Name: Inducción de células leptomeningeales Modificación a través de inyección intraciternal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprende una técnica de inyección intraciternal con aguja curvada para editar genes en células leptomeníngeas de ratones transgénicos. Este método minimiza daño tisular y permite rastrear el flujo de líquido cefalorraquídeo en estudios neurobiológicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo Sueco de Investigación, la Sociedad Sueca contra el Cáncer, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse y el Programa de Investigación Estratégica en Células Madre y Medicina Regenerativa en Karolinska Institutet (StratRegen).

Los procedimientos quirúrgicos presentados por la presente fueron aprobados por Stockholms Norra Djurf-rs-ksetiska N'mnd y llevados a cabo de acuerdo con las especificaciones proporcionadas por el Instituto de Investigación (Instituto Karolinska, Suecia).
NOTA: La inyección intracisternal se puede adaptar de forma flexible para múltiples fines de investigación. A continuación presentamos un procedimiento desarrollado para etiquetar eficientemente las células leptomeningeales para el mapeo del destino basado en la inyección de endoxifeno en una línea de ratón transgénica que transporta R26R-tdTomato12 y CreER, este último bajo el promotor Cx3013. El etiquetado de esta población de células puede lograrse mediante la inyección de construcciones virales utilizando el mismo procedimiento descrito a continuación. Finalmente, este enfoque se puede emplear para el seguimiento del flujo de líquido cefalorraquídeo, mediante la infusión de marcadores fluorescentes.
1. Preparación del sistema de inyección
NOTA: Recomendamos llevar a cabo el procedimiento en una sala quirúrgica adecuada, y en condiciones asépticas. Las herramientas quirúrgicas se pueden esterilizar con calor (autoclave, esterilizador de perlas de vidrio) o desinfectarse con un desinfectante químico de alto nivel si son sensibles al calor. Enjuague los instrumentos antes de usarlos cuando emplee la desinfección química o deje que se enfríen cuando estén desinfectados con calor.
<ol><li>Con fórceps, doble la aguja de la jeringa de inyección a 30o a 3 mm de la punta. NOTA: Utilice jeringas Hamilton con una aguja biselada de 30 G.</li>
	<li>Preparar 1 mg/ml de solución de endoxifeno, diluido en 10% DMSO y rellenar la jeringa con la aguja doblada. NOTA: Administrar 5 ml del compuesto para garantizar una exposición generalizada de las células meningeales en el ratón adulto C57Bl/6j (ca. 25-30 g), aunque pueden ser necesarios experimentos piloto que prueben diferentes concentraciones y volúmenes de inyección al tratar animales de diferentes edades y cepas.</li>
	<li>Ajuste el soporte del cabezal del ratón para que la boquilla esté aproximadamente a 30o de la superficie de la mesa quirúrgica. NOTA: Un marco estereotáctico con fijación de tres puntos (es decir, orejas y boca) también se puede utilizar para este procedimiento. En este caso, sin embargo, el animal sólo se fijará con la boquilla, mientras que las barras de oído se pueden extender debajo de las extremidades anteriores del animal y se utilizan para apoyar el cuerpo del animal durante el procedimiento.</li>
</ol>2. Inducción de la anestesia
<ol><li>Para los anestésicos inyectables, utilice las concentraciones y modos de administración recomendados por la unidad veterinaria de la institución local.</li>
	<li>Para anestésicos inhalatores, como el isoflurano, prepare la unidad de administración de acuerdo con las especificaciones del fabricante.</li>
	<li>Con isoflurano, establecer la concentración del compuesto en 4% para la inducción de la anestesia.</li>
	<li>Entregar aire a una velocidad de 400 ml/min.</li>
	<li>Deje que la unidad de anestesia llene la cámara con el anestésico durante unos minutos y coloque el ratón en la cámara después. NOTA: Para los experimentos actuales, hemos utilizado ratones transgénicos macho (>2 meses de edad y aproximadamente 30 g) macho y hembra que llevan Cx30-CreER y R26R-tdTomato, y criadosobre sobre un fondo C57Bl/6j.</li>
	<li>Monitoree al animal durante la inducción de la anestesia. El patrón de respiración debe disminuir la velocidad cuando el ratón está bajo anestesia completa.</li>
	<li>Retire el animal de la cámara y compruebe la supresión del reflejo de la pata pellizcando delicadamente las patas traseras. NOTA: El reflejo todavía puede estar presente, pero se retrasó un par de segundos. Si ese es el caso, coloque el animal de nuevo en la cámara hasta que se haya logrado la supresión completa del reflejo de la pata.</li>
