Fenotipado de tensión de levadura de alto rendimiento con secuenciación de ARN basada en gotas
21 de mayo de 2020
Un cuello de botella en el ciclo de ingeniería microbiana en el ciclo de "diseño-construcción-prueba" es la velocidad a la que podemos realizar pantallas funcionales de cepas. Describimos un método de alto rendimiento para el cribado de deformación unitaria aplicado a cientos a miles de células de levadura por experimento que utiliza la secuenciación de ARN basada en gotas.
ICO, o ICO-seq es la primera adaptación de la secuenciación de ARN de alto rendimiento a los microbios. Este método evaluó la función microbiana a una escala de todo el genoma. Para los microbios diseñados, este método puede dilucidar cómo los cambios en el genoma microbiano pueden perturbar sus funciones.
Obtener levadura de un cultivo de suspensión, y contar las células utilizando un hemociclomekil. Re-suspenda las células en PBS a una concentración de aproximadamente 750.000 células por mililitro. A continuación, mezclar el punto de fusión ultrabaso en PBS, y calentar la mezcla a 90 grados Celsius, hasta que la agarosa se derrita.
Cargue la mezcla de agarosa en una jeringa, con un filtro de 0,22 micras adjunto. Coloque una bomba de jeringa delante de un calentador de espacio establecido en 80 grados Celsius y coloque la jeringa en la bomba. Llene una segunda jeringa con la suspensión de levadura y llene una tercera jeringa con aceite fluorado, con fluorosurfactante 2%iónico.
Cargue ambas jeringas en las bombas de jeringa. Conecte el tubo de las jeringas al dispositivo A.Coloque un tubo cónico de 15 mililitros en un cubo de hielo y guíe el tubo de salida hacia el tubo cónico. Ajuste el caudal de cada jeringa y recoja aproximadamente un mililitro de emulsión en el tubo cónico de 15 mililitros.
Después de esperar cinco minutos para que la agarosa en el tubo se ajuste, añadir un volumen igual de 20%perfluoro-octanol en aceite fluorado a la emulsión. Mezclar la emulsión y el perfluoro-octanol invirtiendo el tubo cónico unas cuantas veces. Centrifugar la emulsión rota a 2.000 veces G durante dos minutos.
Asegúrese de que los hidrogeles se hayan peletó por encima de las fases de aceite y PFO. Retire las fases de aceite y PFO. Añadir dos mililitros de tet(W)buffer para volver a suspender los hidrogeles.
Transfiera la suspensión a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo de nuevo a 2.000 veces G durante dos minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los hidrogeles en tet(W) de nuevo.
Después de girar los hidrogeles a 2.000 veces G durante dos minutos, vuelva a suspender los hidrogeles en dos mililitros de medio de cultivo de levadura. Incubar el tubo durante la noche a 30 grados centígrados, con temblor. Cada cepa crece a diferentes velocidades.
La elección de un medio adecuado y el tiempo de incubación es esencial para asegurar que la levadura crezca dentro del hidrogel, pero no crezca en exceso, lo que lleva a que las células escapen a los medios. Primero, transfiera los hidrogeles a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 2.000 veces G durante dos minutos.
Lavar los hidrogeles dos veces con PBS y luego una vez en el tampón de esferoplastado. Realizar una dilución 40x de enzima esferoplastante en tampón de esferoplastia. A continuación, agregue un mililitro de la enzima diluida a los hidrogeles.
Incubar el tubo de hidrogeles a 37 grados centígrados durante una hora. La levadura tratada se verá más transparente. Del tubo que contiene la suspensión del hidrogel, retire 0,8 mililitros de la suspensión de la parte inferior del tubo y transfiéralo a una jeringa sin tapar de un mililitro.
Coloque la jeringa en el soporte de la jeringa impresa en 3D. Centrifugar la jeringa y el soporte a 2.000 veces G durante dos minutos. Antes de continuar, asegúrese de que los hidrogeles estén apretados en la parte inferior de la jeringa.
Coloque 240.000 cuentas drop-seq en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 1.000 veces G durante un minuto. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en dos mililitros de 0,9x tampón de lisis de levadura, con cloruro de sodio de 500 milimolar.
Inserte una barra de agitación y transfiera la suspensión del cordón a una jeringa de tres mililitros. Prepare otra jeringa, que contenga varios mililitros de surfactante PFPE-PEG en aceite fluorado. Obtener la jeringa previamente preparada de hidrogeles envasados en clones de levadura.
