presión translaminar elevado, se observaron ahuecamientos y engrosamiento en los segmentos posteriores, y la expresión de colágeno IV muestra haces engrosados con una mayor expresión de señales durante el período experimental.Las imágenes de fase revelan células ganglionares de la retina sanas dentro de la capa de células ganglionares sin ahuecamiento en los segmentos de control, mientras que las imágenes de cultivos con gradiente de presión translaminar elevado exhiben un ahuecamiento extenso sin células ganglionares de la retina dentro de la capa de fibras nerviosas de la retina y una mayor remodelación de la matriz extracelular. Esta técnica permitirá a los investigadores estudiar de manera efectiva los paradigmas de enfermedades biomecánicas y descubrir la presión translaminar dirigida a la patogénesis molecular en el ojo humano.

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Fuente: Sharma, T. P., et al., Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos. J. Vis. Exp. (2020). Este video muestra el procedimiento de preparación de un ojo humano para estudiar los efectos de la presión translaminar en la señalización de las células ganglionares de la retina mediante la simulación de presiones intraoculares e intracraneales en un sistema autónomo translaminar.

 Desarrollo de un modelo de presión translaminar utilizando un sistema autónomo translaminar

El modelo experimental de hemorragia subaracnoidea (HSA) con derivación de sangre intracraneal controlada por presión en el conejo combina los procedimientos estándar: canulación de la arteria subclavia y punción transcutánea de cisterna magna, lo que permite imitar de cerca las condiciones fisiopatológicas humanas después de la HSA. Presentamos instrucciones paso a paso y discutimos los puntos quirúrgicos clave para la creación exitosa de SAH experimental.

El Conejo Modelo Blood-shunt para el Estudio de la aguda y secuelas tardías de Hemorragia subaracnoidea: Aspectos Técnicos

Malla trabecular (TM) la migración al espacio del canal de Schlemm se puede inducir por elevación de la presión aguda por ophthalmodynamometer, y observado por dominio espectral tomografía de coherencia óptica. El objetivo de este método es cuantificar la respuesta morfométrico del tracto de salida vivir a elevación de la presión aguda en los tejidos vivos in situ.

Trabecular Respuesta malla de elevación de la presión en el Living Ojo humano

La hipertensión ocular crónica se induce mediante la aplicación de una sutura de circumlimbal en ratas y ratones, llevando al deterioro funcional y estructural de las células ganglionares de la retina compatibles con glaucoma.

Un modelo de Glaucoma inducido por sutura de Circumlimbal en ratas y ratones

El primate no humano (NHP) es un modelo ideal para estudiar la terapéutica celular de la retina humana debido a las similitudes anatómicas y genéticas. Este manuscrito describe un método para el trasplante submacular de células epiteliales pigmentarias de la retina en el ojo NHP y estrategias para prevenir las complicaciones intraoperatorias asociadas con la manipulación macular.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Las lesiones oculares de globo abierto pueden no tratarse durante varios días en escenarios rurales o militares relevantes, lo que resulta en ceguera. Se necesitan terapias para minimizar la pérdida de visión. Aquí, detallamos un modelo de lesión de globo abierto de cultivo de órganos. Con este modelo, las posibles terapias para estabilizar estas lesiones pueden evaluarse adecuadamente.

Plataforma de cultivo de órganos del segmento anterior para el seguimiento de lesiones de globo abierto y rendimiento terapéutico

El objetivo de este protocolo es caracterizar un nuevo modelo de neurodegeneración glaucomatosa basado en la cauterización térmica de 360° del plexo vascular limbal, induciendo hipertensión ocular subaguda.

Cauterización de círculo completo del plexo vascular limbal para el glaucoma inducido quirúrgicamente en roedores

Este protocolo presenta un abordaje transescleral transpupilar guiado por visión para administrar de forma segura y precisa injertos celulares subretinianos, con una baja tasa de complicaciones quirúrgicas, en receptores de ratón con o sin degeneración retiniana.

Trasplante transescleral guiado por transpupilar de injertos subretinianos en un modelo de ratón con degeneración retiniana

Hemos establecido un protocolo para la inducción de los neuroblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de progenitores neuronales humanos y los tipos de células neuronales en el desarrollo del SNC para la reparación neural.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Describimos un protocolo para el marcaje in vivo de neuronas sensoriales olfativas mediante electroporación y posterior escaneo láser confocal o microscopía multifotónica para visualizar la morfología neuronal y su desarrollo a lo largo del tiempo.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología En Vivo

Aprende a utilizar el sistema translaminar autónomo ocular para regular presiones intraocular e intracraneal en segmentos posteriores humanos. Este modelo permite estudiar mecanismos de glaucoma y neuropatía óptica de manera preclínica ex vivo.

Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos (Video) | JoVE Journal

Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos

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