	<li>Administrar analgésicos (p. ej., Carprofeno, 5 mg/kg a través de inyección subcutánea) para ayudar al manejo del dolor postoperatorio.</li>
</ol>3. Posicionamiento del Animal para el Procedimiento
<ol><li>Fije la cabeza del animal en el soporte de la cabeza. Para mejorar la accesibilidad a la cisterna magna, coloque el cuerpo del animal a aproximadamente 30o de la superficie de la mesa y la cabeza titulada hacia abajo, para establecer un ángulo de 120o con el resto del cuerpo y extender la parte posterior del cuello para facilitar el acceso a la cisterna magna (Figura 1A).</li>
	<li>Agregue toallas de papel debajo del animal para apoyar su cuerpo durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Asegurar el parto de anestesia a través de la boquilla y reducir la concentración de isoflurano al 2,5% y el suministro de aire a 200 ml/min.</li>
	<li>Aplicar pomada oftálmica.</li>
</ol>4. Exposición de la Cisterna Magna
<ol><li>Afeitar la parte posterior del cuello del animal y desinfectar la zona con 70% de etanol y betadina.</li>
	<li>Usando tijeras quirúrgicas, realice una incisión de línea media (aprox. 7 mm de longitud) comenzando a nivel del hueso occipital y extendiéndolo posteriormente.</li>
	<li>Separe suavemente los músculos superficiales del tejido conectivo y del cuello tirando lateralmente de la línea media con pinzas finas. Esto expondrá la membrana dural que se superpone a la cisterna magna, formada como un triángulo invertido.</li>
	<li>Utilice lanzas de absorción estériles o hisopos de algodón para controlar cualquier sangrado resultante.</li>
	<li>Coloque un pequeño separador quirúrgico para mantener los músculos del cuello retirados y permitir la visualización de la cisterna magna durante todo el procedimiento.</li>
</ol>5. Inyección intraciternal
<ol><li>Para acceder a la cisterna magna, identifique el extremo caudal del hueso occipital e inserte la aguja que previamente estaba doblada inmediatamente debajo. NOTA: Habrá una caída repentina de la resistencia a medida que se perfora la membrana dura. Sin embargo, la punta de la aguja sólo penetrará ligeramente debajo de la superficie meningeal, gracias a su forma enganchada.</li>
	<li>Una vez perforada la dura, permita que la punta doblada de la aguja penetre debajo de la superficie dura tirando suavemente de la jeringa hacia arriba y paralela al cuerpo del animal, con el fin de "enganchar" la aguja al cráneo (ver Figura 1B). Esto asegurará una mejor estabilidad y evitará que la aguja penetre más profundamente, evitando así el riesgo de dañar el cerebelo o la médula subyacentes.</li>
	<li>Inyectar el compuesto lentamente para evitar interferencias con el flujo natural del líquido cefalorraquídeo. NOTA: Dependiendo del propósito del experimento, la velocidad de perfusión puede variar. Si se requiere una velocidad de perfusión lenta y constante (por ejemplo, cuando se utiliza el procedimiento para rastrear el movimiento del líquido cefalorraquídeo), puede ser aconsejable utilizar un sistema de microinfusión automatizado en combinación con la jeringa.</li>
	<li>Después de la inyección, deje reposar la aguja en el lugar durante 1 min y retírela cuidadosamente. Utilice fórceps de punta fina para ayudar a la retracción de la aguja de su posición enganchada. NOTA: El uso de una aguja delgada (p. ej., 30 G) no conduce a daños sustanciales de la membrana meningeal, y la consiguiente salida del líquido cefalorraquídeo. Si se requieren tamaños de aguja más grandes, se recomienda detener la fuga de líquido aplicando presión en el lugar de inyección utilizando una punta de algodón estéril.</li>
</ol>6. Concluir el Procedimiento y la Atención Postoperatoria
<ol><li>Retire el separador y permita que los músculos vuelvan a su posición original superponiendo la membrana dura.</li>
	<li>Cierre la incisión cutánea con unas gotas de adhesivo de cianoacrilato. NOTA: Alternativamente, utilice suturas absorbibles (por ejemplo, suturas de 5-0 vicryl) y cierre la incisión cutánea con puntos interrumpidos.</li>
	<li>Aplicar anestesia local (p. ej., 100 ml de 5% de lidocaína) en el lugar de la incisión.</li>
	<li>Retire el animal del soporte y colóquelo en una jaula limpia colocada en una almohadilla de calentamiento. Monitorea al animal hasta que recupere la conciencia. NOTA: No se espera que el procedimiento cause dolor o angustia de larga duración en el animal. No obstante, el ratón debe ser monitorizado de cerca durante los primeros días postoperatorios y se pueden tomar medidas de alivio del dolor cuando se considere necesario, y de acuerdo con las recomendaciones proporcionadas por la unidad veterinaria de su institución.</li>
</ol>