Evacúe el cabezal de aquiescencia y acarree la jeringa. Inserte las tres jeringas, los hidrogeles, la suspensión del cordón y el aceite en las bombas de jeringa. Conecte las jeringas a través del tubo al dispositivo B, el dispositivo de encapsulación.
Coloque el extremo del tubo de salida en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Ajuste el caudal de cada jeringa. Recoger aproximadamente 1.000 mililitros de emulsión, o ejecutar el dispositivo hasta que no queden hidrogeles.
A continuación, siga el protocolo drop-seq para la síntesis de ADNc, la preparación de la biblioteca y la secuenciación. Usando un dispositivo microfluídico, las células de levadura se encapsularon en gotas de 160 micrómetros. Un divisor de ocho veces dividió estas gotas en ocho gotas de 60 micrómetros.
La incubación nocturna dio lugar a colonias de levadura isogénicas que crecen dentro de algunos de los hidrogeles. Antes de cargar los hidrogeles de levadura en el segundo dispositivo microfluídico, fueron lavados y sumergidos en una solución para digerir las paredes celulares. La digestión adecuada fue verificada por microscopía, con células de levadura tratadas con una morfología más reflexiva.
Una corriente de perlas de captura de ARNm en el tampón de lelisis se mezcló con una corriente de hidrogeles de levadura de paquete cercano antes de la unión de fabricación de gotas del segundo dispositivo microfluídico. En la emulsión resultante, alrededor del 10% de las gotas recogidas contenían un cordón con una colonia de lesed. Este flujo de trabajo de secuenciación de colonias isogénicos se utilizó para analizar la respuesta de conmutación opaca blanca de C.albicans.
El componente principal, el PC, el análisis y una reducción de la dimensionalidad tSNE indicaron la concordancia general entre el conjunto de datos de muestra y un conjunto de datos de referencia. El análisis TSNE reveló tres grupos de células. Mientras que el clúster dos estaba compuesto predominantemente de celdas del conjunto de datos de muestra, los clústeres cero y uno estaban compuestos de celdas de ambas muestras.
La superposición de la expresión WH11 en el tSNE indicaba que el clúster probablemente contenía colonias blancas. La expresión STF2 aumentó en el clúster uno, de acuerdo con los datos obtenidos anteriormente. En los clústeres cero y dos, WH11 y STF2 fueron significativamente regulados hacia abajo en comparación con el clúster uno.
Los microbios de andrógenos tienen un potencial cada vez mayor para producir en masa productos biológicos para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades. Siguiendo este procedimiento, se puede aplicar una variedad de herramientas bioinformáticas para analizar más a fondo los datos de secuenciación.
Descripción general
Este estudio presenta un método de alto rendimiento para la selección de cepas en ingeniería microbiana, utilizando específicamente la secuenciación de ARN basada en gotas para analizar células de levadura. El método permite evaluaciones funcionales de microorganismos modificados a escala genómica completa.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería Microbiana
- Selección de Alta Capacidad
- Secuenciación de ARN
Antecedentes
- La selección funcional de cepas microbianas suele ser lenta e ineficiente.
- Los métodos de alto rendimiento pueden aumentar significativamente la velocidad de estas evaluaciones.
- La secuenciación de ARN basada en gotas ofrece un enfoque novedoso para evaluar funciones microbianas.
- Comprender las perturbaciones del genoma puede orientar estrategias de ingeniería microbiana.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de cribado rápido para cepas de levaduras mediante la secuenciación de ARN.
- Elucidar los impactos funcionales de los cambios genómicos en microorganismos modificados.
- Mejorar la eficiencia del ciclo diseño-construcción-prueba en la ingeniería microbiana.
Métodos Utilizados
- Las células de levadura se cultivaron y prepararon en una concentración específica.
- Se empleó microfluídica basada en gotas para encapsular las células de levadura.
- Se realizó secuenciación de ARN en las células encapsuladas para evaluar la expresión génica.
- Se aplicaron herramientas bioinformáticas para analizar los datos de secuenciación.
Resultados principales
- El método encapsuló con éxito células de levadura en gotas para análisis de alto rendimiento.
- Se generaron colonias isogénicas y se analizaron sus patrones de expresión génica.
- El análisis de componentes principales reveló grupos distintos de expresión génica.
