Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos

Este novedoso sistema autónomo translaminar ocular utiliza el segmento posterior humano para regular de forma independiente las presiones intraoculares e intracraneales para generar un gradiente de presión translaminar. El modelo TAS permite evaluar la presión intracraneal humana de forma preclínica ex vivo que anteriormente no podía ser estudiada. Este modelo podría utilizarse para estudiar enfermedades como el glaucoma, la lesión cerebral traumática, la hipertensión intracraneal idiopática y el síndrome neuroocular asociado a los vuelos espaciales.

Para configurar las jeringas de entrada, cargue la jeringa de 30 mililitros con 30 mililitros del líquido de perfusión de interés y conecte una llave de tope de tres vías a la jeringa. Conecte un filtro hidrofílico de 0,22 micrómetros a la llave de paso y conecte un adaptador de talón luer de calibre 15 al filtro hidrófilo de 0,22 micrómetros. Después de quitar las burbujas de aire de la configuración de la jeringa, conecte el tubo al adaptador de talón luer y cierre el puerto lateral de la llave de paso con una tapa de bloqueo universal sin ventilación.

Después de configurar una segunda jeringa de entrada como se acaba de demostrar, etiquete un canal de jeringa como ICP y etiquete el otro canal de jeringa como dos IOP. A continuación, configure las jeringas de salida como se acaba de demostrar, pero sin cargar las jeringas con el medio de infusión. Para preparar una muestra de globo ocular humano completo, retire la vaina del nervio óptico y elimine el humor vítreo del segmento posterior.

Para asegurar un buen ajuste en la cúpula redonda de la cámara de PIO, recorte la esclerótica adicional del segmento posterior según sea necesario, y use fórceps para asegurarse de que la retina se extienda uniformemente sobre la parte posterior humana del segmento. A continuación, coloque el segmento en la cámara de PIO del TAS sobre la cúpula redonda con el nervio óptico hacia arriba, y utilice una junta tórica de resina epoxi y cuatro tornillos para sellar el segmento posterior. Para configurar la cámara de PIO, inserte el tubo en los puertos de entrada y salida de la cámara e inserte la jeringa de entrada de PIO en el puerto de entrada.

Inserte la configuración de jeringa de salida de IOP vacía en el puerto de salida y use el método de empuje / tracción para infundir lentamente el medio de perfusión en el puerto de entrada para llenar la copa del ojo posterior, mientras simultáneamente tira lentamente del medio de perfusión a través de la jeringa de salida para eliminar cualquier burbuja de aire de las vías. Una vez que los tubos de entrada y salida estén libres de burbujas de aire, detenga la infusión y bloquee las llaves de parada en la posición de apagado. Retire la jeringa del conjunto de filtro IOP en el puerto y vuelva a llenar la jeringa con 30 milímetros adicionales de medio, luego vuelva a insertar la configuración de la jeringa en el conjunto del filtro.

Para configurar la cámara ICP, coloque la cámara sobre la parte posterior del segmento posterior, teniendo cuidado de que el nervio óptico esté dentro de la cámara superior, y selle la cámara superior con cuatro tornillos, luego inserte el tubo en los puertos de entrada y salida de la cámara ICP, la jeringa de entrada ICP en el puerto de entrada, y la jeringa de salida ICP vacía en el puerto de salida para enjuagar el sistema con medio como se acaba de demostrar. Para configurar el sistema de grabación de datos, encienda la fuente de alimentación de ocho canales y la computadora, e inicie el software de adquisición de datos. Seleccione Archivo y Nuevo y seleccione Configuración y configuración de canal.

Seleccione tres canales y cambie el nombre de los canales como se indica. Seleccione dos milivoltios para el rango en todos los canales y, en la columna Cálculo, seleccione Sin cálculo para los canales uno y dos. Seleccione Aritmética para el canal tres En la ventana Fórmula, en Canales, seleccione 2 canales.

En Función, seleccione Matemáticas y menos, y en Canales, seleccione Canal 1. Para configurar y calibrar los transductores de presión hidrostática, conecte los transductores de presión hidrostática a las líneas de transductores conectadas al amplificador de puente multicanal y conecte una jeringa vacía de 30 mililitros al puerto lateral del transductor de presión ICP de canal uno. Conecte un esfigmomanómetro a la parte inferior del transductor de presión ICP del canal uno y haga clic en la flecha junto al tiempo de muestreo para establecer la velocidad de muestreo en 100.

Seleccione Bridge Amp, Mains filter y Zero, y espere a que el sistema se ponga a cero, teniendo cuidado de no mover el transductor de presión. A continuación, pellizque las lengüetas blancas del transductor de presión y empuje el aire a través del transductor hasta obtener 40 milímetros de mercurio en el esfigmomanómetro, luego suelte las lengüetas blancas y retire la jeringa y el esfigmomanómetro. En la página Conversión de unidades, seleccione menos y resalte la meseta más alta para indicar 40 milímetros de mercurio.

Haga clic en la flecha de 0,1, escriba 100 y resalte la meseta más baja para indicar cero milímetros de mercurio. Haga clic en la flecha de 0,2, escriba cero, seleccione milímetros de mercurio para las unidades y haga clic en Aceptar. En la ventana Bridge Amp, haga clic en Aceptar y calibre los transductores de presión hidrostática para IOP del canal dos como se acaba de demostrar, utilizando 100 milímetros de mercurio para la meseta más alta y cero para la meseta más baja.

Para conectar la unidad de segmento posterior TAS al sistema de adquisición de datos, coloque la unidad de segmento posterior TAS en una incubadora de dióxido de carbono al 5% de 37 grados Celsius y conecte el tubo ICP desde el puerto de salida del transductor de presión ICP de canal uno. Conecte el tubo IOP desde el puerto de salida al transductor de presión IOP del canal dos. En la página Vista de gráfico, seleccione Iniciar muestreo y establezca la velocidad de muestreo en Lento y un minuto.

A continuación, ajuste las jeringas en el soporte del anillo hacia arriba o hacia abajo para regular las presiones de ICP y IOP de acuerdo con los requisitos del protocolo, o colóquelas en bombas de perfusión para regular la presión. En este análisis representativo, se probó el mantenimiento de los diferenciales de presión normal promedio en ambas cámaras a través de diversos parámetros de las condiciones de PIO e PIC. Para asegurar la viabilidad del tejido, el medio en el tejido se intercambió cada 48 horas.

Se produjeron aumentos mínimos de presión en el momento del intercambio del medio, y no afectaron la viabilidad o morfología de la cabeza del nervio óptico como se observó en el análisis inmunohistoquímico y la expresión de colágeno IV en los días 14 y 30 del experimento. El aumento de la PIO o la disminución de la PIC en varios puntos de tiempo permite mantener un rango en gradiente de presión translaminar elevado durante siete días. A los siete días de gradiente de presión translaminar elevado, se observaron ahuecamientos y engrosamiento en los segmentos posteriores, y la expresión de colágeno IV muestra haces engrosados con una mayor expresión de señales durante el período experimental.

Las imágenes de fase revelan células ganglionares de la retina sanas dentro de la capa de células ganglionares sin ahuecamiento en los segmentos de control, mientras que las imágenes de cultivos con gradiente de presión translaminar elevado exhiben un ahuecamiento extenso sin células ganglionares de la retina dentro de la capa de fibras nerviosas de la retina y una mayor remodelación de la matriz extracelular. Esta técnica permitirá a los investigadores estudiar de manera efectiva los paradigmas de enfermedades biomecánicas y descubrir la presión translaminar dirigida a la patogénesis molecular en el ojo humano.