<ol><li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li>
<li>Whish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+CSF-brain+barrier%3A+developmentally+controlled+access+to+the+brain+via+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 16(2015).</li>
<li>Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meninges+as+barriers+and+facilitators+for+the+movement+of+fluid%2C+cells+and+pathogens+related+to+the+rodent+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).</li>
<li>Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+morphogenic+signaling+initiated+by+the+meninges+controls+corpus+callosum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation.</a> Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139 (3), 597-609 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenic+Radial+Glia-like+Cells+in+Meninges+Migrate+and+Differentiate+into+Functionally+Integrated+Neurons+in+the+Neonatal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex.</a> Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).</li>
<li>De Bock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+angle+on+blood-CNS+interfaces%3A+a+role+for+connexins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?</a> FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).</li>
<li>Ramos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisterna+Magna+Injection+in+Rats+to+Study+Glymphatic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function.</a> Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).</li>
<li>Xavier, A. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannula+Implantation+into+the+Cisterna+Magna+of+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paravascular+pathway+facilitates+CSF+flow+through+the+brain+parenchyma+and+the+clearance+of+interstitial+solutes%2C+including+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li>
<li>Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+journey+into+the+brain%3A+insight+into+how+bacterial+pathogens+cross+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+intersectional+targeting+of+neural+sensors+and+effectors+with+high+specificity+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance.</a> Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).</li>
<li>Slezak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+for+conditional+gene+manipulation+in+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells.</a> Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).</li>
<li>Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+meningitidis+with+cells+of+the+human+meninges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges.</a> Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).</li>
<li>Colicchio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meningococcal+ABC-Type+L-glutamate+transporter+GltT+is+necessary+for+the+development+of+experimental+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).</li>
<li>Ricci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+matrix+metalloproteinases+attenuates+brain+damage+in+experimental+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses en competencia.

El protocolo descrito aquí presenta un procedimiento sencillo y reproducible para etiquetar células leptomeningeal es para la cartografía del destino. Utilizamos la inyección intracisternal de endoxifeno, un metabolito activo de tamoxifeno, para inducir la expresión del reportero fluorescente tdTomato en Cx30-CreER; R26R-tdTomato ratones12,13.
En comparación con otros protocolos utilizados para acceder al líquido cefalorraquídeo a trav...