- Los hallazgos indicaron diferencias significativas en la expresión génica relacionadas con la morfología de las colonias.
Conclusiones
- Este método de alto rendimiento mejora la capacidad de seleccionar cepas microbianas de forma eficiente.
- Los conocimientos obtenidos pueden orientar la futura ingeniería de microorganismos para aplicaciones biotecnológicas.
- El enfoque es aplicable a diversas especies microbianas más allá de la levadura.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El cribado de cepas de alto rendimiento sigue siendo un cuello de botella en la ingeniería microbiana a pesar de los avances en la edición del genoma. Este método de secuenciación de ARN basado en gotas permite la evaluación funcional a escala genómica de cepas de levadura modificadas, abordando directamente el equilibrio entre la producción de información y el rendimiento. Al proporcionar inferencias fenotípicas a partir de perfiles transcriptómicos, apoya la confianza predictiva en la selección de cepas y acelera el ciclo diseño-construcción-prueba para la producción de biológicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de modificaciones genómicas con fenotipos funcionales a través de lecturas a escala del transcriptoma.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante perfiles cuantitativos de expresión génica que aclaran los impactos a nivel de vías de las ediciones genéticas.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar cepas con firmas de expresión deseadas asociadas a vías diana, reduciendo la dependencia de ensayos de bajo rendimiento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera colonias isogénicas de levadura encapsuladas en gotas estandarizadas, adecuadas para cribado fenotípico reproducible basado en RNA-seq.
- Escalabilidad: Procesa miles de cepas genéticamente distintas en paralelo, superando las limitaciones de los métodos tradicionales de selección de colonias y basados en matrices.
- Calidad de los datos: Produce mediciones cuantitativas y multiplexadas de la expresión génica que permiten comparaciones robustas entre bibliotecas de cepas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Aplicado al cambio blanco-opaco de Candida albicans, un fenotipo relacionado con la virulencia, lo que demuestra su utilidad en la caracterización de cepas patógenas.
- Continuidad traslacional: Vincula modificaciones genéticas con resultados fenotípicos mediante biomarcadores de expresión (por ejemplo, WH11, STF2), apoyando la selección de cepas alineada con biomarcadores.
- Reducción de riesgos preclínicos: Permite la identificación temprana de cepas no funcionales o aberrantes, reduciendo el riesgo de fracaso en desarrollos posteriores.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de ingeniería de cepas microbianas desde la construcción de bibliotecas hasta la validación funcional, permitiendo la priorización de cepas guiada por el transcriptoma antes de la identificación del candidato principal.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al revelar cómo las perturbaciones genómicas afectan la expresión génica global en contextos isogénicos.
- Selección: Ofrece sistemas microbianos estandarizados y listos para ensayos, con resultados transcriptómicos reproducibles para pruebas de respuesta a compuestos o condiciones.
- Análisis: Proporciona agrupamientos de expresión derivados de PCA y tSNE, así como superposiciones de genes marcadores que permiten la clasificación fenotípica y la comparación de cepas.
- Investigación Traducional: Conecta los genotipos de las cepas con estados fenotípicos mediante marcadores conservados, apoyando la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la selección de bibliotecas de cepas de levadura y otros microorganismos en múltiples proyectos y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en las relaciones entre cepas y funciones al reducir la ambigüedad mecanicista mediante datos de expresión a escala genómica.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante la encapsulación microfluídica y el crecimiento controlado de colonias basado en hidrogeles.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción y la asignación de capital al permitir la evaluación rápida de cepas con múltiples parámetros.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al identificar cepas con perfiles moleculares indicativos de fenotipos deseados en las primeras etapas del desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microfluídica, genética de levaduras y preparación de bibliotecas de secuenciación de ARN a nivel de célula individual.
- Depende del acceso a dispositivos de generación de gotas, aceites fluorados, surfactantes y a infraestructura de secuenciación y bioinformática posterior.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación de hidrogeles, esferoplastia y acoplamiento a perlas para obtener resultados consistentes.
- Implica la optimización del tiempo de incubación y del medio para prevenir el crecimiento excesivo del hidrogel y la fuga celular, lo cual depende de la cepa.
- Está limitado por la necesidad de biomarcadores transcripcionales con asociaciones fenotípicas conocidas que permitan inferir con precisión el fenotipo a partir de datos de ARN-seq.
