Seguimiento de piernas totalmente automatizado en insectos en movimiento libre mediante la segmentación y el seguimiento de las piernas de aprendizaje de funciones (FLLIT)

FLLIT es un algoritmo que calcula las composiciones del cuerpo y las piernas de un animal rastreado. Y esto es útil para caracterizar los circuitos que subyacen tanto a los comportamientos normales como a los que caminan por enfermedades. Lo único de FLLIT es que no requiere ningún conjunto de datos anotado por el usuario para el entrenamiento y, por lo tanto, está totalmente automatizado.

Pero también analiza automáticamente los datos de la pista produciendo una serie de mediciones de marcha, gráficas de marcha para la visualización y un video de pista. Demostrando el procedimiento estará Animesh Banerjee, un colega postdoctor de mi laboratorio. Antes de comenzar un experimento, confirme que la estación de grabación tiene una cámara de alta velocidad con un escenario sobre ella para sostener la cámara de la arena.

Coloque luces LED infrarrojas en la parte superior del escenario con un difusor entre la cámara y la muestra. Unos 40 minutos antes de comenzar la grabación, transfiera las moscas a un vil vacío en hielo durante cinco a siete minutos. Mientras las moscas están siendo sedadas, use agua y una toallita para limpiar la arena y los toboganes de vidrio de la cámara y pegue uno de los portaobjetos de vidrio debajo de la cámara.

Con un cepillo limpio, transfiera una mosca anestesiada a la cámara y asegure la cámara con una segunda diapositiva y cinta adhesiva. A continuación, deje que la mosca con cámara se aclimate a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Para generar vídeos para el análisis FLLIT, primero, encienda la fuente de alimentación y abra la aplicación de visor en el sistema informático conectado.

Cambie la velocidad de fotogramas de grabación a 1.000 fotogramas por segundo y establezca la velocidad del obturador en un milisegundo. Coloque la cámara con la mosca en la arena de grabación y haga clic en el botón LIVE. Confirmado que la cámara está enfocada en las puntas de las piernas cuando la mosca camina erguida en el suelo de la cámara y haga clic en Grabar.

Durante la grabación, asegúrese de que la mosca camina en una trayectoria relativamente recta sin tocar el borde de la arena, camina al menos tres pasos por pierna, no se detiene durante el paseo, y que la distancia recorrida es el equivalente de al menos una longitud corporal y media. Al final del análisis, haga clic en Grabar listo para detener la grabación y guardar los archivos en formato mraw o tiff en las carpetas adecuadas. Para instalar FLLIT, primero descargue el programa en cualquier sistema operativo.

Extraiga el contenido del archivo zip y descargue conjuntos de datos de ejemplo. Para instalar FLLIT en Ubuntu, vaya al directorio FLLIT/Compiled y haga clic con el botón derecho para seleccionar Abrir en Terminal. Descargue un conjunto de datos de ejemplo y cree una carpeta de datos en FLLIT-master/Compiled en el que se colocarán las carpetas del conjunto de datos.

Instale las bibliotecas en tiempo de ejecución de MATLAB en HOME/MCR. Cuando se haya completado la instalación de la biblioteca en tiempo de ejecución de MATLAB, ejecute el comando para asegurarse de que los derechos ejecutables se registran en FLLIT. A continuación, escriba el comando para ejecutar FLLIT.

Para la segmentación del vídeo, convierta el archivo en archivos TIFF individuales y guarde los archivos convertidos en la carpeta de datos FLLIT. Cuando se hayan transferido todos los archivos, ejecute FLLIT. En la ventana emergente, seleccione 0 para llevar a cabo la segmentación de la pierna solamente o seleccione 1 para incluir el seguimiento de tramos con la segmentación de piernas.

Seleccione la carpeta que contiene las imágenes TIFF fotograma a fotograma del vídeo que se va a seguir y el archivo de interés y haga clic en Agregar. A continuación, haga clic en Listo para iniciar la segmentación y el seguimiento del vídeo seleccionado. Para comprobar la precisión del seguimiento y realizar correcciones de errores, haga clic en Seleccionar carpeta de datos y, a continuación, seleccione la carpeta a la que se va a realizar el seguimiento.

Haga clic en Ver seguimiento y compruebe el etiquetado de todas las patas del primer fotograma. Si un tramo está etiquetado incorrectamente y se requiere una corrección, haga clic en Pausar visualización y ajustar la predicción. En el panel Pierna para ajustar, seleccione la pierna que requiere corrección y haga doble clic en la posición correcta de esta pierna en la ventana de la imagen.

A continuación, haga clic en Guardar y salir. Para procesar los datos segmentados y de seguimiento, haga clic en Proceso de datos. En primer lugar, calcule el campo de visión real del vídeo capturado para que se puedan medir los parámetros de la puerta.

En la ventana emergente introduzca el número de fotogramas por segundo en el que se graba el vídeo e introduzca el campo de visión calculado en milímetros. Para acceder a los resultados de seguimiento, abra las carpetas de resultados y seguimiento. Para generar un vídeo de la mosca rastreada, seleccione Crear vídeo.

Después de la segmentación de las piernas, el seguimiento y el procesamiento de datos, FLLIT genera automáticamente datos sin procesar para las posiciones del cuerpo, y cada garra de pierna, 20 parámetros de marcha y gráficas adjuntas, y vídeos rastreados. SCA3 se caracteriza por una marcha ataxica con vencedor corporal, colocación errática del pie y pasos cortos que se abalncean. Para caracterizar la marcha de las moscas mutantes SCA3 e investigar si muestran una marcha similar a la de los pacientes humanos, se pueden analizar los parámetros de marcha relevantes generados por FLLIT.

Las moscas SCA3-Q84 exhiben más giros, colocación errática del pie como lo demuestra una baja regularidad de la huella, y una mayor superposición de dominio de pierna, dominios de piernas ampliados en longitud y área, y disminución de la longitud de zancada. FLLIT también puede generar un video que muestre la mosca y las piernas rastreadas en las vistas centradas en la arena y centradas en el cuerpo, la trayectoria del cuerpo, la dirección de rumbo y los desplazamientos verticales y laterales de cada pierna. En comparación con las moscas SCA3-Q27, las moscas SCA3-Q84 exhiben dominios irregulares de piernas intersecantes de diferentes tamaños, indicativos de una marcha ataxica.

Los datos sin procesar para las posiciones de la garra del cuerpo y de la pierna se pueden analizar más a fondo para movimientos específicos de interés. Por ejemplo, el uso de FLLIT permitió a nuestro grupo determinar que los fenotipos rígidos mostrados por los modelos Drosophila de la enfermedad de Parkinson son causados por la disfunción de la neurona dopaminérgica.