Las células leptomeningeales son una población similar a los fibroblastos de células organizadas en una capa delgada que superpone el cerebro y expresa genes implicados en la reticulación de colágeno (por ejemplo, Dcn y Lum),y en el establecimiento de una barrera cerebro-meningeal (por ejemplo, Cldn11)1,2. Las células leptomeningeales están implicadas en una amplia gama de funciones fisiológicas, desde un estricto control sobre el drenaje del líquido cefalorraquídeo3 hasta la guía de progenitores neuronales en el cerebro en desarrollo4,5. Un estudio reciente también ha propuesto que los leptomeninges en el recién nacido pueden albergar células radiales similares a la glia que migran al parénquima cerebral y se convierten en neuronas corticales funcionales6.
Las células leptomeningeales se encuentran muy cerca de los astrocitos de superficie y comparten con ellos, así como otras astroglia parenquimales, expresión de connexina-30 (Cx30)7. El procedimiento quirúrgico descrito a continuación permite un etiquetado generalizado y específico de estas células meningeales a través de una entrega única de endoxifeno en la cisterna magna de ratones transgénicos que expresan condicionalmente tdTomato en Cx30+ células (es decir, utilizando un sistema CreER-loxP para la cartografía del destino). Endoxifeno es un metabolito activo de tamoxifeno e induce la recombinación de células que expresan CreER de la misma manera que el tamoxifeno. Es, sin embargo, la solución recomendada para la aplicación tópica porque se disuelve en 5-10% DMSO, en lugar de altas concentraciones de etanol. Además, el endoxifeno no cruza la barrera cerebro-meningeal, lo que permite una recombinación específica de células leptomeningeales, sin etiquetado de la población subyacente Cx30+ astroglial (ver Resultados Representativos).
La técnica presentada aquí tiene como objetivo inyectar manual y segura mente el compuesto en el líquido cefalorraquídeo, a través del acceso directo a la cisterna magna. A diferencia de otros procedimientos más invasivos que requieren craneotomía, este enfoque permite infundir compuestos sin causar daño al cráneo o al parénquima cerebral. Por lo tanto, no se asocia con la inducción de reacciones inflamatorias desencadenadas por la activación de células de la glia parenquimal. Similar a otras estrategias de inyección descritas antesde 8,9,10, el enfoque actual se basa en la exposición quirúrgica de la membrana dural atlanto-occipital que cubre la cisterna magna, después de la disección contundente de los músculos del cuello superpuestos. Sin embargo, a diferencia de otros procedimientos, recomendamos el uso de una aguja doblada en la punta, que se puede estabilizar contra el hueso occipital durante la administración. Esto evitará el riesgo de que la aguja penetre demasiado profundo y dañe el cerebelo subyacente y la médula.
Este procedimiento quirúrgico es compatible con las investigaciones de rastreo de linaje que apuntan a mapear los cambios en las identidades celulares y las rutas de migración a través de capas parénquimas. También se puede adaptar a estudios de ablación genética que pretenden investigar el papel de las células leptomeningeales en la salud y la enfermedad, como su contribución al desarrollo cortical5 o la propagación de la meningitis bacteriana3,11. Finalmente, se puede utilizar para rastrear el movimiento del líquido cefalorraquídeo cuando se combina con la entrega de marcadores fluorescentes en animales de tipo salvaje.

<table><tbody><tr><td>Unidad de anestesia</td><td>Univentor 410</td><td>8323102</td><td>Completo de vaporizador, cámara y tubo que se conecta a la cámara y al soporte de la cabeza del ratón</td></tr><tr><td>Anestesia (Isoflurano)</td><td>Baxter Medical AB</td><td>000890</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Orion Pharma AB</td><td>014920</td><td>Nombre comercial Rymadil</td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>Carl Roth</td><td>0258.1</td><td>Utilice suturas de seda 5-0, en alternativa</td></tr><tr><td>Medbond Tissue Glue</td><td>Stoelting</td><td>50479</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Endoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8284</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Histolab</td><td>01370</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton (aguja biselada de 30 G)</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Aspen Nordic</td><td>520455</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para cabeza de ratón</td><td>Narishige International</td><td>SGM-4</td><td>Con boquilla para anhestetica inhalatoria. Alternativamente, use un marco estereotáctico</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Afeitadora</td><td>Aesculap</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Lanzas de absorción estériles Fine</td><td>Science Tools</td><td>18105-01</td><td>Los bastoncillos de algodón estériles también son una buena opción</td></tr><tr><td>Separador quirúrgico</td><td>World Precision Instrument</td><td>Pinzas 501897</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Bausch& Lomb Nordic AB</td><td>541760</td><td></td></tr></tbody></table>

inducción de células leptomeningeales modificación a través de inyección intraciternal

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

El protocolo descrito aquí describe cómo inyectar soluciones de forma segura e manual a través de la cisterna magna, al tiempo que se elimina el riesgo de daño al parénquima subyacente. Los protocolos publicados anteriormente recomiendan el uso de agujas rectas que deben reducirse a un máximo de 1-2 mm de la superficie dura. La caída repentina de la resistencia una vez perforada la membrana dura hace que sea difícil mantener la aguja en una posición estable. Nuestro método, en cambio, emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar contra el hueso occipital del cráneo, evitando así que la jeringa penetre en el tejido después de la perforación de la membrana dural. El procedimiento es sencillo, reproducible y no causa molestias duraderas en los animales operados. Describimos la estrategia de inyección intracisternal en el contexto de la cartografía genética del destino de las células leptomeningeales vasculares. La misma técnica puede, además, utilizarse para abordar una amplia gama de cuestiones de investigación, como el sondeo del papel de los leptomeninges en el neurodesarrollo y la propagación de la meningitis bacteriana, a través de la ablación genética de genes implicados putativamente en estos fenómenos. Además, el procedimiento se puede combinar con un sistema de perfusión automatizado para un parto constante y se utiliza para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo a través de la inyección de moléculas etiquetadas fluorescentesmente.

La inyección intracisternal de endoxifeno en ratones transgénicos que expresaN CreER bajo el promotor Cx3013 y un reportero fluorescente inducible permite una recombinación específica de células leptomeningeales sin etiquetar la superficie vecina de expresión Cx30 y los astrocitos parénquimas en la corteza(Figura 1). Con el fin de acceder a la cisterna magna, el animal anestesiado se coloca con su cuerpo y su cabeza en un ángulo de apr...

Describimos una inyección intracisternal que emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar en el cráneo, eliminando así el riesgo de daño al parénquima subyacente. El enfoque se puede utilizar para la cartografía genética del destino y manipulaciones de células leptomeningeales y para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo.

Inducción de células leptomeningeales Modificación a través de inyección intraciternal

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

Nuestro procedimiento quirúrgico permite la edición genética específica de las células leptomeningeales para estudiar su función en muchas condiciones fisiológicas y patológicas como el neurodesarrollo y la propagación de la meningitis bacteriana. Para minimizar el daño durante la entrega intracisternal de endoxifeno, utilizamos una aguja doblada que se puede asegurar contra el borde caudal del cráneo para evitar que penetre más profundamente en el tejido. El procedimiento se puede utilizar para sondear el papel de los genes que expresan las células leptomeningeales a través de la pérdida y ganancia de experimentos de función.También se puede adoptar para rastrear el flujo de líquido cefalorraquídeo. La demostración visual de este método garantizará la identificación exitosa del lugar de inyección para la inyección intracisterna y la comprensión de cómo fijar la aguja contra el hueso occipital. Comience preparando una jeringa Hamilton con una aguja biselada de calibre 30 para inyección.Utilice fórceps para doblar la aguja a 30 grados tres milímetros de la punta. A continuación, diluir el endoxifeno en 10%DMSO a una concentración de un miligramo por mililitro y rellenar la jeringa. Anesthetizar al animal en la cámara de isoflurano.A continuación, ajuste el soporte de la cabeza del ratón para que la boquilla esté aproximadamente en un ángulo de 30 grados desde la superficie de la mesa quirúrgica y fije la cabeza del animal en el soporte. Para mejorar la accesibilidad a la cisterna magna, posiciona el cuerpo del animal a unos 30 grados desde la superficie de la mesa con la cabeza inclinada hacia abajo que establecerá un ángulo de 120 grados con el resto del cuerpo y extenderá la parte posterior del cuello para facilitar el acceso a la cisterna magna. Una vez que el animal esté correctamente posicionado, aplicar pomada oftálmica, afeitarse la parte posterior de su cuello y desinfectar la zona con toallitas de alcohol y Betadine.Utilice tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de línea media comenzando a nivel del hueso occipital y extendiéndose posteriormente. Separe suavemente el tejido conectivo superficial y los músculos del cuello tirando hacia los lados de la mitad con pinzas de punta fina que expondrán la membrana dural que sobrevuela la cisterna magna. Coloque un pequeño separador quirúrgico para permitir la visualización de las cisternas magna a lo largo del procedimiento.Identifique el extremo caudal del hueso occipital e inserte la aguja previamente doblada inmediatamente debajo. Una vez perforada la dura, deje que la punta doblada de la aguja penetre debajo de la superficie tirando suavemente de la jeringa hacia arriba y paralela al cuerpo del animal, lo que asegurará una mejor estabilidad. Inyecte el compuesto lentamente para evitar interferencias con el flujo natural del líquido cefalorraquídeo.Después de la inyección, deje reposar la aguja dentro durante un minuto y, a continuación, retírela cuidadosamente con la ayuda de fórceps de punta fina. Cierre la piel con unas gotas de adhesivo de cianoacrilato y aplique anestesia local en el lugar de la inyección. Retire el animal del soporte y colóquelo en una jaula limpia sobre una almohadilla calefactora.Luego asegúrese de monitorear al animal hasta que recupere la conciencia. La inyección intracisterna de endoxifeno en ratones transgénicos que expresa CreER bajo el promotor Cx30, un reportero fluorescente inducible permite la recombinación específica de células leptomeningeales sin etiquetar a los vecinos Cx30 que expresan astrocitos superficiales y astrocitos parénquimales en la corteza. Este protocolo de inyección aprovecha el movimiento fisiológico del líquido cefalorraquídeo para que la solución de endoxifeno se distribuya por todo el espacio subaracnoideo para recombinar eficientemente las células leptomeningeales superponiendo las bombillas olfativas, la corteza y el cerebelo.La solución no cruza la barrera meningeal cerebral ni entra en contacto con células astrogliales del parénquima en comparación con la administración sistémica a través de la gavage oral. La recombinación de células leptomeningeales después de la inyección intracisternal se identificó a través de la reactividad de Pdgfr-alfa, mientras que los astrocitos superficiales y parenquimales que expresaban Gfap permanecieron sin etiquetar. Al intentar este experimento, es importante localizar el lugar de inyección para la administración intracisternal.Esta demostración visual proporciona el conocimiento técnico para llevar a cabo el procedimiento mientras minimiza el riesgo de dañar el tejido neural debajo de él. Los estudios de ablación génica se pueden realizar con esta técnica para investigar el papel de las células leptomeningeales en la corticogénesis y la regulación de la formación de líquido cefalorraquídeo y para identificar sitios adicionales para la propagación de bacterias en el espacio subaracnoideo.

induction-leptomeningeal-cells-modification-via-intracisternal

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Zamboni, M., et al., Inducción de la modificación de las células leptomeníngeas mediante inyección intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el procedimiento de administración de un fármaco inductor en la cisterna magna de un ratón anestesiado. La inyección induce selectivamente la expresión de marcadores fluorescentes en las células de la superficie cerebral accesibles a través del líquido cefalorraquídeo, confirmado por imágenes de fluorescencia.

Administración dirigida de fármacos en un modelo de ratón mediante inyección de cisterna magna

En este video, describimos el procedimiento para introducir células tumorales de origen humano en la cisterna magna del cerebro de un ratón. El modelo ortotópico de ratón se puede utilizar para estudiar la diseminación metastásica del cáncer a las meninges craneales.

Inyección quirúrgica de cisterna magna: un método para administrar células tumorales directamente en el sistema nervioso central de un modelo murino

En este video, demostramos la administración intracisternal de Neisseria meningitidis en un modelo de ratón para generar infección por meningitis.

Administración intracisternal de meningococos en modelos de ratón para inducir meningitis meningocócica

El video muestra un método para generar un modelo de rata con desmielinización cortical cerebral generalizada. Esto implica la interrupción de la barrera hematoencefálica mediante la inyección de citoquinas proinflamatorias en ratones preparados con proteína de vaina de mielina recombinante. Este proceso facilita la infiltración de células inmunitarias, lo que da lugar a una desmielinización cortical cerebral generalizada.

Generación de la desmielinización cortical cerebral generalizada en un modelo de rata

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

El protocolo presentado aquí permite la reproducción de una desmielinización generalizada de la materia gris de ambos hemisferios corticales en ratas agouti oscuras macho adultas. El método consiste en la implantación intracerebral de un catéter, la inmunización subclínica contra la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina y la inyección intracerebral de una mezcla de citoquinas proinflamatorias a través del catéter implantado.

Modelo de rata de desmielinización cortical cerebral generalizada inducida por una inyección intracerebral de citoquinas proinflamatorias

Aquí, describimos un método para inducir la meningitis meningocócica a través de una vía intracisternal de infección en ratones adultos. Presentamos un protocolo paso a paso de la infección meningocócica desde la preparación del inóculo hasta la infección intracisternal; luego registrar la supervivencia animal y evaluar las cargas bacterianas en los tejidos murinos.

Inducir meningitis meningocócica Serogrupo C en ratones a través de parto intracisternal

Aquí, describimos un modelo de xenoinjerto murino que se asemeja funcionalmente a un reservorio de Ommaya en pacientes. Desarrollamos el Ommaya murino para estudiar nuevas terapias para la enfermedad leptomeningeal universalmente fatal.

Un modelo de xenoinjerto murino de Ommaya para estudiar la terapia dirigida directamente de la enfermedad leptomeningeal

El presente protocolo describe las instrucciones paso a paso para realizar inyecciones intratecales en ratones neonatos para la edición de genes y la administración de fármacos.

Inyección intratecal de ratón recién nacido para la edición del genoma y la administración de fármacos

El protocolo describe un método para inyectar células tumorales a través de la vía de punción percutánea en la cisterna magna que induce de forma robusta la metástasis leptomeníngea en ratones, reduciendo el trauma y la carga tumoral extracraneal.

Modelo de inyección mínimamente invasiva de cisterna magna para estudios de metástasis leptomeníngeas en ratones

Aquí se presenta un protocolo para evaluar los vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de ratón, que desempeñan un papel importante en múltiples enfermedades neurológicas. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método integrado que permita tanto la evaluación funcional del drenaje de trazadores como la caracterización morfológica detallada de la red de MLVs dorsales.

Protocolo integrado para la evaluación de linfáticos meníngeos: inyección de cisterna magna, imagen de ganglios linfáticos, disección meníngea y tinción de montaje completo

Aprende una técnica de inyección intraciternal con aguja curvada para editar genes en células leptomeníngeas de ratones transgénicos. Este método minimiza daño tisular y permite rastrear el flujo de líquido cefalorraquídeo en estudios neurobiológicos.

Inducción de células leptomeningeales Modificación a través de inyección intraciternal

Explorar más videos